土壤中分解尿素尿素的细菌的分离与计数.ppt

微生物的培养与应用微生物的培养与应用一、课题目标一、课题目标 研究培养基对微生物的选择作用，研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。进行微生物数量的测定。二、课题重点与难点二、课题重点与难点重点重点：对土样的选取和选择培养基的配制。对土样的选取和选择培养基的配制。难点：难点：对分解尿素的细菌的计数。对分解尿素的细菌的计数。三、研究思路三、研究思路微生物的微生物的选择培养选择培养，是指利用培，是指利用培养基的组成使适宜生长的特定微生物养基的组成使适宜生长的特定微生物得到较快繁殖的技术，也称为微生物得到较快繁殖的技术，也称为微生物的的“选择培养选择培养”。（一）筛选菌株（一）筛选菌株在本课题提供的选择培养基的配方中，在本课题提供的选择培养基的配方中，尿素是培养基中的尿素是培养基中的惟一氮源惟一氮源，因此，原则，因此，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。但实际上，微生物的培养是一个非常复杂但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物不一定是所需要的微养基上生长的微生物不一定是所需要的微生物，还需要进一步的验证。生物，还需要进一步的验证。（二）统计菌落数目（二）统计菌落数目 统计菌落数目的理论依据是：统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够高时，培养基表当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在平板上，培养后再选择菌落数在3030300300的平板进行计数。的平板进行计数。说说明明设设置置重重复复组组的的重重要要性性。第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。这个实例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。1.1.想一想，如何从平板上的菌落数推测出想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？每克样品中的菌落数？答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计最好能统计3 3个平板，计算出平板菌落数的平个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。A A同学的结果与其他同学不同，可能同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。的解释有两种。一是由于土样不同一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误二是由于培养基污染或操作失误。（三）设置对照（三）设置对照究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。另一种方案另一种方案：将将A A同学配制的培养基在不加土样的情况同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。果要有说服力，对照的设置是必不可少的。实验方案有两种实验方案有两种一种方案一种方案：可以由其他同学用与可以由其他同学用与A A同学一样的土样进同学一样的土样进行实验，如果结果与行实验，如果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明A A无无误；如果结果不同，则证明误；如果结果不同，则证明A A同学存在操作失同学存在操作失误或培养基的配制有问题。误或培养基的配制有问题。四、实验案例四、实验案例实验的具体操作步骤如下实验的具体操作步骤如下:1.1.土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土表层土3 cm3 cm左右，再取样，将样品装入事左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。先准备好的信封中。土壤中某样品细菌的分离与计数土壤中某样品细菌的分离与计数 准备准备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基和和选择培养基选择培养基将菌将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照对照，用来，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为个较为宽泛的范围：稀释倍数为10103 310107 7。每个。每个稀释度下需要稀释度下需要3 3个个选择培养基，选择培养基，1 1个牛肉膏蛋白胨个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要培养基，因此共需要1515个选择培养基，个选择培养基，5 5个牛肉个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8 8个个灭菌的试灭菌的试管和管和1 1个个灭菌的移液管。灭菌的移液管。2.2.制备培养基制备培养基 将将10 g10 g土样加入盛有土样加入盛有90 mL90 mL无菌生理无菌生理盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为250 mL250 mL），），充分摇匀，吸取上清液充分摇匀，吸取上清液1 mL1 mL，转移至盛有，转移至盛有9 9 mLmL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至稀释至10107 7稀释度，并按照由稀释度，并按照由10107 710103 3稀释稀释度的顺序分别吸取度的顺序分别吸取0.1 mL0.1 mL进行平板涂布操进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。必更换移液管。3.3.微生物的培养与观察微生物的培养与观察 将涂布好的培养皿放在将涂布好的培养皿放在30 30 温度下培养。温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。数量、形态等，并做好记录。挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图图2-102-10的颜色反应。的颜色反应。为什么分离不同的微生物要采用不同的为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？同吗？答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株位：株/kg/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：层样本中：好氧及兼性厌氧细菌好氧及兼性厌氧细菌数约为数约为2 1852 185万，万，放线菌数放线菌数约为约为477477万，万，霉菌数霉菌数约为约为23.123.1万。因此，万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。养的条件。4.4.细菌的计数细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数当菌落数目稳定时，选取菌落数在在3030300300的平板进行计数。在同一的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对稀释度下，至少对3 3个平板进行重复计个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。目。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。地等等，都是区分细菌的重要手段。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。地等等，都是区分细菌的重要手段。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。地等等，都是区分细菌的重要手段。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。地等等，都是区分细菌的重要手段。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。地等等，都是区分细菌的重要手段。一一 无菌操作无菌操作1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。二二 做好标记做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。三三 规划时间规划时间六、课题成果与评价六、课题成果与评价 （一）培养物中是否有杂菌污染以（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落及选择培养基是否筛选出菌落 对照的培养皿在培养过程中没有菌对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目培养基的数目，说明选择培养基已筛选，说明选择培养基已筛选出一些菌落。出一些菌落。伊红伊红美蓝培养基美蓝培养基是鉴别培养基，可以是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的为的代谢产物与伊红代谢产物与伊红美蓝结合美蓝结合，使菌落呈，使菌落呈深紫色并带有金属光泽深紫色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。制其他微生物的生长。例如：鉴别大肠杆菌培养基例如：鉴别大肠杆菌培养基大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征如果学生选取的是同一种土样，统计的结如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步分析产生差异的原因。分析产生差异的原因。（二）样品的稀释操作是否成功（二）样品的稀释操作是否成功 如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在3030300300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。进行菌落的计数。（三）重复组的结果是否一致（三）重复组的结果是否一致本课题知识小结本课题知识小结:七、例题解析七、例题解析例例1 1对细菌群体生长规律测定的正确的表述是对细菌群体生长规律测定的正确的表述是A A在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B B至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C C接种一个细菌接种一个细菌 D D及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。答案：答案：A A例例3 3（20052005年江苏）抗生素作为治疗细菌年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。代的意义。青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是型是 ，青霉素是青霉菌的，青霉素是青霉菌的 代谢产物。代谢产物。在生产和科研中，常选用处于在生产和科研中，常选用处于 期的青霉菌期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，和和 比较稳定。比较稳定。对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，发酵液，经离心分离、反复洗涤后，再计算发酵，再计算发酵罐中菌体的总重量。罐中菌体的总重量。异养需氧型异养需氧型次级次级对数对数个体的形态个体的形态生理特性生理特性称菌体的湿重（称烘干后的重量）称菌体的湿重（称烘干后的重量）解析：解析：青霉菌属于真菌，其代谢类型应为青霉菌属于真菌，其代谢类型应为异养需氧型异养需氧型，而而青霉素青霉素作为它的代谢产物，并不是它生长、繁殖作为它的代谢产物，并不是它生长、繁殖所必需的，所以青霉素应属于次级代谢产物。在测所必需的，所以青霉素应属于次级代谢产物。在测定培养基上青霉菌菌体的生长情况时，常用的方法定培养基上青霉菌菌体的生长情况时，常用的方法有两种：有两种：一种是测量青霉菌的细胞数目一种是测量青霉菌的细胞数目，另一种是，另一种是测重量测重量，取一定体积的发酵液，经离心分离、反复，取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，称菌体的湿重，或烘干后称干重，再由此洗涤后，称菌体的湿重，或烘干后称干重，再由此计算出其中的细胞总重量。在细菌生长的四个主要计算出其中的细胞总重量。在细菌生长的四个主要时期中，因为处于对数期的细菌代谢旺盛，个体的时期中，因为处于对数期的细菌代谢旺盛，个体的形态和生理特性比较稳定，常作为生产用的菌种和形态和生理特性比较稳定，常作为生产用的菌种和科研的材料。科研的材料。