实验二基因克隆.ppt
实验二实验二 基因克隆（一）基因克隆（一）基因组基因组DNA的提取和限制性内切酶酶切分析的提取和限制性内切酶酶切分析实验目的目的掌握基因组DNA制备的原理和方法了解DNA限制性内切酶作用特点和酶切消化的操作步骤实验原理原理1.基因组基因组DNA的提取和纯化的提取和纯化 真核生物染色体DNA组装不同层次的结构核酸分离、纯化原则核酸分离、纯化原则保持核酸分子一级结构的完整性；保持核酸分子一级结构的完整性；排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 ；无杂核酸分子的污染（如纯化无杂核酸分子的污染（如纯化DNADNA分子时分子时应去除应去除RNARNA分子）；分子）；基因基因组DNA制制备的基本思路的基本思路匀浆组织，破碎细胞去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子沉淀核酸去除盐类、有机溶剂等杂质纯化干燥溶解蛋白酶蛋白酶K和和SDS破碎细胞破碎细胞 在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分子分离，EDTA抑制细胞中DNase活性，蛋白酶K将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。酚酚/氯仿抽提去除与氯仿抽提去除与DNA结合的蛋白质结合的蛋白质 酚是很强的蛋白质变性剂，氯仿能加速有机相与水相分离，溶解去除残留的酚，且可以去除蔗糖等，在氯仿中加入少量异戊醇可减少蛋白质变性过程中产生的大量气泡。乙醇和醋酸钾沉淀核酸乙醇和醋酸钾沉淀核酸 核酸为水溶性，在有机溶剂和高盐存在下，核酸在水中的稳定性被破坏，呈不溶状态而沉淀下来。注意事项注意事项l尽量在尽量在低温低温下进行操作；下进行操作；l避免物理因素对核酸的避免物理因素对核酸的机械剪切机械剪切；l防止过酸、过碱引起核酸降解，控制防止过酸、过碱引起核酸降解，控制pHpH值范围（值范围（pHpH值值5-5-9 9），并要保持一定离子强度；），并要保持一定离子强度；l防止核酸的生物降解；防止核酸的生物降解；细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。因此，所用器械和一些试剂需酯键，破坏核酸一级结构。因此，所用器械和一些试剂需高温灭菌高温灭菌，提取缓冲液中需加，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂核酸酶抑制剂。进行核酸分离时最好进行核酸分离时最好新鲜新鲜生物组织或细胞样品，若不生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70-70冰箱中。冰箱中。2.DNA2.DNA限制性内切酶酶切分析限制性内切酶酶切分析基基因因工工程程pUC18的酶切图谱DNADNA的限制性内切酶酶的限制性内切酶酶一类能识别双链一类能识别双链DNADNA中特定碱基顺序的核酸水解酶；中特定碱基顺序的核酸水解酶；来源于原核生物，功能类似高等动物的免疫系统，来源于原核生物，功能类似高等动物的免疫系统，用用于抗击外来的侵袭；于抗击外来的侵袭；水解核酸链中的磷酸二酯键；水解核酸链中的磷酸二酯键；限制性内限制性内切酶切酶酶分子酶分子识别位点识别位点切割位点切割位点 限制作用限制作用是否需用是否需用 ATPATP类类 三三亚亚基基双双功能酶功能酶 二二分分非非对对称称至至少少在在识识别别位位点点外外 1000bp1000bpYesYes类类内内切切酶酶与与甲甲基基化化酶酶分分子子不不在在一起一起4-6bp,4-6bp,大大多多数数为为回回文文对对称称结结构构 在在识识别别位位点点中中或或靠靠近近识识别别位位点点无无特特异异性性NoNo类类二二亚亚基基双双功能酶功能酶 5-75-7 bp bp 非非对称对称在在识识别别位位点点下下游游 24-24-26bp26bpYesYes限制性内切酶可分为三类限制性内切酶可分为三类类限制性内切酶类限制性内切酶类类酶酶切切割割位位点点在在识识别别序序列列中中，有有的的在在对对称称轴轴处处切切割割,产产生生平平末末端端的的DNADNA片片段段(如如Sma:Sma:5-CCCGGG-5-CCCGGG-3)3)；有有的的切切割割位位点点在在对对称称轴轴一一侧侧，产产生生带带有有单单链链突突出出末末端端的的DNADNA片片段段称称粘粘性性末末端端，如如EcoREcoR切切割割识识别别序序列列后后产生两个互补的粘性末端。产生两个互补的粘性末端。5GAATTC3 5 G AATTC3 5GAATTC3 5 G AATTC3 3CTTAAG 5 3 CTTAA G5 3CTTAAG 5 3 CTTAA G5 限制性核酸内切酶的命名法限制性核酸内切酶的命名法用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称。的物种名称。用一个字母代表菌株或型；用一个字母代表菌株或型；如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，饰酶，则以罗马数字表示，例子例子HinHind d：流感嗜血菌：流感嗜血菌(Heamophilus(Heamophilus influenzae)Rdinfluenzae)Rd菌株用菌株用d d，第三个发现的酶称为。，第三个发现的酶称为。实验注意事项实验注意事项1.1.限限制制性性内内切切酶酶用用量量可可按按标标准准体体系系1g 1g DNADNA加加1 1单单位位酶酶，消消化化1-2h1-2h。但但要要完完全全酶酶解解则则必必须须增增加加酶酶的的用用量量，一一般般增增加加2-32-3倍倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。甚至更多，反应时间也要适当延长。2.2.酶酶切切时时所所加加的的DNADNA溶溶液液体体积积不不能能太太大大，否否则则DNADNA溶溶液液中中其其他成分会干扰酶反应。他成分会干扰酶反应。3.3.许许多多实实验验制制备备的的DNADNA不不易易于于降降解解，需需适适当当增增加加酶酶的的使使用用量量。反反应应液液中中加加入入过过量量的的酶酶是是不不合合适适的的，除除考考虑虑成成本本外外，酶酶液液中的微量杂质可能干扰随后的反应。中的微量杂质可能干扰随后的反应。4.4.市市场场销销售售的的酶酶一一般般浓浓度度很很大大，为为节节约约起起见见，使使用用时时可可事事先先用用酶酶反反应应缓缓冲冲液液（11）进进行行稀稀释释。另另外外，酶酶通通常常保保存存在在50%50%的的甘甘油油中中，实实验验中中，应应将将反反应应液液中中甘甘油油浓浓度度控控制制在在1/101/10之下，否则酶活性将受影响。之下，否则酶活性将受影响。电泳检测示例电泳检测示例实验步骤实验步骤10*NE Buffer2uL 质粒粒DNA2uL XbaI0.5uL Sal I0.5uL H2O13uL 10*BSA2uL Total20uL1.混匀试剂：混匀试剂：2.37度水浴度水浴2小时；小时；3.1%琼脂糖凝胶电泳观察；琼脂糖凝胶电泳观察；注：质粒浓度注：质粒浓度酶切质粒：全长酶切质粒：全长4.5kb，酶切后分别为，酶切后分别为2.7kb+1.8kb；
