蛋白质工程的应用实例备课讲稿.ppt

蛋白质工程的应用实例第一节第一节 蛋白质工程概述蛋白质工程概述n n一、蛋白质工程的概念n n根据对蛋白质己知结构和功能的了解，借助计根据对蛋白质己知结构和功能的了解，借助计算机辅助设计，利用基因定点诱变等技术，特算机辅助设计，利用基因定点诱变等技术，特异性地对现有蛋白质结构基因进行改造，借以异性地对现有蛋白质结构基因进行改造，借以改善蛋白质的物理和化学性质，如提高蛋白质改善蛋白质的物理和化学性质，如提高蛋白质的热稳定性、酶的专一性等，或者利用化学和的热稳定性、酶的专一性等，或者利用化学和物理手段，对目标基因按预期设计进行进行修物理手段，对目标基因按预期设计进行进行修饰和改造，合成新的蛋白质的技术手段，并可饰和改造，合成新的蛋白质的技术手段，并可以借此对蛋白质的结构与功能的关系进行更加以借此对蛋白质的结构与功能的关系进行更加深入的研究。深入的研究。第一节第一节 蛋白质工程概述蛋白质工程概述n n二、蛋白质概述n n（一）蛋白质的组成（一）蛋白质的组成n n组成人体蛋白质的氨基酸仅有组成人体蛋白质的氨基酸仅有2020种其中除甘氨种其中除甘氨酸和脯氨酸外，均属于酸和脯氨酸外，均属于 L-L-氨基酸氨基酸第一节第一节 蛋白质工程概述蛋白质工程概述n n二、蛋白质概述n n（二）蛋白质的结构（二）蛋白质的结构n n一级结构一级结构n n二级结构二级结构n n三级结构三级结构n n四级结构四级结构第一节第一节 蛋白质工程概述蛋白质工程概述n n二、蛋白质概述n n（三）蛋白质结构与功能的关系（三）蛋白质结构与功能的关系n n 1.1.蛋白质一级结构与功能的关系蛋白质一级结构与功能的关系n n(1)(1)相似的结构具有相似的功能相似的结构具有相似的功能n n(2)(2)不同结构具有不同的功能不同结构具有不同的功能n n 2.2.蛋白质空间结构与功能的关系蛋白质空间结构与功能的关系n n空间结构发生改变，其功能活性也必然会随之空间结构发生改变，其功能活性也必然会随之改变改变 第二节第二节 蛋白质工程的研究方法蛋白质工程的研究方法n n一、蛋白质工程的研究策略n n研究过程就是通过严格的分子设计，把它定向研究过程就是通过严格的分子设计，把它定向地改造成一个具有预期的新的特性的蛋白质。地改造成一个具有预期的新的特性的蛋白质。一种是对天然蛋白质进行改造；另一种是完全一种是对天然蛋白质进行改造；另一种是完全重建一个新的蛋白质。在具体操作中，前者是重建一个新的蛋白质。在具体操作中，前者是对天然蛋白质中的少数几个氨基酸残基进行的对天然蛋白质中的少数几个氨基酸残基进行的替换替换(小改小改)、分子剪裁、分子剪裁(中改中改)或者局部重建或者局部重建(大大改改)；后者是从头设计；后者是从头设计个全新的蛋白质。我们个全新的蛋白质。我们目前的蛋白质工程研究中主要进行的是目前的蛋白质工程研究中主要进行的是“小改小改”和和“中改中改”。第二节第二节 蛋白质工程的研究方法蛋白质工程的研究方法n n二、改变现有蛋白质的结构n n（一）小改（一）小改少数几个氨基酸残基的替换少数几个氨基酸残基的替换n n定点突变是目前蛋白质工程研究的主要技术手定点突变是目前蛋白质工程研究的主要技术手段。段。n n（二）中改（二）中改分子剪裁分子剪裁n n分子剪裁是指在对天然蛋白质的改造中替换一分子剪裁是指在对天然蛋白质的改造中替换一个肽段或一个结构域。个肽段或一个结构域。第二节第二节 蛋白质工程的研究方法蛋白质工程的研究方法n n三、蛋白质全新设计n n对蛋白质的全新设计所应用的技术手段是我们对蛋白质的全新设计所应用的技术手段是我们前面所提到的前面所提到的“大改大改”或或“从头设计从头设计“工作工作n n是在人们认识蛋白质、掌握其结构规律并了解是在人们认识蛋白质、掌握其结构规律并了解其结构功能关系的基础上进行的。同时也是人其结构功能关系的基础上进行的。同时也是人们更加深入全面认识蛋白质的一个过程，它的们更加深入全面认识蛋白质的一个过程，它的目的是人工创造出自然界中不存在的蛋白质分目的是人工创造出自然界中不存在的蛋白质分子，使之具有人们所需要的特殊结构和功能，子，使之具有人们所需要的特殊结构和功能，为人类所利用。为人类所利用。n n目前该技术仍处于实验初级阶段。目前该技术仍处于实验初级阶段。第三节第三节 蛋白质工程的应用实例蛋白质工程的应用实例n n一、胰蛋白酶n n胰蛋白酶（胰蛋白酶（EC3.4.21.4EC3.4.21.4）是丝氨酸蛋白酶类，它）是丝氨酸蛋白酶类，它是一条单链肽，由是一条单链肽，由223223个氨基酸残基组成，个氨基酸残基组成，NN末末端为异亮氨酸。主要作用于精氨酸或赖氨酸羧端为异亮氨酸。主要作用于精氨酸或赖氨酸羧基端的肽键。是特异性最强的蛋白酶，在决定基端的肽键。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。具。第三节第三节 蛋白质工程的应用实例蛋白质工程的应用实例n n一、胰蛋白酶n n胰蛋白酶极易自溶，自溶产物经层析分离后，胰蛋白酶极易自溶，自溶产物经层析分离后，会得到会得到4 4个具有胰蛋白酶活性的片段。通过对个具有胰蛋白酶活性的片段。通过对NN末端残基的分析，表明这些活性产物是由于末端残基的分析，表明这些活性产物是由于ArgArg117117-Val-Val118118、LysLys145145-Ser-Ser146146及及LysLys159159-Ala-Ala160160处发生了处发生了断裂而出现的。人们运用了蛋白质工程手段，断裂而出现的。人们运用了蛋白质工程手段，对对ArgArg117117位自溶点进行了缺失突变，最终得到了位自溶点进行了缺失突变，最终得到了稳定性明显提高的突变株。稳定性明显提高的突变株。第三节第三节 蛋白质工程的应用实例蛋白质工程的应用实例n n二、金属硫蛋白n n金属硫蛋白金属硫蛋白(metallothionein,MT)(metallothionein,MT)是由微生物是由微生物和植物产生的金属结合蛋白，是一类富含半胱和植物产生的金属结合蛋白，是一类富含半胱氨酸的短肽，是半胱氨酸残基和金属含量极高氨酸的短肽，是半胱氨酸残基和金属含量极高的蛋白质，可以通过半胱氨酸的巯基结合大量的蛋白质，可以通过半胱氨酸的巯基结合大量的金属素，对多种重金属有高度的亲和性。一的金属素，对多种重金属有高度的亲和性。一般由两个大小相近，结构与功能类似的结构域般由两个大小相近，结构与功能类似的结构域组成，即组成，即-结构域和结构域和-结构域。人们为将含有结构域。人们为将含有-结构域的基因转移到烟草中，成功的获得了对结构域的基因转移到烟草中，成功的获得了对镉，铜，铅等重金属具有较高抗性的工程株。镉，铜，铅等重金属具有较高抗性的工程株。第三节第三节 蛋白质工程的应用实例蛋白质工程的应用实例n n三、人白细胞介素-2n nIL-2IL-2是第是第个被发现的白细胞介素。天然人白个被发现的白细胞介素。天然人白细胞介素细胞介素-2-2是一个由是一个由133133个氨基酸残基组成的多个氨基酸残基组成的多肽，肽，133133个氨基酸中共有个氨基酸中共有3 3个半胱氨酸，其中有个半胱氨酸，其中有一个半胱氨酸（一个半胱氨酸（CysCys125125）以游离方式存在，而另）以游离方式存在，而另两个半胱氨酸（两个半胱氨酸（CysCys5858和和CysCys105105）缩合成活性所必）缩合成活性所必需的二硫键。需的二硫键。第三节第三节 蛋白质工程的应用实例蛋白质工程的应用实例n n三、人白细胞介素-2n n人们用蛋白质工程中的定位诱变技术将人们用蛋白质工程中的定位诱变技术将CysCys125125的的密码密码TGTTGT转换成转换成TCTTCT或或GCAGCA，使，使CysCys125125转换成丝转换成丝氨酸或丙氨酸，避免了错误配对的产生。结果氨酸或丙氨酸，避免了错误配对的产生。结果不但使不但使IL-2IL-2的生物活性不受影响，而且其热稳的生物活性不受影响，而且其热稳定性等方面也得到了较明显的改善。工程定性等方面也得到了较明显的改善。工程IL-2IL-2目前已被美国目前已被美国FDAFDA批准上市，用于治疗肾细胞批准上市，用于治疗肾细胞瘤。我国卫生部也已经批准了在国内试生产基瘤。我国卫生部也已经批准了在国内试生产基因工程白细胞介素因工程白细胞介素-2-2。第三节第三节 蛋白质工程的应用实例蛋白质工程的应用实例n n四、组织纤维蛋白溶酶原激活因子n ntPAtPA能够切割纤溶酶原形成纤溶酶，从而激活纤能够切割纤溶酶原形成纤溶酶，从而激活纤溶作用溶作用(fibrino1ysis)(fibrino1ysis)，使血栓溶解。作为一，使血栓溶解。作为一种高效特异性溶血栓药物。优点种高效特异性溶血栓药物。优点:(1):(1)血栓选择血栓选择性高但几乎不激活循环血液中的纤溶系统，可性高但几乎不激活循环血液中的纤溶系统，可直接静脉注射；直接静脉注射；(2)(2)对中毒性休克引起的弥散性对中毒性休克引起的弥散性血管内凝血疗效显著等。血管内凝血疗效显著等。第三节第三节 蛋白质工程的应用实例蛋白质工程的应用实例n n四、组织纤维蛋白溶酶原激活因子n n利用基因定点诱变技术，改变利用基因定点诱变技术，改变tPAtPA分子中的某些分子中的某些糖基化氨基酸而减少或避免了糖基化，有效地减糖基化氨基酸而减少或避免了糖基化，有效地减缓了它在血浆中被清除的速率，达到了延长其半缓了它在血浆中被清除的速率，达到了延长其半寿期的目的，临床应用价值得到有效提高寿期的目的，临床应用价值得到有效提高第三节第三节 蛋白质工程的应用实例蛋白质工程的应用实例n n五、枯草杆菌蛋白酶n n枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)(subtilisin)是由枯草芽抱杆是由枯草芽抱杆菌菌(Bacillus subtilis)(Bacillus subtilis)合成的一种丝氨酸蛋白酶。合成的一种丝氨酸蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶根据来源的不同可分为枯草杆菌蛋白酶根据来源的不同可分为CarlsbergCarlsberg，E E，BLBL，YaBYaB等多种。等多种。第三节第三节 蛋白质工程的应用实例蛋白质工程的应用实例n n五、枯草杆菌蛋白酶n n枯草杆菌蛋白酶可以催化蛋白质，把蛋白质水枯草杆菌蛋白酶可以催化蛋白质，把蛋白质水解成氨基酸。具有重要的应用价值，被广泛应解成氨基酸。具有重要的应用价值，被广泛应用在洗涤剂、制革及丝绸工业中，是一种重要用在洗涤剂、制革及丝绸工业中，是一种重要的工业用酶。三维结构及编码基因目前已经基的工业用酶。三维结构及编码基因目前已经基本搞清楚，而且配有合适的克隆、表达系统以本搞清楚，而且配有合适的克隆、表达系统以及准确的定量分析催化活性的方法，因此缺点及准确的定量分析催化活性的方法，因此缺点目前已经可以通过蛋白质工程得到改进目前已经可以通过蛋白质工程得到改进第三节第三节 蛋白质工程的应用实例蛋白质工程的应用实例n n五、枯草杆菌蛋白酶n n对枯草杆菌蛋白酶所做的定点诱变已有对枯草杆菌蛋白酶所做的定点诱变已有400400多个，多个，在理论和应用方面均取得了相当大的进展和成在理论和应用方面均取得了相当大的进展和成功。枯草杆菌蛋白酶早在几十年前就被开发成功。枯草杆菌蛋白酶早在几十年前就被开发成为商用的纺织品洗涤剂的添加酶，目前仍然是为商用的纺织品洗涤剂的添加酶，目前仍然是最基本、最重要，也是使用最广泛、最成熟的最基本、最重要，也是使用最广泛、最成熟的洗涤用酶。应用定点改造后的枯草杆菌蛋白酶洗涤用酶。应用定点改造后的枯草杆菌蛋白酶制成的洗涤剂，便可以实现与漂白剂共同使用制成的洗涤剂，便可以实现与漂白剂共同使用的目的了。的目的了。第三节第三节 蛋白质工程的应用实例蛋白质工程的应用实例n n五、枯草杆菌蛋白酶n n另一方面枯草杆菌蛋白酶在作为蛋白质工程的另一方面枯草杆菌蛋白酶在作为蛋白质工程的研究对象过程中，不仅仅使它自身的诸多性能研究对象过程中，不仅仅使它自身的诸多性能得到了改善；更为重要的是在研究它的过程中，得到了改善；更为重要的是在研究它的过程中，蛋白质工程的研究理论同时也得到了大大的丰蛋白质工程的研究理论同时也得到了大大的丰富，这为蛋白质工程技术应用于其他酶的研究，富，这为蛋白质工程技术应用于其他酶的研究，尤其是对其他工业酶的性能改造提供了非常珍尤其是对其他工业酶的性能改造提供了非常珍贵的范例和理论指导。贵的范例和理论指导。胰蛋白酶酶活力的测定胰蛋白酶酶活力的测定n n一、实验目的n n1.1.掌握胰蛋白酶的基本性质；掌握胰蛋白酶的基本性质；n n2.2.学会纯化、结晶胰蛋白酶的基本方法；学会纯化、结晶胰蛋白酶的基本方法；n n3.3.能够独立完成胰蛋白酶的活性及比活性的测能够独立完成胰蛋白酶的活性及比活性的测定。定。胰蛋白酶酶活力的测定胰蛋白酶酶活力的测定n n二、实验原理n n胰蛋白酶可以催化蛋白质的水解，化学键的催胰蛋白酶可以催化蛋白质的水解，化学键的催化水解活性的敏感性依次为：酯键化水解活性的敏感性依次为：酯键 酰胺键酰胺键 肽键。可以利用含有这些键中的任一键形的化肽键。可以利用含有这些键中的任一键形的化合物作为底物来测定胰蛋白酶的专一催化活性。合物作为底物来测定胰蛋白酶的专一催化活性。n n本实验以本实验以BAEEBAEE为底物，用紫外吸收法测定胰为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。蛋白酶活力。胰蛋白酶酶活力的测定胰蛋白酶酶活力的测定n n三、试剂和器材n n1.1.材料材料n n新鲜或速冻的猪胰脏新鲜或速冻的猪胰脏n n2.2.仪器仪器n n剪刀、镊子；绞肉机；研钵；大玻璃漏斗；布剪刀、镊子；绞肉机；研钵；大玻璃漏斗；布氏漏斗；抽滤瓶；氏漏斗；抽滤瓶；n n显微镜；纱布；恒温水浴锅；紫外分光光度计；显微镜；纱布；恒温水浴锅；紫外分光光度计；计时器；计时器；pHpH试纸。试纸。胰蛋白酶酶活力的测定胰蛋白酶酶活力的测定n n三、试剂和器材三、试剂和器材n n3.3.试剂试剂n npH2.5pH2.5乙酸酸化水；乙酸酸化水；2.5mol/L H2.5mol/L H2 2SO4SO4；5 mol/L NaOH5 mol/L NaOH；n n2 mol/L NaOH2 mol/L NaOH；2mol/L HCl2mol/L HCl；0.001 mol/L HCl0.001 mol/L HCl；硫酸铵；氯化钙。；硫酸铵；氯化钙。n n0.8 mol/L pH9.00.8 mol/L pH9.0硼酸缓冲液：取硼酸缓冲液：取20mL 0.8 mol/L20mL 0.8 mol/L硼酸溶液，加硼酸溶液，加80mL 80mL 0.2 mol/L0.2 mol/L四硼酸钠溶液，混合后，用四硼酸钠溶液，混合后，用pHpH计检查校正。计检查校正。n n0.4 mol/L pH9.00.4 mol/L pH9.0硼酸缓冲液（用硼酸缓冲液（用0.8 mol/L0.8 mol/L稀释稀释1 1倍即可）；倍即可）；n n0.2 mol/L pH8.00.2 mol/L pH8.0硼酸缓冲液：取硼酸缓冲液：取70mL 0.2 mol/L70mL 0.2 mol/L硼酸溶液，加硼酸溶液，加30mL 30mL 0.05 mol/L0.05 mol/L四硼酸钠溶液，混合后，用四硼酸钠溶液，混合后，用pHpH计校正。计校正。n n0.05 mol/L pH8.0 Tris0.05 mol/L pH8.0 TrisHCl HCl 缓冲液：取缓冲液：取50mL 0.1 mol/Ltris50mL 0.1 mol/Ltris（三羟甲（三羟甲基氨基甲烷），加基氨基甲烷），加29.2 mL 0.1mol/L HCl 29.2 mL 0.1mol/L HCl，再加水定容至，再加水定容至100mL100mL。n nBAEEBAEE底物溶液的配制：即每毫升底物溶液的配制：即每毫升0.05 mol/L pH8.0 Tris0.05 mol/L pH8.0 TrisHCl HCl 缓冲缓冲液中加液中加0.34mgBAEE0.34mgBAEE和和2.22mg2.22mg的氯化钙。的氯化钙。胰蛋白酶酶活力的测定胰蛋白酶酶活力的测定n n四、实验步骤n n（一）（一）猪胰蛋白酶制备猪胰蛋白酶制备n n1.1.猪胰蛋白酶原的提取猪胰蛋白酶原的提取n n2.2.胰蛋白酶原激活胰蛋白酶原激活n n3.3.胰蛋白酶的分离胰蛋白酶的分离n n4.4.胰蛋白酶的结晶胰蛋白酶的结晶n n5.5.胰蛋白酶的重结晶胰蛋白酶的重结晶胰蛋白酶酶活力的测定胰蛋白酶酶活力的测定n n四、实验步骤n n（二）胰蛋白酶活性的测定（二）胰蛋白酶活性的测定n n以苯甲酰以苯甲酰-L-L-精氨酸乙酯（精氨酸乙酯（BAEEBAEE）为底物，用）为底物，用紫外吸收法进行测定紫外吸收法进行测定胰蛋白酶酶活力的测定胰蛋白酶酶活力的测定n n五、注意事项n n1.1.胰脏必需是刚屠宰的新鲜组织或速冻的。胰脏必需是刚屠宰的新鲜组织或速冻的。n n2.2.在室温在室温14142020条件下条件下8 812h12h可激活完全，比可激活完全，比活性达到活性达到“3000“30004000BAEE4000BAEE单位单位/mg/mg蛋白蛋白”时时即可停止激活。即可停止激活。n n3.3.进行结晶时应十分细心地按规定条件操作。进行结晶时应十分细心地按规定条件操作。n n4.4.必须严格控制必须严格控制PHPH。n n5.5.第一次结晶时，第一次结晶时，3 35d5d后仍然无结晶，应检查后仍然无结晶，应检查pHpH，必要时调整，必要时调整pHpH，促使结晶形成。，促使结晶形成。胰蛋白酶酶活力的测定胰蛋白酶酶活力的测定n n六、思考题n n1 1提取制备猪胰蛋白酶的过程中，应特别注意提取制备猪胰蛋白酶的过程中，应特别注意哪些因素？哪些因素？n n2 2PHPH值在制备中起到什么作用？值在制备中起到什么作用？n n3 3影响晶体形成的因素有哪些？影响晶体形成的因素有哪些？n n4 4在测定酶的比活力过程中应注意哪些因素？在测定酶的比活力过程中应注意哪些因素？此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢