有机酸—苹果酸的发酵生产工艺设计29776.docx

有机酸苹果酸酸的发酵酵生产工工艺设计计报告告精细05520 陈思思 陈陈姣丽 孙鑫鑫 冯琪琪（有机酸酸的分类类：1、柠檬檬酸柠檬酸是是生物体体主要代代谢产物物之一，在在自然界界中分布布很广，主主要存在在于柠檬檬、柑橘橘、菠萝萝、梅、李李、梨、桃桃、无花花果等果果实中，尤尤其以未未成熟者者含酸量量较多。植植物叶子子中（如如烟叶、棉棉叶、菜菜豆叶等等）也含含有柠檬檬酸。柠柠檬酸在在植物体体内常与与苹果酸酸、草酸酸及酒石石酸等共共同存在在。在动动物中，柠柠檬酸存存在于骨骨骼、肌肌肉、血血液、乳乳汁、唾唾液、汗汗和尿中中，或者者以游离离状态或或金属盐盐类的形形式存在在。2、乳酸酸 早早在18841年年，Booutrron和和Freemy的的记载中中就有关关于乳酸酸的生产产方法，即即是将麦麦芽或酸酸乳放入入淀粉浆浆和牛乳乳中，任任其自然然发酵，然然后逐渐渐中和而而的记载载中就有有关于乳乳酸的生生产方法法，即是是将麦芽芽或酸乳乳放入淀淀粉浆和和牛乳中中，任其其自然发发酵，然然后逐渐渐中和而而产出乳乳酸。但但是，实实际上用用工业方方法生产产乳酸是是在18881年年开始于于美国。约约在18894年年，乳酸酸开始成成功地用用于皮革革和纺织织工业，当当时美国国的生产产量折合合纯品约约为每年年5吨。 我我国也早早就有乳乳酸盐额额度研究究和生产产。19944年年，重庆庆振元化化学药品品厂首先先生产乳乳酸钙，在在19555年发发表了“乳酸发发酵和乳乳酸钙制制造”一文。该该厂以后后迁到无无锡，改改名为无无锡第二二制药厂厂，生产产乳酸钙钙。现在在已采用用真菌制制剂代替替砻糠曲曲的生产产工艺，采采用大米米等为原原料，并并发行发发酵法生生产乳酸酸钙。3、醋酸酸 醋醋酸发酵酵可以说说是起源源于食醋醋发酵，而而食醋发发酵在古古代最早早只是酿酿酒受细细菌污染染的结果果，即所所谓“酒酸变变醋”。因此此醋酸发发酵的历历史几乎乎与酿酒酒一样悠悠久，可可以追溯溯到一万万年以前前。中国国的“醋”一词有有陈酒之之意。 能能生产食食醋的原原料很多多，如葡葡萄、苹苹果、麦麦芽、谷谷物原料料、乳清清等天然然含糖原原料皆可可。我国国食醋生生产的历历史非常常悠久，现现已有多多种风味味和特色色的食醋醋生产方方法。 早早先获得得醋酸的的方法有有天然发发酵醋的的蒸馏和和木材的的分解蒸蒸馏(所所谓“木醋”)。真真正的醋醋酸发酵酵应该说说是从快快速制醋醋法开始始发展起起来的，它它是现代代淋醋工工艺的前前身。快快速制醋醋工艺由由德国学学者舒莱莱巴赫在在18223年首首先提出出，因此此在国外外称为“德国工工艺”。4、葡糖糖酸 118800年，BBouttrouux首先先发现利利用微生生物的氧氧化作用用，能将将葡萄糖糖氧化成成葡糖酸酸。他发发现用醋醋化醋杆杆菌能发发酵葡萄萄糖产生生一种不不挥发酸酸，后来来确定为为葡糖酸酸。以后后许多研研究者也也相继报报道，其其他数种种细菌也也能产生生葡糖酸酸或酮基基葡糖酸酸。本世世纪300年代以以前，细细菌发酵酵是生产产葡糖酸酸的主要要方法。119222年，MMollliarrd发现现，利用用霉菌的的氧化作作用也能能产生葡葡糖酸。后后来人们们知道，黑黑曲霉、米米曲霉、文文民曲霉霉和青霉霉都有上上述氧化化作用。BBernnhagger119422年发现现，采取取中和生生成酸的的方法，黑黑曲霉能能高效地地将葡萄萄糖转化化成葡糖糖酸，而而添加碳碳酸钙最最好。在在较低温温度、限限制氮源源的条件件下，生生成的葡葡糖酸几几乎可达达理论产产率。 我我国在119555年由轻轻工业部部上海工工业试验验所试制制葡糖酸酸成功，选选出了黑黑曲霉887号菌菌种，不不久即在在山东投投入生产产。目前前，我国国已经有有数家葡葡糖酸发发酵工厂厂。5、衣康康酸 衣衣康酸（又又称为甲甲叉琥珀珀酸、分分解乌头头酸）最最早是由由Bauup18836年年蒸馏分分解柠檬檬酸时发发现的。而而微生物物产生衣衣康酸的的能力是是日本人人木下广广野19929年年在一种种嗜高参参压的霉霉菌培养养物中首首先发现现的，他他称之为为衣康酸酸曲霉。原原来Raaisttricck通过过对霉菌菌代谢物物的长期期研究发发现，土土曲霉表表面培养养时也能能产生衣衣康酸。 我我国的衣衣康酸生生产尚属属空缺。金金其荣等等人于119844年开始始着手对对衣康酸酸产生菌菌进行选选育和工工艺条件件的研究究。6、苹果果酸 苹苹果酸广广泛存在在于生物物体中，它它在很多多水果中中是占优优势的酸酸。微生生物产生生苹果酸酸的能力力也早已已被人们们所认识识，早在在19228年，YYuilll就报报道过，在在培养黄黄曲霉时时，有少少量苹果果酸伴随随琥珀酸酸和富马马酸产生生。Scchreeyerr19331年报报道，在在丛花青青霉的表表面培养养液中，生生成的有有机酸钙钙相当于于耗糖的的1/44，其中中大部分分是苹果果酸钙。BBernnhauuer等等报道，在在蔗糖为为碳源的的黑曲霉霉发酵液液中，除除生成大大量的柠柠檬酸之之外，也也有少量量苹果酸酸生成。 我我国在发发酵法生生产苹果果酸方面面也有很很大进展展。北京京微生物物研究所所研究了了固定化化皱褶假假丝酵母母的苹果果酸生产产技术。福建三明真菌研究所试验过L-苹果酸的霉菌固体发酵。6/1苹苹果酸的的性质苹果酸是是一种较较强的有有机酸，又又名羟基基丁二酸酸，是一一种白色色或荧白白色粉状状、粒状状或结晶晶状固体体。晶体体中不含含结晶水水，DLL-型熔熔点1229，L-型熔点点1000，加热热到1880可以失失水分解解成富马马酸或马马来酸。在在通常条条件下，苹苹果酸是是稳定的的，但其其纯晶体体稍有吸吸湿性，在在高湿度度条件下下可能液液化。在在相对湿湿度988，225下放置置6天，约约增重550.44.苹果酸在在催化剂剂存在下下与醇可可发生酯酯化反应应。以三三氟化硼硼为催化化剂与醇醇回流可可形成单单酯。与与多元醇醇、芳香香多元羧羧酸作用用，可形形成树脂脂类产品品，如醇醇酸聚酯酯树脂。在氧化银银存在下下，苹果果酸酯与与卤代烷烷反应可可以产生生醚类，如如乙氧基基琥珀酸酸。 在醇溶溶液中，苹苹果酸酯酯与氨作作用，可可以生成成苹果酸酸酰胺。6/2苹苹果酸的的发酵机机理L-苹果果酸在生生物体中中普遍存存在，它它作为三三羧酸循循环的一一员而参参与细胞胞代谢。在在一般生生物中它它只参与与循环而而不会大大量积累累，否则则会造成成代谢流流的阻塞塞。要想想积累苹苹果酸，必必须要有有补充44碳酸的的途径。理理论上讲讲，补充充4碳酸酸的途径径有两种种：乙醛醛酸循环环和丙酮酮酸羧化化支路。实际上，苹苹果酸的的生物合合成机理理虽然早早就研究究得很清清楚，但但它只是是从生物物生理学学的角度度去研究究的。对对于微生生物发酵酵中苹果果酸合成成机理尚尚没有进进行过细细致研究究。一般般认为，苹苹果酸发发酵牵涉涉到COO2的固定定（即丙丙酮酸羧羧化），其其证据有有：发酵酵依赖于于CaCCO3或其他他碳酸盐盐，添加加生物素素可以促促进苹果果酸积累累等。但但是，CCO2固定反反应在各各种菌的的发酵中中究竟占占多大比比例还未未见有报报道。毫毫无疑问问，无论论有无乙乙醛酸循循环存在在，提高高丙酮酸酸羧化的的比例则则能提高高碳源的的利用率率，也即即能提高高苹果酸酸产率。因因此，这这是苹果果酸发酵酵值得研研究的课课题。6/3苹苹果酸发发酵微生生物的分分类一、 黄曲霉二、 米曲霉三、 寄生曲霉霉四、 华根霉五、 无根根霉霉六、 膜瞨毕赤赤酵母七、 短乳杆菌菌八、 产氨短杆杆菌6/4苹苹果酸的的发酵工工艺 LL-苹果果酸的发发酵工艺艺大体可可以分为为三类：一步发发酵法、两两步发酵酵法和酶酶法转化化。一步步发酵又又称为直直接发酵酵，它用用糖类为为原料，用用霉菌直直接发酵酵产生苹苹果酸。两两步发酵酵法也是是用糖类类为原料料，先由由根霉发发酵成富富马酸（或或富马酸酸-苹果果酸混合合物），再再由酵母母或细菌菌转化成成苹果酸酸。酶法法转化是是用富马马酸（盐盐）或马马来酸为为原料，用用微生物物酶（包包括全细细胞）转转化成苹苹果酸。与与化学合合成法不不同的是是，发酵酵方法利利用了微微生物酶酶的立体体异构专专一性，生生产的都都是L-苹果酸酸，是生生物体内内所存在在和可以以利用的的构型，而而化学合合成法只只能生产产DL-苹果酸酸，如作作为食品品和药物物，则有有一半不不能得到到利用。6/4.1直接接发酵工工艺(一) 菌种扩大大培养 用用于苹果果酸直接接发酵的的黄曲霉霉和米曲曲霉都易易于产生生孢子。将将保存在在麦芽汁汁琼脂斜斜面上的的黄曲霉霉孢子用用无菌水水洗下，接接到三角角瓶中。瓶瓶中装有有种子培培养基。在在33静置培培养24天天，待长长出大量量孢子，接接到种子子罐中。 种种子罐装装有下述述种子培培养基（g/L） 葡萄萄糖（水水解糖中中）300 豆饼饼粉 100 FeSSO4 00.5 K22HPOO4 0.2 NaaCL 00.011 MggSO44 00.1 CCaCOO3 60(单独灭灭菌) 种种子罐培培养的目目的是使使孢子发发芽，以以缩短生生产罐的的发酵迟迟滞期。种种子罐的的体积是是生产罐罐的100，装装液700，例例如500L罐装装液355L。在在1000灭菌220330miin后，冷冷至400以下，加加入单独独灭菌的的CaCCO3，接种种黄曲霉霉孢子后后在333344通气搅搅拌培养养。通气气量0.150.33vvmm，罐压压维持1100KKPa，加加入泡敌敌（500l罐加加20mml）抑抑制泡沫沫生成。培培养188200h后接接入生产产罐。（二）发发酵规程程 发酵酵培养基基采用葡葡萄糖770880g/l,其其余成分分与种子子培养基基相同。 生产产培养基基除CaaCO33以外，直直接在生生产罐内内配制，在在缓慢搅搅拌下直直接通蒸蒸汽升温温至1000，维持持20mmin灭灭菌。冷冷至400时，加加入单独独灭菌（干干热1660，2hh）的CCaCOO3。当品品温降到到34时，接接种100种子子培养液液，通气气搅拌进进行发酵酵。发酵酵时控制制温度333334，通气气量0.7vvvm,搅搅拌转速速1800r/mmin,泡沫自自由控系系统流加加泡敌控控制。整整个发酵酵过程约约需400h。待待残糖降降到1gg/l以以下，放放罐进入入提取工工序。(三)、影影响苹果果酸发酵酵的因素素 1.氮氮源 2.碳碳酸盐种种类3.碳酸酸钙用量量4.碳源源种类5.金属属离子6.铁盐盐7.抑制制剂8.氨基基酸和维维生素9.温度度6/4.2两步步发酵工工艺 两两步发酵酵是先用用根酶将将糖类发发酵成富富马酸（或或富马酸酸与苹果果酸混合合物），再再由酵母母或细菌菌发酵成成L-苹苹果酸的的工艺。这这前一步步称为富富马酸发发酵，后后一步称称为转换换发酵。（一）富富马酸发发酵根霉产生生富马酸酸的能力力早就被被人们所所认识。著著名的根根霉富马马酸发酵酵菌种有有华根霉霉、无根根霉和黑黑根霉。根根霉在葡葡萄糖马马铃薯汁汁琼脂斜斜面上，于于30培养77天后，易易于长出出大量孢孢子。对于华根根霉65508的的富马酸酸发酵，可可以采用用下述培培养基（）： 葡萄萄糖 110 （NNH4）2SO4 00.5 K22HPOO4 0.1 MMgSOO4·7H2O 00.055 FeeCl33·6H2O 00.0002 CaCCO3 5在5000ml三三角瓶中中装液550mll，另外外还要加加入各种种表面活活性剂，具具体添加加量见后后述。接接种华根根霉孢子子后，先先静置培培养一段段时间，再再振荡培培养，维维持温度度30。（二）转转换发酵酵 转转换发酵酵是在根根霉发酵酵一定时时间后，再再加入第第二种微微生物使使富马酸酸发酵转转换成苹苹果酸发发酵。有有这种转转换能力力的微生生物很多多。佐佐佐木等普普查了分分别属于于假丝酵酵母属、德德巴利酵酵母属、汉汉逊酵母母属、毕毕赤酵母母属、红红酵母属属、酵母母属和球球拟酵母母属的223株酵酵母，发发现膜璞璞毕赤酵酵母的转转化率最最高。6/4.3酶法法转化工工艺酶法转化化工艺相相当于两两步发酵酵工艺中中的转换换发酵。转转换发酵酵是将第第一步发发酵生成成的富马马酸转化化成苹果果酸;而而酶法转转化是用用富马酸酸盐（一一般是化化学合成成的）为为原料，利利用微生生物的富富马酸酶酶转化成成苹果酸酸(盐)。酶法法转化是是现在国国外生产产L-苹苹果酸的的主要方方法。如如果转化化是以钙钙盐的形形式进行行的，则则称为“转晶”，即富富马酸钙钙晶体转转化成苹苹果酸钙钙晶体: EffCaFuu Caa2+ + Fuu2- Maa2+ + CCa2+ CaMMa 6/44.4固固定化细细胞转化化工艺 前前面已经经提到，富富马酸向向L-苹苹果酸的的转化只只牵涉一一步酶催催化反应应，因此此只要把把富马酸酸酶提取取出来，固固定到载载体上，就就可以利利用固相相酶反应应柱连续续生产LL-苹果果酸。但但实际上上遇到的的问题是是，酶的的提纯手手续复杂杂，酶的的回收率率低，成成本高。（一） 产氨短杆杆菌细胞胞固定与与苹果酸酸生产（二） 黄色短杆杆菌细胞胞固定与与苹果酸酸生产1. 氮源2. 碳源3. 玉米浆4. 通气5. 温度6. 培养时间间6/4.5其他他发酵方方法（一） 担子菌发发酵法（二） 产碱杆菌菌酶法转转化（三） 解脂假丝丝酵母转转化法（四） 解烃富马马酸假丝丝酵母发发酵法（五） 假丝酵母母酶法转转化（六） 栖热菌酶酶法转化化（七） 固定化皱皱褶假丝丝酵母转转化法6/5苹苹果酸的的提取和和精制一 苹果酸的的提取发酵液的的处理包包括前66个步骤骤，即酸酸解、过过滤、中中和、过过滤、酸酸解、过过滤。由由于苹果果酸发酵酵中需要要添加过过量的CCaCoo3，另另外形成成放的苹苹果酸钙钙盐溶解解度也极极低，所所以成熟熟的发酵酵酿成浓浓浆状。酸解过滤中和过滤酸解发酵液无砷硫酸酸 石膏膏渣、菌菌体 CaCCo3+Ca(OH)2干燥过滤 滤滤液 无无砷硫酸酸结晶真空浓缩精制 石石膏渣 结晶晶成品 500浓缩缩液 苹果提取取工艺流流程二、苹果果酸的精精制三、苹果果酸结晶晶工艺流流程中间浓缩过滤第一次富马酸结晶前浓缩 苹苹果酸溶溶液 苹果酸结晶过滤第二次富马酸结晶干燥 富马酸酸晶体 富马酸酸晶体苹果酸结结晶工艺艺流程6/6苹苹果酸的的检验6/6.1定性性检验1. 三氯化钛钛法2. 美国药典典法3. 纸层析法法6/6.2定量量检验1. 酸碱滴定定法2. 紫外分光光光度法法3. 荧光分光光光度法法6/7苹苹果酸的的用途苹果酸广广泛存在在于各种种生物体体中，是是生物体体重要的的代谢循循环三羧酸酸循环的的成员之之一。在在天然水水果（苹苹果、山山楂、葡葡萄、樱樱桃）中中含量较较高，它它具有明明显的呈呈味作用用，其酸酸味柔和和别致，解解渴爽口口。苹果果酸广泛泛用于食食品和医医药工业业中，它它的质地地稳定，在在水中溶溶解度大大。它在在食品等等部门中中的用途途简介如如下：1. 食品酸味味剂2. 食品加工工3. 食品添加加剂加工工4. 烟草加工工5. 医药 6. 日用化工工7. 化学工业业