实验三单向琼脂扩散实验.ppt

单向琼脂扩散实验江南大学微生物与免疫学实验室江南大学微生物与免疫学实验室教学对象：强化班学生教学对象：强化班学生实验课时：实验课时：3 3学时学时课程类型：专业实验课课程类型：专业实验课课程要求：必修课程要求：必修每组人数：每组人数：4 4人人实验目的与要求掌握单向琼脂扩散试验的原理、结果分析及应用 实验原理实验原理：将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，打孔，在孔中加入一定量的待测抗原，抗原向四周呈辐射状扩散，与抗体相遇，在比例合适时形成白色沉淀环。沉淀环直径的大小与抗原含量成正比，用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，从标准曲线上，可以查出待检样品中抗原的含量。本试验主要用于检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏感性很高。单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验试剂与器材试剂与器材羊抗人羊抗人IgGIgG血清血清待检人血清待检人血清标准参考血清标准参考血清pH7.4 0.01M PBSpH7.4 0.01M PBS缓冲液缓冲液琼脂粉琼脂粉载玻片、打孔器、载玻片、打孔器、3737恒温箱、湿盒、可调微量加样器等恒温箱、湿盒、可调微量加样器等；单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验实验方法标准曲线的制备标准曲线的制备1 1制作琼脂板所需要的制作琼脂板所需要的1.5%1.5%离子琼脂，首先分离子琼脂，首先分装其装其1/21/2量的量的3%3%盐水琼脂，溶化后置盐水琼脂，溶化后置5656水浴中水浴中平衡温度备用。平衡温度备用。2 2稀释抗体，用稀释抗体，用pH7.4pH7.4的的PBSPBS稀释标准抗人稀释标准抗人IgGIgG抗抗体，使最终浓度为抗体效价的一倍，其分装量应体，使最终浓度为抗体效价的一倍，其分装量应与与3%3%盐水琼脂量相等。盐水琼脂量相等。3 3制备琼脂板：将已稀释的抗人制备琼脂板：将已稀释的抗人IgGIgG抗体于抗体于5656水浴中预热，再倾注于已溶化并维持水浴中预热，再倾注于已溶化并维持5656的的3%3%盐盐水琼脂中混匀，取水琼脂中混匀，取5ml5ml即刻倾注于玻片上，待凝即刻倾注于玻片上，待凝固后即可。固后即可。4 4打孔：将琼脂板置于模板上，在同一直线上打孔：将琼脂板置于模板上，在同一直线上用打孔器打孔用打孔器打孔4 4个，孔距个，孔距10mm10mm。单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验实验方法标准曲线的制备标准曲线的制备5 5用用PBSPBS缓冲液稀释不同浓度的标准参考蛋白：浓度分别缓冲液稀释不同浓度的标准参考蛋白：浓度分别为为800mg/L800mg/L、400mg/L400mg/L、200mg/L200mg/L、100mg/L100mg/L。6 6加样：将已稀释的不同浓度的工作标准蛋白依次用微加样：将已稀释的不同浓度的工作标准蛋白依次用微量加样器每孔加入量加样器每孔加入10ul10ul。（注意：每一稀释度均应更换塑（注意：每一稀释度均应更换塑料吸头）料吸头）。7 7将加样的琼脂板放湿盒中，置将加样的琼脂板放湿盒中，置3737温箱，温箱，2424小时后观小时后观察结果。察结果。8 8用尺子测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为用尺子测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量（单位纵座标，以标准参考蛋白量（单位/ml/ml）为横座标，绘制）为横座标，绘制成标准曲线。成标准曲线。单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验实验方法人血清中人血清中IgGIgG正常值的测定：正常值的测定：1 1将已制备好的抗体琼脂板置于打孔将已制备好的抗体琼脂板置于打孔模板上，每一琼脂板可打孔模板上，每一琼脂板可打孔2 2个。个。2 2取正常人血清，用取正常人血清，用PBSPBS做做1:41:4稀释。稀释。3.3.用微量加样器分别取稀释后人血清用微量加样器分别取稀释后人血清标本标本1010l l加入孔中，每份各加两孔。加入孔中，每份各加两孔。4.4.作好标记放湿盒中，置作好标记放湿盒中，置3737温箱，温箱，2424小时后观察结果。小时后观察结果。单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验结果计算结果计算分别量取各孔样品沉淀环的直径，根据提供的参考标准曲线，计算待检血清中各种免疫球蛋白的含量成人血清中IgG范围 7001660mg/L单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验实验结果单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验实验结果单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验注意事项：注意事项：制备抗体琼脂板时，琼脂温度必须严格控制，温度太低琼脂会凝固，太高则会影响抗体的活性；加样孔内的琼脂应挑干净，切不可损坏孔的边缘，确保每孔的液面基本一致；加样量一定要精确，并且不能逸出孔外，否则结果不好观察；加样时，吸取每份标本均应更换塑料吸头；实际检测过程中，标准曲线必须与样品测定同时制备；孵育时间应控制在2448小时，时间太短可能产生不了沉淀线，时间太长会造成沉淀线的扩散。单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验