单克隆抗体精.ppt
单克隆抗体第1页，本讲稿共49页细 胞 融 合细胞工程的诞生细胞工程的诞生第2页，本讲稿共49页融合细胞的制备融合细胞的制备第3页，本讲稿共49页诱导细胞融合的主要方法诱导细胞融合的主要方法1.病毒诱导融合病毒诱导融合2.化学融合剂诱导融合化学融合剂诱导融合 其中最常用的是聚已二醇（聚已二醇（PEG）3.电融合电融合第4页，本讲稿共49页病毒诱导融合病毒诱导融合第5页，本讲稿共49页脂质体诱导融合脂质体诱导融合第6页，本讲稿共49页电融合（视频）电融合（视频）是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。第7页，本讲稿共49页5.1 5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术19841984年诺贝尔奖年诺贝尔奖第8页，本讲稿共49页Monoclonal Antibody：McAbDefinition:Mono:OneClone:A strain of cells descended form a single cellAntibody:A molecule of animal origin that has immunolgical activity only against the antigen to which it was made第9页，本讲稿共49页5.1.1 5.1.1 单克隆抗体技术的原理单克隆抗体技术的原理单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的与单一抗纯一的单克隆细胞系而产生的与单一抗原决定簇结合的抗体。原决定簇结合的抗体。第10页，本讲稿共49页Adapted from Milstein(1980)Scientific American,Oct.p.581234mmmm12341234单克隆抗体单克隆抗体细胞融合细胞融合取出脾细胞取出脾细胞+癌细胞癌细胞x传统抗血清传统抗血清（多克隆抗体）（多克隆抗体）抗原抗原免疫免疫1 23412341 234B B细胞细胞抗原免疫小鼠後，其脾臟會產生分泌抗體的各種 B 細胞。每種 B 細胞只能分泌一種抗體，對抗各自的抗原決定基。傳統抗血清便是所有抗體的混合，得以有效保護動物個體。假如能够把单一 B 细胞挑出来培养，则可收获单抗。但是，B 细胞无法常规培养。癌細胞可以在試管中持續培養生長，但無法產生所要的抗體。这些单独的融合细胞可以大量生产单一种抗体，即单克隆抗体。若把 B 细胞与癌细胞融合，所得到的融合细胞可分别培养。第11页，本讲稿共49页第12页，本讲稿共49页制制备备过过程程：视视频频第13页，本讲稿共49页Immunize the mice-Housing第14页，本讲稿共49页Immunize the mice-Inoculation第15页，本讲稿共49页How Lymphocytes Produce Antibody第16页，本讲稿共49页Test the serum-Bleeding the miceBlood is drawn into the tube.A capillary tube is applied to nicked vein.第17页，本讲稿共49页Test the serum-In the Lab/ELISA第18页，本讲稿共49页Perform a fusion-Growing the cells(hybridomas)Fusions are performed in a Biosafety Cabinet.Cells are grown in 96-well plates.第19页，本讲稿共49页Grow the hybridomas第20页，本讲稿共49页Concentrate and Purify the Product第21页，本讲稿共49页5.2 5.2 人源性单克隆抗体的制备人源性单克隆抗体的制备多克隆抗体多克隆抗体鼠源单克隆抗体鼠源单克隆抗体人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体人源化抗体人源化抗体全人源抗体全人源抗体第22页，本讲稿共49页鼠源单抗临床应用的障碍鼠源单抗临床应用的障碍血清半衰期短，血清半衰期短，20h抗原抗体结合力、亲和力不够抗原抗体结合力、亲和力不够募集效应细胞产生副作用募集效应细胞产生副作用HAMA反应：反应：810天出现，天出现，2030天高峰天高峰,加速单抗清除。加速单抗清除。过敏休克过敏休克第23页，本讲稿共49页HAMA反应反应Human Anti-Mouse Antibodies 鼠来源的单抗在人体内是外源物质，很可能鼠来源的单抗在人体内是外源物质，很可能会产生人体免疫系统对它的排斥反应：产会产生人体免疫系统对它的排斥反应：产生抗鼠的抗体，叫做人抗鼠抗体生抗鼠的抗体，叫做人抗鼠抗体（HAMA）反应。）反应。HAMA反应对鼠源的单抗分子有着较强的反应对鼠源的单抗分子有着较强的破坏作用，严重影响了鼠源单抗在人体内破坏作用，严重影响了鼠源单抗在人体内的功效，所以非常有必要改进鼠源单抗。的功效，所以非常有必要改进鼠源单抗。第24页，本讲稿共49页5.2 5.2 人源性单克隆抗体的制备人源性单克隆抗体的制备5.2.1 EB 病毒转化技术病毒转化技术5.2.2 细胞工程单克隆抗体技术细胞工程单克隆抗体技术l1 人人-鼠杂交瘤单克隆抗体鼠杂交瘤单克隆抗体l2 人人-人杂交瘤单克隆抗体人杂交瘤单克隆抗体l3 EB 病毒转化病毒转化-融合技术融合技术l4 转基因动物制备单克隆抗体转基因动物制备单克隆抗体l5 重症联合免疫缺陷小鼠制备单克隆抗体重症联合免疫缺陷小鼠制备单克隆抗体5.2.3 人单抗制备技术的发展人单抗制备技术的发展（新基因工程技术新基因工程技术）第25页，本讲稿共49页5.2.1 EB 病毒转化技术病毒转化技术EB病病毒毒（epstein-barr virus,EBv）是是epstein和和barr于于1964年年首首次次成成功功地地将将burkitt非非洲洲儿儿童童淋淋巴巴瘤瘤细细胞胞通通过过体体外外悬悬浮浮培培养养而而建建株株，并并在在建建株株细细胞胞涂涂片片中中用用电电镜镜观观察察到到疱疱疹疹病病毒毒颗颗粒粒，故故名名。EB病毒的形态与其他疱疹病毒相似病毒的形态与其他疱疹病毒相似。EB病病毒毒仅仅能能在在B淋淋巴巴细细胞胞中中增增殖殖，可可使使其其转转化化，能长期传代。能长期传代。第26页，本讲稿共49页EBEB病毒转化淋巴细胞病毒转化淋巴细胞第27页，本讲稿共49页5.2.2 5.2.2 细胞工程单克隆抗体技术细胞工程单克隆抗体技术1 人人-鼠杂交瘤单克隆抗体鼠杂交瘤单克隆抗体人脾细胞鼠骨髓瘤细胞人脾细胞鼠骨髓瘤细胞第28页，本讲稿共49页5.2.2 5.2.2 细胞工程单克隆抗体技术细胞工程单克隆抗体技术2 2 人人-人杂交瘤单克隆抗体人杂交瘤单克隆抗体人脾细胞人骨髓瘤细胞人脾细胞人骨髓瘤细胞细胞种类少细胞种类少第29页，本讲稿共49页5.2.2 5.2.2 细胞工程单克隆抗体技术细胞工程单克隆抗体技术3 EB 3 EB 病毒转化病毒转化-融合技术融合技术利用利用EB病毒转化病毒转化B淋巴细胞为永生细胞淋巴细胞为永生细胞 与鼠骨髓瘤细胞融合与鼠骨髓瘤细胞融合第30页，本讲稿共49页5.2.2 5.2.2 细胞工程单克隆抗体技术细胞工程单克隆抗体技术4 4 转基因动物制备单克隆抗转基因动物制备单克隆抗体体人抗体基因人抗体基因(除除CDR)导入小鼠胚胎导入小鼠胚胎转基因小鼠转基因小鼠抗原免疫抗原免疫标准杂交瘤方法标准杂交瘤方法第31页，本讲稿共49页转入人的转入人的Ig基因组基因组免疫动物人抗体基因敲除小鼠基因敲除小鼠将小鼠将小鼠Ig基因敲除，转染人基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体大量完全人源化抗体第32页，本讲稿共49页5.2.2 5.2.2 细胞工程单克隆抗体技术细胞工程单克隆抗体技术5 5 重症联合免疫缺陷小鼠制备单克隆抗体重症联合免疫缺陷小鼠制备单克隆抗体SCID:severe combined immunodeficiency mouse 既无有功能的既无有功能的T细胞也无细胞也无B细胞的小鼠细胞的小鼠,对异源对异源移植物不产生任何排斥反应移植物不产生任何排斥反应,可以作为良好的可以作为良好的载体系统用于医学及生物学各个领域的研究载体系统用于医学及生物学各个领域的研究,但极易感染病菌但极易感染病菌,饲养和操作管理十分复杂饲养和操作管理十分复杂。第33页，本讲稿共49页SCID第34页，本讲稿共49页将人淋巴细胞移植到体内将人淋巴细胞移植到体内第35页，本讲稿共49页重症联合免疫缺陷小鼠制备单克隆抗体重症联合免疫缺陷小鼠制备单克隆抗体将人淋巴细胞移植到小鼠体内将人淋巴细胞移植到小鼠体内抗原免疫抗原免疫标准杂交瘤方法或制备抗体库标准杂交瘤方法或制备抗体库第36页，本讲稿共49页裸裸 鼠鼠T淋巴细胞功能缺陷淋巴细胞功能缺陷1962年偶然发现有个别无毛小鼠，年偶然发现有个别无毛小鼠，后来证实是由后来证实是由于基因突变造成的并伴有先天性胸腺发育不良，于基因突变造成的并伴有先天性胸腺发育不良，称为裸小鼠称为裸小鼠(nude mice)，用，用“nu”表示裸基因符表示裸基因符号。裸小鼠是由于染色体上等位基因号。裸小鼠是由于染色体上等位基因(第第11对染对染色体上色体上)突变引起的，已失去正常胸腺。突变引起的，已失去正常胸腺。第37页，本讲稿共49页特特 性性裸小鼠的主要特征表现为无毛裸小鼠的主要特征表现为无毛(hair less)和无胸腺和无胸腺(athymus)。随着鼠龄增。随着鼠龄增加皮肤变薄、头颈部皮皱褶、发育迟缓。由于无胸腺加皮肤变薄、头颈部皮皱褶、发育迟缓。由于无胸腺,仅有胸腺残迹或仅有胸腺残迹或异常上皮异常上皮,这种上皮不能使这种上皮不能使T细胞正常分化，缺乏成熟细胞正常分化，缺乏成熟T细胞的辅助、抑制细胞的辅助、抑制及杀伤功能，因而细胞免疫力低下。裸小鼠及杀伤功能，因而细胞免疫力低下。裸小鼠B淋巴细胞正常，但功淋巴细胞正常，但功能欠正常能欠正常第38页，本讲稿共49页饲饲 养养第39页，本讲稿共49页5.2.3 人单抗制备技术的发展人单抗制备技术的发展（基因工程）（基因工程）人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体改型抗体改型抗体组合抗体库技术与噬菌体抗体文库技术组合抗体库技术与噬菌体抗体文库技术表位印模选择技术表位印模选择技术CDR移植移植第40页，本讲稿共49页小小 结结人源抗体制备技术日臻成熟，全分子人抗体人源抗体制备技术日臻成熟，全分子人抗体研究具有诱人的前景，临床应用有望进一步研究具有诱人的前景，临床应用有望进一步扩大，我国在抗体工程研究中应注重原创性，扩大，我国在抗体工程研究中应注重原创性，力争在国际竞争中占有一席之地。力争在国际竞争中占有一席之地。第41页，本讲稿共49页利用基因工程技术，将人抗体可变区（利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互）中互补决定簇（补决定簇（CDR）序列改换成鼠源单抗）序列改换成鼠源单抗CDR序序列制备的人源化抗体称为：列制备的人源化抗体称为：A:人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体B:改型抗体改型抗体 C:组合抗体组合抗体D:表位印模选择抗体表位印模选择抗体第42页，本讲稿共49页5.3 5.3 单克隆抗体在医学上的应用单克隆抗体在医学上的应用（一）用作诊断试剂（一）用作诊断试剂 1.检测淋巴细胞表面分子，区分不同分化阶段的淋巴检测淋巴细胞表面分子，区分不同分化阶段的淋巴细胞，鉴别淋巴细胞。细胞，鉴别淋巴细胞。2.鉴定病原体，准确诊断传染病。鉴定病原体，准确诊断传染病。3.用于肿瘤的诊断和分型。用于肿瘤的诊断和分型。4.激素类单抗用于测定体内激素含量，判激素类单抗用于测定体内激素含量，判 断内分泌的功能状态。断内分泌的功能状态。第43页，本讲稿共49页（二）用作研究工具（二）用作研究工具1.纯化抗原纯化抗原2.分析和探查抗原结构分析和探查抗原结构3.分析抗原决定簇分子的功能分析抗原决定簇分子的功能（三）用于疾病的治疗（三）用于疾病的治疗1.抗细胞表面分子单抗，用于移植排斥反应的防治抗细胞表面分子单抗，用于移植排斥反应的防治2.抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗3.抗肿瘤单抗用于肿瘤的导向治疗抗肿瘤单抗用于肿瘤的导向治疗第44页，本讲稿共49页生物导弹生物导弹“生物导弹生物导弹”单克隆抗体作载体单克隆抗体作载体携带药物，使药物准确地到达癌细胞，携带药物，使药物准确地到达癌细胞，以避免化疗或放射疗法把正常细胞与以避免化疗或放射疗法把正常细胞与癌细胞一同杀死的副作用。癌细胞一同杀死的副作用。第45页，本讲稿共49页New approaches:Theres hope for the future.第46页，本讲稿共49页单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题单克隆抗体的特异性单克隆抗体的特异性 由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应特异性的单抗，对正常组织有交叉反应异种抗体反应异种抗体反应 鼠源性单抗用于人体，导致异源性超敏反应鼠源性单抗用于人体，导致异源性超敏反应第47页，本讲稿共49页1)简介鼠源性单克隆抗体制备的原理，并绘图说简介鼠源性单克隆抗体制备的原理，并绘图说明其操作流程明其操作流程2)简介单克隆抗体的应用简介单克隆抗体的应用3)为什么要对鼠源性单克隆抗体进行改造使之人为什么要对鼠源性单克隆抗体进行改造使之人源化，改造的方法有那些？源化，改造的方法有那些？思考题思考题Monoclonal Antibodysevere combined immunodeficiency mouse 第48页，本讲稿共49页谢 谢!下节课下节课:胚胎工程胚胎工程第49页，本讲稿共49页
