血清碱性磷酸酶活力测定教案资料.ppt

血清碱性磷酸酶活力测定n n酶的活力单位酶的活力单位国际单位：国际单位：KatalKatal，1s1s转化转化1mol1mol底物的酶量底物的酶量临床表示：临床表示：KingsKings，如血清谷丙转氨酶活力单位，每，如血清谷丙转氨酶活力单位，每100ml100ml血血清在清在3737。pH=7.4pH=7.4的条件下与底物作用的条件下与底物作用60min60min，生成，生成1mol1mol丙酮酸所需的酶量为丙酮酸所需的酶量为1 1个活力单位个活力单位n n酶的比活力：单位质量酶蛋白或单位体积酶制剂所含有酶酶的比活力：单位质量酶蛋白或单位体积酶制剂所含有酶活力单位数，即酶活力浓度。活力单位数，即酶活力浓度。n n酶活力的测定方法酶活力的测定方法 1.1.终止测定法（定时法或终点法）终止测定法（定时法或终点法）2.2.动力学分析法（连续监测法或速率法）动力学分析法（连续监测法或速率法）实验目的n n熟悉酶活性测定方法的一般原理n n掌握血清ALP测定原理与临床意义实验原理n n碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与之水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-4-氨基氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物，其颜色深浅与合物，其颜色深浅与ALPALP活性成正比。活性成正比。n n磷酸苯二钠磷酸苯二钠+H+H2 2O O 苯酚苯酚+磷酸氢二钠磷酸氢二钠n n苯酚苯酚+4-+4-氨基安替比林氨基安替比林 红色醌亚胺衍生物红色醌亚胺衍生物ALPpH=10铁氰化钾实验器材和试剂：n n（一）器材：（一）器材：5ml5ml移液管，移液管，1ml1ml移液管，移液管，100100或或200ul200ul微量可调式移液器，微量可调式移液器，721E721E分光光度计，分光光度计，1cm1cm比色皿，比色皿，3737 恒温水浴恒温水浴n n（二）试剂：（二）试剂：n n 1 10.1mol/L0.1mol/L碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液(pH10.0(pH10.0)称取无水碳酸钠称取无水碳酸钠6.36g6.36g，碳酸氢钠，碳酸氢钠3.36g3.36g，4-4-氨基安替比林氨基安替比林1.5g1.5g，溶于，溶于800mL800mL蒸馏水中，定容至蒸馏水中，定容至1L1L。置棕色瓶中保存。置棕色瓶中保存。n n 2 220mmol/L20mmol/L磷酸苯二钠溶液磷酸苯二钠溶液磷酸苯二钠溶液磷酸苯二钠溶液 先将先将500ml500ml蒸馏水煮蒸馏水煮沸，迅速加入磷酸苯二钠沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(2.18g(磷酸苯二钠如含磷酸苯二钠如含2 2分子结分子结晶水，则应称取晶水，则应称取2.54g)2.54g)，冷却后加氯仿，冷却后加氯仿2ml2ml防腐，在防腐，在4 4冰冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中）箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中）n n 3 3铁氰化钾的硼酸溶液铁氰化钾的硼酸溶液铁氰化钾的硼酸溶液铁氰化钾的硼酸溶液 称取铁氰化钾称取铁氰化钾2.5g2.5g，硼酸，硼酸17g17g，各自溶于蒸馏水，各自溶于蒸馏水400ml400ml中，两液混合后，加蒸馏水至中，两液混合后，加蒸馏水至1L1L，置棕色瓶中避光保存，置棕色瓶中避光保存(如出现蓝绿色即弃去如出现蓝绿色即弃去)。n n 4 4酚标准工作液（酚标准工作液（酚标准工作液（酚标准工作液（0.05mg/ml0.05mg/ml）：）：）：）：购买合格的二级购买合格的二级标准品。标准品。实验操作1.1.取试管取试管4 4支，按下表操作支，按下表操作测定管测定管标准管标准管空白管空白管对照管对照管血清（血清（mlml）0.1000.100酚标准液酚标准液0.1000.100蒸馏水蒸馏水0.1000.100pH10pH10碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液1.001.001.001.001.001.001.001.00混匀，混匀，3737水浴保温水浴保温5min5min，同时将底物预热，同时将底物预热底物液底物液1.001.001.001.001.001.001.001.00混匀，混匀，3737水浴保护水浴保护15min15min铁氰化钾溶液铁氰化钾溶液3.003.003.003.003.003.003.003.00血清血清0.1000.1002.立即混匀。在510nm波长处比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。n n计算 ALP活性=（A测定测定A对照对照）/（A标准标准A空白空白）*0.05*100(金氏单位）临床意义：血清中血清中ALPALP活力测定在临床常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床活力测定在临床常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断指标。辅助诊断指标。1 1血清血清血清血清ALPALPALPALP活性升高可能原因如下活性升高可能原因如下活性升高可能原因如下活性升高可能原因如下 ：肝胆疾病：阻塞性黄肝胆疾病：阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；骨骼疾病：由于骨骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALPALP释放进入血释放进入血液中，引起血清液中，引起血清ALPALP活性增高，如纤维性骨炎、成骨不全症、活性增高，如纤维性骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等。佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等。2 2血清血清血清血清ALPALPALPALP活性降低比较少见活性降低比较少见活性降低比较少见活性降低比较少见：主要见于呆小病、重症慢主要见于呆小病、重症慢性肾炎、乳糜泻、贫血、恶病质等。性肾炎、乳糜泻、贫血、恶病质等。注意事项1.1.目前市售的酚标准液多数为安瓿瓶，开后不能目前市售的酚标准液多数为安瓿瓶，开后不能久置久置2.2.底物液中不应含有酚，如空白管显红色，说明底物液中不应含有酚，如空白管显红色，说明磷酸苯二钠已分解，不宜使用。磷酸苯二钠已分解，不宜使用。3.3.加入铁氰化钾后必须迅速混匀，否则对实验结加入铁氰化钾后必须迅速混匀，否则对实验结果会有影响。果会有影响。标准曲线法n n制备如下：制备如下：取试管取试管6 6支，分别加酚标准液支，分别加酚标准液(1ml=0(1ml=01mg)1mg)，0 0、0.050.05、0.10.1、0.20.2、0.30.3、0.4ml0.4ml，各管，各管依次加复合基质液依次加复合基质液3.13.1、3.053.05、3.03.0、2.92.9、2.82.8、2.7ml2.7ml。混匀后。混匀后3737水浴保温水浴保温5 5分钟，各管加入分钟，各管加入1.0ml1.0ml碱性溶液，再加碱性溶液，再加0.50.5铁氰化钾铁氰化钾2.0ml2.0ml，立即，立即混匀。静置混匀。静置1010分钟，分钟，510nm510nm波长下比色。将以上波长下比色。将以上各管所得读数与其相应的碱性磷酸酶单位各管所得读数与其相应的碱性磷酸酶单位(依次为依次为0.50.5、1010、2020、3030、4040单位单位)在坐标纸上作图，绘在坐标纸上作图，绘制成标准曲线。制成标准曲线。此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢