原药材质量标准分析方法验证hnni.docx

药材质量量标准方方法建立立1仪器器与材料料UV116011紫外可见分分光光度度计(日日本岛津津)AB2004-NN电子天天平 (万分之之一天平平，MEETTLLER TOLLEDOO)BP2111D电电子天平平 （十十万分之之一天平平，Saarlooriuus）葡萄糖(分析纯纯，天津津市化学学试剂一一厂)苯酚(分分析纯，天天津市化化学试剂剂一厂)蒽酮 分析析纯，国国药集团团化学试试剂有限限公司）硫酸(分分析纯，天天津市凯凯信化学学试剂有有限公司司)当归药材材购于甘肃岷岷县，经经天津药药物研究究院中药药现代研研究部张张铁军研研究员鉴鉴定为伞伞形科植植物当归归Anggeliica sinnenssis(Oliiv)DDiells的干干燥根，经经检测符符合中中华人民民共和国国药典（2010版）一部的有关规定。黄芪药材材购于甘肃肃岷县，经经天津药药物研究究院中药药现代研研究部张张铁军研研究员鉴鉴定为蒙蒙古黄芪芪Astrragaaluss meembrranaaceuus(FFiscch)BBgeVarrmoonghholiicuss(Bgge.)Hsiiao的的干燥根根，经检测测符合中中华人民民共和国国药典（2010版）一部的有关规定。2方法法与结果果2.1药药材中多多糖含量量测定方方法本试验采采用比色色法对药材材中的多多糖含量量进行测测定，并并建立了了含量测测定方法法。2.1.1对照品品溶液的的制备精密称取取1055干燥燥至恒重重的无水水葡萄糖糖对照品品30.43mmg，置置1000ml量量瓶中，加加蒸馏水水溶解并并稀释至至刻度，摇摇匀，即即得（每每1mll中含无无水葡萄萄糖0.30443mgg）。2.1.2 5苯酚试试剂的配配制取苯酚1100gg，加铝铝片0.1g和和碳酸氢氢钠0.05gg，蒸馏馏，收集集1822馏分分，称取取此馏分分5g置棕色色容量瓶中中溶解后后定容，存存冰箱备备用。2.1.3 供供试品溶溶液制备备方法的的考察与与确定 水提时间间的考察察 分别取660干燥至至恒重的的当归及及黄芪药药材细粉粉5份，每每份约00.500g，精精密称定定，置索索氏提取取器中，用用80%乙醇醇回流提提取2小小时，残残渣挥干干溶剂后后，再继继续以水水分别回回流提取取1.00h、22.0hh、3.0h、44.0hh、5.0h，反反复洗至至2500ml量量瓶中，加加水至刻刻度，摇摇匀，精精密量取取1mll，置110mll具塞干干燥试管管中，采采用改良良后的苯苯酚-硫硫酸法测测定吸光光度，计计算含量量，结果果见表11-1。表1-11 水提提不同提提取时间间对当归归含量测测定的影影响结果果样品提取时间间（h）当归多糖糖含量（%）黄芪多糖糖含量（%）11.07.56685.500122.08.59996.511133.08.58836.600044.08.59946.588955.08.58806.5990从表1-1可知知，水提提提取时时间为22.0hh时，药药材含量量达到最最大值且且保持恒恒定，延延长提取取时间药药材含量量变化不不大，故故选择提提取时间间为2.0h。2.1.4供试品品溶液的的制备分别取660干燥至至恒重的的当归及及黄芪药药材细粉粉约0.5g，精密密称定，置置索氏提提取器中中，用880%乙醇醇回流提提取1小时，残残渣挥干干溶剂后后，再继继续以水水回流提提取2小时，反反复洗涤涤残渣及及烧瓶至至2500ml量量瓶中，定容至刻度，摇匀，备用。2.1.5 最大吸吸收波长长选择 取2.1.11项下对照照品溶液液，在2200nnm-7700nnm波长长间进行行紫外吸吸收光谱谱扫描，最最大吸收收波长为为4900nm，确确定选择择4900nm作作为检测测波长。2.1.6 标标准曲线线的制备备精密量取取对照品品溶液11.0mml，22.0mml，33.0mml，44.0mml，55.0mml，66.0mml，分分别置550mll量瓶中中，加水水至刻度度，摇匀匀。精密密量取上上述各溶溶液1ml，置置具塞试试管中，分分别加55苯酚酚溶液00.6mml，混混匀，迅迅速加入入硫酸33.0mml，摇摇匀，于于90水浴中中15分钟钟，取出出，置冰冰水浴中中15分钟钟，取出出，以相相应试剂剂为空白白，照紫紫外可可见分光光光度法法（附录录VA），在在4900nm的的波长处处测定吸吸光度，结结果见表表1-22。以吸吸光度为纵纵坐标，葡葡萄糖取取样量为为横坐标标，绘制标标准曲线线，可得得回归方方程：yy=0.000455x-0.00111，rr=0.99995(n=6)。葡葡萄糖在在24.241455.444 gg范围内内，与吸吸光度呈呈良好的的线性关关系，结结果见图图1-11。表1-22 葡萄萄糖线性性范围考考察取样量(g)吸光度24.2240.111548.4480.200972.7720.333096.9960.4333121.200.5554145.440.6555图1-11 葡萄萄糖标准准曲线Fig 1-11 Sttanddardd Cuurvee off gllucoose2.1.6 精精密度试试验 精密量取取同一供供试品溶溶液，按按标准曲曲线项下下方法操操作测吸吸光度，重重复测定定6次，求得吸光度值的RSD值为0.33%。结果见表1-3，说明仪器的精密度符合要求。表1-33 精密密度试验验结果测定次数数吸光度AA10.388720.388630.388940.388850.388660.3886RSD（%）0.3332.1.7 稳稳定性试试验 精密量量取同一一供试品品溶液，按按标准曲曲线项下下方法操操作，每每10分钟钟测定一一次吸光光度，到到1小时后后改为330分钟钟测一次次，求得得多糖含含量的RRSD值值为1.02，结果果见表11-4，测测定值在在1200分钟内内保持稳稳定。以以下吸光光度的测测定均在在1200分钟内内完成。表1-44 稳定定性试验验结果测定时间间(miin)多糖含量量（）08.4991108.3880208.6002308.4447408.6447508.6224608.5336908.49911208.5113RSD（%）1.0222.1.8 重现性性试验 取60干燥至至恒重的的当归药药材细粉粉6份，精精密称定定，按22.1.3项下下方法制制备供试试品溶液液，按标准曲曲线项下下方法操操作分别别测定吸吸光度，计计算多糖糖含量，求求得多糖糖含量值值RSDD值为11.688，结结果见表表1-55，表明明方法重重现性良良好。表1-55 重现现性试验验结果样品多糖含量量（%）18.711028.899538.500548.600258.600968.5119平均含量量8.6440RSD（%）1.6882.1.9 加加样回收收率试验验 取取上述已已知多糖糖含量的的当归药药材细粉粉6份，每每份约00.1225g，精精密称定定，精密密加入浓浓度为22.1111 mmg/mml标准准葡萄糖糖对照品品溶液55 mll按2.1.33项下方方法制备备供试品品溶液，按标准曲线项下方法操作分别测定吸光度，计算多糖含量，计算回收率，结果见表1-6。平均回收率为99.12%，RSD值1.96%。结果表明：本法回收率较好，方法可行。表1-66 加样样回收率率试验结结果样品取样量（gg）样品含量量（mgg）对照品加加入量（mmg）实测量（mmg）回收率（）平均回收收率（）RSD（%）10.1224210.77010.55620.99797.22520.1225610.88210.55621.661102.1830.1225710.88310.55621.33399.44399.1121.96640.1225410.88010.55621.22298.66750.1225510.88110.55621.339100.1960.1225010.77710.55621.00196.9972.1.10 当归归药材中中多糖含含量测定定 取取60干燥至至恒重的的当归药药材细粉粉三份，每每份约00.255g，精精密称定定，按22.1.3项下下方法制制备供试试品溶液液，按标准曲曲线项下下方法操操作测定定吸光度度，计算算多糖含含量，求求得当归归药材中中平均多多糖含量量为8.58，结果果见表11-7。表1-77 当归归药材中中多糖含含量测定定结果样品取样量（gg）多糖含量量（）平均多糖糖含量（）10.255018.44420.244988.5448.58830.255008.7662.2 黄芪药药材中多多糖含量量测定方方法本试验采采用比色色法对药药材中的的含量进进行测定定，建立立了含量量测定方方法。2.2.1对照品品溶液的的制备精精密称取取经1005干燥至至恒重的的无水葡葡萄糖对对照品00.0332600g，置置1000ml量量瓶中，加加水溶解解并稀释释至刻度度，摇匀匀，即得得（每11ml中中含无水水葡萄糖糖0.332600mg）。2.2.2 0.22%蒽酮酮-硫酸酸溶液的的配制 称取取蒽酮粉粉末0.2g，置置1000ml棕棕色量瓶瓶中，加加硫酸至至刻度，摇摇匀，即即得。2.2.3供试品品溶液的的制备67取黄芪芪药材粗粗粉约11g，精精密称定定，置圆圆底烧瓶瓶中，加加水1000mll，加热热回流11.5hh，用脱脱脂棉滤滤过，再再重复提提取2次次，三次次滤液合合并，浓浓缩，移移至1000 mml量瓶瓶中，加加水至刻刻度，摇摇匀。精精密量取取2 mml，加加乙醇110 mml，搅搅拌，离离心，取取沉淀加加水溶解解，置225 mml量瓶瓶中，并并稀释至至刻度，精精密量取取2 mml，置置10mml具塞塞干燥试试管中，备备用。2.2.4 供试品品溶液制制备方法法的考察察与确定定 2.2.4.11 加加水量的的考察 取黄黄芪药材材粗粉44份，每每份约11g，精精密称定定，置圆圆底烧瓶瓶中，分分别加水水50mml、1100mml、1150mml、2200mml，加加热回流流1h，用用脱脂棉棉滤过，滤滤液浓缩缩，移至至1000 mll量瓶中中，加水水至刻度度，摇匀匀。精密密量取22 mll，加乙乙醇100 mll，搅拌拌，离心心，取沉沉淀加水水溶解，置置25mml量瓶瓶中，并并稀释至至刻度，精精密量取取2 mml，测测定吸光光度，计计算含量量，结果果见表11-8和和图1-2。表1-88 不同同溶剂用用量对含含量测定定的影响响结果样品加水量（mml）多糖含量量（%）1504.811221007.877431507.700242007.7774图1-22不同溶溶剂用量量对含量量测定的的影响结结果从表1-8和图图1-22可知，加加水量为为1000ml时时，药材材含量达达到最大大值且保保持恒定定，故选选择加水水量为1100mml。2.2.4.22 提提取时间间的考察察 取取黄芪药药材粗粉粉5份，每每份约11g，精精密称定定，置圆圆底烧瓶瓶中，加加水1000mll，分别别加热回回流0.5、11.0、11.5、22.0、22.5 h，用用脱脂棉棉滤过，滤滤液浓缩缩，移至至1000 mll量瓶中中，加水水至刻度度，摇匀匀。精密密量取22 mll，加乙乙醇100 mll，搅拌拌，离心心，取沉沉淀加水水溶解，置置25mml量瓶瓶中，并并稀释至至刻度，精精密量取取2 mml，测测定吸光光度，计计算含量量，结果果见表11-9和和图1-3。表1-99 不同同提取时时间对含含量测定定的影响响结果样品提取时间间（h）多糖含量量（%）10.57.599821.08.122531.58.599442.08.599752.58.5885图1-33 不同同提取时时间对含含量测定定的影响响结果从表1-9和图图1-33可知，提提取时间间为1.5h时时，药材材含量达达到最大大值且保保持恒定定，延长长提取时时间药材材含量变变化不大大，故选选择提取取时间为为1.55h。2.2.4.33 提提取次数数的选择择取黄芪芪药材粗粗粉5份份，每份份约1gg，精密密称定，置置圆底烧烧瓶中，加加水1000mlll，加加热回流流1.55h，分分别再重重复提取取0、11、2、33、4次次，用脱脱脂棉滤滤过，滤滤液浓缩缩，移至至1000 mll量瓶中中，加水水至刻度度，摇匀匀。精密密量取22 mll，加乙乙醇100 mll，搅拌拌，离心心，取沉沉淀加水水溶解，置置25mml量瓶瓶中，并并稀释至至刻度，精精密量取取2 mml，测测定吸光光度，计计算含量量，结果果见表11-100和图11-4。表1-110 不不同提取取次数对对含量测测定的影影响结果果样品提取次数数（次）多糖含量量（%）117.8669228.75503310.1130449.9773559.7002图1-44 不同同提取次次数对含含量测定定的影响响结果从表1-10和和图1-4可知知，次数数对多糖糖提取有有影响，随随着次数数增加多多糖含量量上升，提提取次数数为三次次时，药药材含量量达到最最大值且且保持恒恒定，增增加提取取次数药药材含量量变化不不大，故故选择提提取次数数为三次次。2.2.5标准准曲线的的制备66 精精密量取取对照品品溶液00.1mml、00.2mml、00.3mml、00.4mml、00.5mml、00.6mml，分分别置110mll具塞刻刻度试管管中，各各加水至至2.00ml，摇摇匀，在在冰水浴浴中缓缓缓滴加00.2%蒽酮-硫酸溶溶液至刻刻度，混混匀，放放冷后置置水浴中中保温110分钟钟，取出出，立即即置冰水水浴中冷冷却100分钟，取取出，以以相应试试剂为空空白，照照紫外-可见分分光光度度法（附附录VA），在在5822nm波波长处测测定吸光光度，结结果见表表1-111。以以吸光度度为纵坐坐标，葡葡萄糖取取样量为为横坐标标，绘制制标准曲曲线，可可得回归归方程：y = 0.00441x + 00.03337，rr=0.99992(n=6)。葡葡萄糖在在32.601955.600 gg范围内内，与吸吸光度呈呈良好的的线性关关系，结结果见图图1-55。表1-111 葡葡萄糖线线性范围围考察取样量(g)吸光度AA32.6600.155865.2200.311297.8800.4226130.400.5773163.000.6885195.600.8333图1-55 葡萄萄糖标准准曲线2.2.6 精精密度试试验 精密量量取同一一供试品品溶液，按按标准曲曲线项下下方法操操作测吸吸光度，重重复测定定6次，求得吸光度值的RSD值为0.14%。结果见表1-12，说明仪器的精密度符合要求。表1-112 精精密度试试验结果果测定次数数吸光度AA10.755420.755330.755340.755350.755260.7555RSD（%）0.1442.2.7稳定定性试验验 精精密量取取同一供供试品溶溶液，按按标准曲曲线项下下方法操操作，每每10分钟钟测定一一次吸光光度，到到1小时后后改为330分钟钟测一次次，求得得多糖含含量的RRSD值值为1.17，结果果见表11-133，测定定值在1120分分钟内保保持稳定定。以下下吸光度度的测定定均在1120分分钟内完完成。表1-113 稳稳定性试试验结果果测定时间间(miin)多糖含量量（）010.8841010.7722010.7743011.1124010.9985011.0016010.9959010.99312010.992RSD（%）1.1772.2.8 重现性性试验 取黄黄芪药材材粗粉66份，精精密称定定，按22.2.3项下下方法制制备供试试品溶液液，按标准曲曲线项下下方法操操作分别别测定吸吸光度，计计算多糖糖含量，求求得多糖糖含量值值RSDD值为11.144，结结果见表表1-114，表表明方法法重现性性良好。表1-114 重重现性试试验结果果样品多糖含量量（%）110.777211.002310.993411.112510.997611.008平均含量量10.998RSD（%）1.1442.2.9 加加样回收收率试验验 取取上述已已知多糖糖含量的的黄芪药药材粗粉粉6份，每每份约00.5gg，精密密称定，精精密加入入浓度为为10.9788mg/ml标标准葡萄萄糖对照照品溶液液5 mml按22.2.3项下下方法制制备供试试品溶液液，按标准曲曲线项下下方法操操作分别别测定吸吸光度，计计算多糖糖含量，计算回收率，结果见表1-15。平均回收率为99.61% ，RSD值1.73%。结果表明：本法回收率较好，方法可行。表1-115 加加样回收收率试验验结果样品取样量（gg）样品含量量（mgg）对照品加加入量（mmg）实测量（mmg）回收率（）平均回收收率（）RSD（%）10.4999954.88954.889109.6599.77620.5000554.99554.889110.18100.6230.5000354.99354.889110.82101.8299.6611.73340.5000754.99854.889110.02100.2750.4999554.88554.889108.1997.11860.4999854.88854.889108.6697.9982.2.10 黄芪芪药材中中多糖含含量测定定 取取黄芪药药材粗粉粉三份，每每份约11g，精精密称定定，按22.2.3项下下方法制制备供试试品溶液液，按标准曲曲线项下下方法操操作测定定吸光度度，计算算多糖含含量，求求得黄芪芪药材中中平均多多糖含量量为100.988，结结果见表表1-116。表1-116 黄黄芪药材材中多糖糖含量测测定结果果样品取样量（gg）多糖含量量（）平均多糖糖含量（）11.0000210.99520.9999810.99810.99831.0000311.001