解淀粉芽孢杆菌JSSW—LA的分离鉴定及对病原菌拮抗特性.doc

解淀粉芽孢杆菌JSSWLA的别离鉴定及对病原菌拮抗特性【摘要】：p 】：为了挑选1株对水产病原菌具有拮抗作用的菌株，对菌株JSSW-LA进展生理生化鉴定、16S rDNA序列测定及系统发育树的构建，采用体外抑菌试验、共培养试验考察菌株JSSW-LA对多种水产病原菌的拮抗作用。经鉴定说明，菌株JSSW-LA为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，JSSW-LA对嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila、维氏气单胞菌Aeromonas veronii、温和气单胞菌Aeromonas sobria、爱德华氏菌Edwardsiella、豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae具有一定的抑制作用，其中对温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌抑制效果显着。共培养结果显示，低起始浓度的JSSW-LA2.8×103 CFU/mL可以显着抑制温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌生长，高起始浓度的JSSW-L(原文来自：wWW.bDFqy. 千叶 帆文摘:解淀粉芽孢杆菌JSSWLA的别离鉴定及对病原菌拮抗特性)A2.8×106 CFU/mL对5种致病菌均具有一定的抑制作用。结果说明，解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA对水产中的常见致病菌具有较好的抑制作用，是1株拮抗性能优良的微生物菌株，在水产养殖中具有广阔的应用前景。【关键词】：p 】：解淀粉芽孢杆菌；别离；鉴定；病原菌；拮抗中图分类号： S182文献标志码： A文章编号：1002-130220_04-0275-04近年来，随着高密度集约化养殖规模日益扩大，过度进步养殖高密度和过量投饵的养殖方式使养殖动物排泄物、腐烂的残饵及其他生物残体大量沉积，氮、磷等富营养因子排入水体，加重了养殖自身污染，使有害藻类及病菌大量繁殖，养殖水体生态环境日益恶化，并且极大地增加了水产动物之间病原体穿插感染的时机。为此，各类鱼病多发，甚至造成水产动物大面积的死亡，这不仅降低了水产品的质量，而且给水产养殖业造成了严重的经济损失。传统鱼病防治方法是施用药物，但是此方法容易产生药物残留、耐药性进步等缺点；并且疫苗因针对性强、操作不便等原因，无法大规模使用；抗生素使用不当也容易导致养殖水产品产生耐药性，污染环境，所以限制其使用。益生素prodiotics是近年来国内外迅速崛起的一类微生态制剂，因其具有调节宿主肠道菌群平衡、进步机体安康程度、防止服用抗生素带来的耐药性和二重感染等问题的优点，广泛地应用于医疗、保健、食品、畜牧和水产等行业1。芽孢杆菌是最早应用于水产养殖中的益生菌，具有稳定性高、耐加工、易保存等优点；同时，芽孢杆菌被证明具有抗菌活性，可以产生细菌素抗菌肽，可以进步水生动物对养殖环境的适应才能和抗病才能，其平安、有效的优点可逐步替代抗生素的使用2。本研究从池塘底泥中别离得到1株编号为JSSW-LA的菌株，通过主要理化特性鉴定、16S rDNA序列测定结果及系统发育树的构建说明，该菌株为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。本研究采用体外抑菌试验考察解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA 对水产常见病原菌的抑制作用，同时利用共培养试验法考察不同浓度的解淀粉芽孢杆菌对病原菌的拮抗作用。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 菌株来 JSSW-LA菌株别离挑选自无锡市鹅湖青鱼池塘底泥。温和气单胞菌Aeromonas sobria、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila、豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae、维氏气单胞菌Aeromonas veronii、副溶血性弧菌Vibrio Parahemolyticus、爱德华氏菌Edwardsiella、鳗利斯顿氏菌Listonella anguillarum、大肠杆菌Escherichia coli、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心鱼病研究室提供。1.1.2 培养基 别离挑选用培养基组成为：10 g/L麸皮，10 g/L 玉米浆干粉，5 g/L NaCl，pH值7.0。根底培养基为BPY培养基3，组成为：5 g/L葡萄糖，1 g/L蛋白胨，5 g/L牛肉膏，5 g/L NaCl，pH值7.0。1.1.3 仪器与试剂 PCR仪：Eppendorf Mastercycler gradient；凝胶成像系统：Molecular lmager ChemiDocTM _RST；移液器：Thermo Finnpipette；低温离心机：eppendorf Centrifuge 5810R；电泳仪；高压灭菌锅、电子天平、超净工作台、振荡培养箱、生化培养箱等均为国产品牌。细菌生化反响管，购自广东环凯微生物科技；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自生工生物工程上海股份；PCR扩增试剂盒，购自大连宝生物工程；goldview染料，购自上海赛百盛基因技术；葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、NaCl等，购自国药集团化学试剂；麸皮、玉米浆干粉，市售。1.2 试验方法1.2.1 细菌菌株的别离纯化 样品采集于无锡鹅湖青鱼池塘，称取10 g池塘底泥置于装有90 mL无菌水及少量玻璃珠的250 mL三角瓶中，振荡30 min，静置；取上清，接种于别离培养基中，37 培养7 d。每个样品汲取1.0 mL，于80 加热10 min，用移液枪汲取0.1 mL于根底培养基上，涂布，37 培养。挑取单菌反复划线纯化3次，待长出菌落后，随机挑选菌落并纯化、编号、保存。1.2.2 挑选菌株的鉴定1.2.2.1 生理生化鉴定 参照伯杰氏细菌鉴定手册4、常见细菌系统鉴定手册5，挑取待检菌落进展革兰氏染色镜检，将0.85%生理盐水稀释至约109 CFU/mL的菌悬液接入细菌鉴定生化管，置于37 培养，按照说明书观察结果。第 6 页 共 6 页