[猫爪草皂苷对结肠癌ＬｏＶｏ细胞凋亡和线粒体电位的影响]细胞凋亡线粒体途径.docx

猫爪草皂苷对结肠癌细胞凋亡和线粒体电位的影响细胞凋亡线粒体途径 摘要：目的：探讨猫爪草皂苷(Radix rannculus temate saponins，RRTS)对人结肠癌LoVo细胞的增殖和凋亡作用及作用机制。方法：按猫爪草皂苷浓度分为1、10、100、500gmL-14个处理组和比照组(未加猫爪草皂苷)，处理LoVo细胞不同时间后，倒置显微镜视察细胞形态；采纳MTT法检测细胞增殖的抑制状况；流式细胞仪(FCM)分析细胞周期和凋亡率。结果：与比照组比较，猫爪草皂苷处理组可使细胞明显变圆、体积缩小、脱壁细胞增多；MTT法检测显示，猫爪草皂苷处理组随着浓度的增加和作用时间延长，对LoVo细胞的增殖抑制作用增加，并呈时间、剂量依靠性(P-1079-03 猫爪草系毛茛科植物小毛茛(Ranunculus tematusThunb)的块根，性平，味甘、辛，归肝、肺经。有解毒、化痰散结之功能，临床上用于治疗肺结核、颈淋巴结核、咽喉炎、淋巴癌、甲状腺肿瘤及乳腺肿瘤等疾病。王爱武博士发觉猫爪草皂苷对肉瘤S180、艾氏腹水瘤EAC及人乳腺癌MCF27细胞的生长和集落形成均有不同程度的影响，皂苷给药量与抑瘤率和集落形成明显地呈正相关。早期探讨报道，猫爪草Cu/Zn值趋向与癌症患者Cu/Zn值相反，猫爪草有效成分对肿瘤坏死因子有诱生作用。基于此，本探讨视察猫爪草皂苷对结肠癌LoVo细胞体外增殖和凋亡的影响，并进一步探讨作用机制。 1材料 1.1细胞人结肠癌细胞株LoVo购于中南高校湘雅中心试验室。 1.2药物和主要试剂猫爪草皂苷为河南中医学院第一附属医院中心试验室供应；罗丹明123(Rhodaminel23)荧光探针，Sigma公司。 1.3主要仪器倒置显微镜，日本Olympus公司；全自动酶标仪，奥地利；流式细胞仪，Coulter，USA；激光共聚焦系统，德国Lcica公司。 2方法 2.1猫爪草皂苷作用的视察细胞毒性测定(MTT法)用含10胎牛血清的RPM11640液调细胞浓度为1×104/孔，接种于96孔板，过夜培育，次日试验组加入不同浓度的皂苷，其终浓度分别为1、10、100和500gL-1，比照组只加等量的PBS液，每组设6平行孔，将培育板置于5CO2、37培育箱中，接着培育24、48和72h，在额定时间将每孔加入MTF20p,L，接着培育4h，吸去上清液，加入DMSO(150L/孔)，混匀10rain后，在酶标仪上测定各孔490nm处的吸光度A值。按下列公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率=(1-试验组A值/比照组A值)×100。流式细胞仪(FCM)测定细胞周期和凋亡率不同浓度皂苷处理LoVo细胞，同时设阴性比照组，于24h后PBS洗涤后收集细胞，加入预冷的乙醇(浓度为70)，于4固定24h，离心洗涤后，悬浮于PI染液中，最终以300目筛网过滤，调整细胞浓度为1×106mL-1，流式细胞仪分析，激发光源为氩离子激光，激发波长488nm，用Mulficycle DNA分析软件行细胞周期的测定。 2.2激光共聚焦扫描技术视察线粒体膜电位的改变细胞的处理：取对数生长期LoVo细胞，经消化、吹散、重悬于10小牛血清RPMll640培育液中，调整细胞浓度为5×104dlL-1。加入内置盖玻片(多聚赖氨酸浸泡，晾干)的6孔培育板内2.5mL，培育24h后分别在不同时段加入含皂苷(100gL-1)小牛血清10的RPM11640培育液中，于4h、8h、12h等时相点终止培育进行视察，另设不加入皂苷的为比照。罗丹明荧光探针标记：皂苷对细胞作用不同时间后，Rh0123 10gmL-1染色，在37，5CO2培育箱温育15min，PBS洗3次。用激光共聚焦视察线粒体膜电位的改变：每组选择不同视野的单个细胞，用激光共聚焦显微镜的图像分析系统(TCSTool)分析整个胞内的荧光强度(膜电位改变以荧光强度表示)，统计不同作用时间细胞的荧光值，计算的改变。 2.3统计学方法用SPSS 10.0统计软件包，进行，检验。 3结果 3.1细胞形态学视察结果倒置显微镜下视察，经皂苷处理12和24h后，部分细胞贴壁脱落，悬浮于培育液中，细胞变圆，体积减小，核固缩，核颜色加深，折光性增加，其中500gmL-1皂苷作用24h最明显，细胞数少，脱壁细胞明显增多。比照组细胞贴壁生长，细胞呈多角形，胞质饱满，生长伸展，相邻细胞生长融合成片。 3.2猫爪草皂苷对LoVo细胞的抑制作用 不同浓度皂苷作用24、48、72h后，LoVo细胞的生长均不同程度地受到抑制，并呈浓度和时间依靠性特点，其中以500gmL-1皂苷在72h时抑制率为最高。皂苷处理组LoVo细胞生长抑制率与比照组比较，差异均有显著性(P-1皂苷作用4h细胞荧光含量(134.55±7.68)显著减弱，8h为(111.16±9.30)，12h后细胞的线粒体膜电位强度进一步下降(92.97±11.44)。各组与比照组(215.26±12.58)差异显著(P