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    酶的分离纯化过程中要注意什么问题.docx

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    酶的分离纯化过程中要注意什么问题.docx

    酶别离纯化过程中的问题以及进行酶活力等测定的意义班级:生物技术133组别:第六组 姓名:董冰夏 学号:2013013906酶的别离纯化一般包括三个基本步骤:即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从 原料中引入溶液,此时不可防止地夹带着一些杂质,然后再将此酶从溶液中选择性地别离出 来,或者从此溶液中选择性地除去杂质,然后制成纯化的酶制剂。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的,但每一种酶的含量 却很低,如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多,但各种酶的含量却差异很大。因此,在提 取某一种酶时,首先应当根据需要,选择含此前最丰富的材料,如胰脏是提取胰蛋白酶、胰 凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的 限制,如不能综合利用,本钱又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的 酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多,既不受气候地理条件限制,而且动植物体 内酶大都可以在微生物中找到,微生物繁殖快,产酶量又丰富,还可以通过选育菌种来提高 产量,用廉价原料可以大量生产。生物细胞产生的酶有两类:一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶,称为细胞 外酶。这类酶大都是水解酶,如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶,就是由枯草杆菌和根酶 发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高,容易得到;另一类酶在细胞内产生后并不分泌到 细胞外,而在细胞内起催化作用,称为细胞内酶,如柠檬酸、肌甘酸、味精的发酵生产所进 行的一系列化学反响,就是在多种酶催化下在细胞内进行的,在类酶在细胞内往往与细胞结 构结合,有一定的分布区域,催化的反响具有一定的顺序性,使许多反响能有条不紊地进行。由于在生物组织中,除了我们所需要的某一种酶之外,往往还有许多其它酶和一般蛋白 质以及其他杂质,因此为制取某酶制剂时,必须经过分纯化的手续。因为酶是具有催化活性 的蛋白质,蛋白质很容易变性,所以在酶的提纯过程中应防止用强酸强碱,保持在较低的温 度下操作。酶是一种特殊的蛋白质,在别离纯化过程中需要注意温度以及PH值等的控制,注意在 纯化过程中所使用的缓冲溶液的离子强度的控制(常用PBS缓冲溶液),在实际纯化过程中, 一般要在低温冰箱中进行,缓冲溶液中注意加入EDTA二钠盐(1-5mM)螯和重金属离子一般避 免酶失活。常用别离步骤包括分子筛层析、离子交换、疏水层析等步骤。同时要注意防止酶 的变性失活。酶的别离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能的除去,因此,在不破坏所 需酶的条件下,可使用各种“激烈”的手段。止匕外,由于酶和它的底物、抑制剂等具有亲和 性,当这些物质存在时.酶的理化性质和稳定性发生了一定变化,从而提供了更多条件和方 法可供采用。酶具有催化活性。检测酶活性,跟踪酶的来龙去脉,为选择适当方法和条件提 供直接依据。在工作过程中,从原料开始每步都必须检测酶活性.一个好的方法和措施会 使酶的纯度提高倍数大,活力回收高,同时重复性好。酶活力也称为酶活性,是指酶催化一定化学反响的能力。酶活力的大小可用在一定条件 下,酶催化某一化学反响的速度来表示,酶催化反响速度愈大,酶活力愈高,反之活力愈低。 测定酶活力实际就是测定酶促反响的速度。酶促反响速度可用单位时间内、单位体积中底物 的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反响体系中,底物往往是过量的,测定初速 度时,底物减少量占总量的极少局部,不易准确检测,而产物那么是从无到有,只要测定方法 灵敏,就可准确测定。酶比活力为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数,一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。 酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度,对于同一种酶来说,比活力越大,酶的纯度越 高。利用比活力的大小可以用来比拟酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力,是表示酶的纯度 高低的一个重要指标。酶活回收率等于每次的总活性除以第一次的总活性,其实就是一种衡量酶纯化的指标。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比拟容易跟踪酶在别离提纯过程中的去向。 酶的催化活性又可以作为选择别离纯化方法和操作条件的指标,在整个酶的别离纯化过程中 的每一步骤,始终要测定酶的总活力和比活力,这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶, 纯度提高了多少,从而决定着一步骤的取舍。主要为了防止酶变性失活。一旦活力明显下降, 就要考虑换一种纯化方法。同时计算纯化效率,通过总活力和比活,评估纯化效率,寻找最 佳方法。

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