第四章发酵工艺控制优秀课件.ppt

第四章发酵工艺控制第1页，本讲稿共117页第一节 发酵生产方法的类型 发酵过程状态：1、间歇：（1）培养基加入和发酵液放出是一致的；（2）发酵一次一次进行。2、连续：（1）培养液加入到放出是连续的；（2）培养罐中处于稳定状态。3、半连续发酵：培养基连续加入发酵液分批或分别放出 IIIIII 整个系统培养液连续加入，但各罐的发酵液分别放出。第2页，本讲稿共117页一、分批发酵一、分批发酵1、分批发酵的定义是指在一封闭系统内含有初始限量基质的发酵方式。在这一过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何其它物质。发酵过程中培养基成分减少，微生物得到繁殖。2、分批发酵的特点微生物所处的环境在发酵过程中不断变化，其物理，化学和生物参数都随时间而变化，是一个不稳定的过程。第3页，本讲稿共117页3、分批发酵的优缺点优点：操作简单；操作引起染菌的概率低。不会产生菌种老化和变异等问题缺点：非生产时间较长、设备利用率低。第4页，本讲稿共117页典型的分批发酵工艺流程典型的分批发酵工艺流程第5页，本讲稿共117页二、补料分批发酵二、补料分批发酵1、定义 补料分批发酵又称半连续发酵或流加分批发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。2、补料分批发酵的优缺点优点优点：使发酵系统中维持很低的基质浓度；和连续发酵比、不需要严格的无菌条件；不会产生菌种老化和变异等问题。缺点缺点：存在一定的非生产时间；和分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险。第6页，本讲稿共117页3、补料分批发酵的类型按补料方式不同可分为：（1）连续流加（2）不连续流加（3）多周期流加按补料成分的不同可分为：（1）单一组分流加（2）多组分流加按控制方式的不同可分为：（1）反馈控制（2）无反馈控制第7页，本讲稿共117页三、连续发酵三、连续发酵1、定义培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的相同体积发酵液，使发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的pH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长的发酵方式。第8页，本讲稿共117页连续发酵的优缺点优点优点：能维持低基质浓度；可以提高设备利用率和单位时间的产量；便于自动控制。缺点缺点：菌种发生变异的可能性较大；要求严格的无菌条件。第9页，本讲稿共117页第二节 发酵过程的动力学类型反应 化学因素 则化学反应动力学酶酶反应动力学 发酵：1、速度：表征是什么？几个表征间关系；2、影响因素：其如何影响，怎样控制这些因素现主要讨论第1个问题将培养基灭菌，加入菌种，在一定容器中发酵，将其动态变化画成曲线，此为发酵曲线图所以影响因素为：a 基质中糖或碳源 b 菌种 c 产物 从此三个因素分析发酵速度。第10页，本讲稿共117页一、分批发酵一、分批发酵1、分批发酵的定义是指在一封闭系统内含有初始限量基质的发酵方式。在这一过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何其它物质。发酵过程中培养基成分减少，微生物得到繁殖。2、分批发酵的特点微生物所处的环境在发酵过程中不断变化，其物理，化学和生物参数都随时间而变化，是一个不稳定的过程。第11页，本讲稿共117页发酵曲线图第12页，本讲稿共117页从此三个因素分析发酵速度。所以研究发酵速度就是研究 1碳源利用速度 2菌生长速度 3产物形成速度 4上述三者之间关系根据以上四个条件将所有发酵过程分为三大类型第13页，本讲稿共117页发酵过程分为三大类型第14页，本讲稿共117页（一）类型I第15页，本讲稿共117页（一）类型I 1、特点菌生长比速度C、P都有一个高峰三者的高峰同时出现，三者基本平行产物的量和碳源利用量有一定的代学剂量关系可进行理论计算。2、产物类型 此一类型产物主要有两大类：菌体 产量常数在一定条件下，用一定菌体产量常数相对稳定。故知产量常数可控制流加糖的量，还可利用产量常数检查，发酵条件的控制是否合适。代谢产物：酵母的酒精发酵、乳酸发酵 另部分次级代谢产物也属此型，但大多数属类型III 次级代谢产物，杆菌肽、氯霉素。第16页，本讲稿共117页（一）类型I 乳酸发酵第17页，本讲稿共117页（一）类型I 乳酸发酵第18页，本讲稿共117页（一）类型I 杆菌肽发酵第19页，本讲稿共117页（二）类型II 第20页，本讲稿共117页（二）类型II 1特点：分成两个时期：菌体生长和产物形成在不同时期，分别在菌生长期产物形成期。碳源利用的比速度有两个高峰，分别在两个时期，第一个高峰用于菌体生长，第二个高峰用于产物合成（在产物形成期可能还有菌体第二次生长）。碳源利用和产物形成无明确的化学剂量关系，但还是有一定关系的。2、产物类型有中间产物积累：产物在合成过程中先积累一定产物，再由中间产物转化为最终产物。如丙酮丁醇发醇，丙酮丁醇发酵分为三个时期。第21页，本讲稿共117页增酸期：018h 有机酸大量积累，菌体大量生长 产物溶剂形成少减酸期：1840h菌体长到最大期，溶剂就大量形成，培养液中pH值上升后发醇：4072h 菌体不增长，甚至有些下降，溶剂增长到最大值，酸降低到最小值。无中间产物积累如：延胡索酸发酵 用黑根霉 谷氨酸发酵 用棒状杆菌 柠檬酸发酵 用黑曲霉 土霉素发酵 金色链霉菌（四环类抗生等）土霉素生产因其菌生长，C利用有两个高峰而划入型，产物产量较高。第22页，本讲稿共117页（三）类型第23页，本讲稿共117页 （三）类型1.特点：分成两个时期，但产物形成比类型早，在菌体接近或达到最大值时，产物开始生长。菌体生长和碳源利用没有第二个高峰。产物的形成和碳源利用无量上的关系，都是属于次级代谢产物，产物量占发酵液中的0.12%。链霉素发酵(用灰色链霉菌生产)2、产物类型:分为三种类型，知道发酵的类型将预知某个发酵将按什么情况进展可作为发酵的中间控制的理论基础，在实践上指导生产监督生产，如控制流加糖。根据菌体生产和产物形成是否同步的，可控制不同的发酵条件，如、型可在不同时期，为不同目的（菌体或产物），控制不同发酵条件，从营养上说，生长的营养条件和产物的营养条件有区别。在连续发酵的设计上，类型可用单级，如为类型、就要采用二级以上的连续发酵，使菌体生长和产物形成都得到保证。第24页，本讲稿共117页（三）类型 链霉素发酵（用灰色链霉素生产）第25页，本讲稿共117页第三节 连续发酵动力学一、控制方法1、恒浊法：根据培养液的浊度与菌的浓度成正比，通过一种仪器（如光电效应）控制菌的流量，使菌的浓度保持一致，在此培养基的各种养料是充足过量的，菌都在最大生长速度，菌浓度被控制，适用于动力学类型。2、恒化法：培养基中有一种可限制菌的生长速度，此为限制性基质，如培养基中糖的含量很低，还可用氨基酸，无机氮等而别的成分不是过量的，培养基的流量一定，这种方法，菌的生长速度不是在最大生长速度，以此控制菌的浓度一定，采用这种方法适于动力学、型。第26页，本讲稿共117页二、动力学下面以多罐，开放式（相对于菌体截留的密闭式）混合均匀为例F 流量 L/hX 菌浓度 g/LS 基质浓度 g/LP 产物浓度 g/L每一罐流量一样为F要保持连续发酵系统的稳定第27页，本讲稿共117页1.菌的情况 流入量十生长菌量=流出菌量 即：第28页，本讲稿共117页第29页，本讲稿共117页3、对基质情况同理 Yx/s为以消耗基质基准的菌生长得率常数。将其代(3-6)第30页，本讲稿共117页第31页，本讲稿共117页 对单级罐而言 根据Michadis-mentem公式第32页，本讲稿共117页 饱和常数 ,为1/2 时基质浓度 为最大比生长速率 Monod公式第33页，本讲稿共117页第34页，本讲稿共117页第35页，本讲稿共117页第36页，本讲稿共117页第37页，本讲稿共117页三、连续发酵优点：1、提高了生产率，一般至少几倍至十多倍。原因提高了发酵罐的利用率，其表示用两种：生产单位重量的产品每日所需发酵罐的立方米。或单位积的发酵罐每日生产的产品重量。减少菌的非旺盛生长期2、便于管理控制由于上面原因，生产成本大大降低，水、电、气平衡易于控制。第38页，本讲稿共117页四、存在的问题1、理论上：菌体生长与产物形成的关系，最适D、最适菌浓度的掌握理论上的推导不 完全符合实际生产。2、退化与变异：连续发酵时间越长越好，但许多菌会发生退化，表现在生产能力上退 化，合成产物上发生变换。解决方法，更换 菌种或种子。3、染菌问题：要解决之，对设备严密度、无菌操作 严格，及好气气体供给。4、均匀度：与输送能否顺利进行，主要是丝状菌。第39页，本讲稿共117页第四节 温度对发酵的影响及其控制温度是保证酶活性的重要条件，因此在发酵系统中，必须保证稳定而合适的温度环境。一、影响发酵温度的因素。（1）产热因素：生物热和搅拌热。（2）散热因素：蒸发热和辐射热。发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。第40页，本讲稿共117页生物热：定义定义：生物热是生产菌在生长繁殖时产生的大量热量。培养基中碳水化合物，脂肪，蛋白质等物质被分解为CO2,NH3时释放出的大量能量。用途用途：合成高能化合物，供微生物生命代谢活动，热能散发。影响生物热的因素影响生物热的因素：生物热随菌株，培养基，发酵时期的不同而不同。一般，菌株对营养物质利用的速率越大，培养基成分越丰富，生物热也就越大。发酵旺盛期的生物热大于其他时间的生物热。生物热的大小还与菌体的呼吸强度有对应关系。实验发现抗生素高产量批号的生物热高于低产量批号的生物热。说明抗生素合成时微生物的新陈代谢十分旺盛。第41页，本讲稿共117页第42页，本讲稿共117页 发酵过程中生物热的变化在四环素发酵中，还发现生物热和菌的呼吸强度的变化有对应关系，特别是在80小时以前。从此实验中还可看到，当产生的生物热达到高峰时，糖的利用速度也最大。另外也有人提出，可从菌体的耗氧率来衡量生物热的大小。四环素生物合成过程中系列参数的动态变化过程1：效价；2：呼吸强度；3：生物热；4：糖浓度第43页，本讲稿共117页搅拌热定义定义：通风发酵都有大功率搅拌，搅拌的机械运动造成液体之间，液体与设备之间的摩擦而产生的热。搅拌热的计算搅拌热的计算：Q搅拌=3600（P/V）式中 3600：热功当量（kJ/（kW.h）（P/V）：通气条件下单位体积发酵液所消耗的功率（kW/m3）第44页，本讲稿共117页蒸发热定义定义：通入发酵罐的空气，其温度和湿度随季节及控制条件的不同而有所变化。空气进入发酵罐后，就和发酵液广泛接触进行热交换。同时必然会引起水分的蒸发；蒸发所需的热量即为蒸发热。蒸发热的计算蒸发热的计算：Q蒸发=G（I2-I1）式中 G：空气流量，按干重计算，kg/h I2、I1：进出发酵罐的空气的热焓量，J/kg（干空气）（4）辐射热定义定义：由于发酵罐内外温度差，通过罐体向外辐射的热量。辐射热的计算辐射热的计算：辐射热可通过罐内外的温差求得，一般不超过发酵热的5%。第45页，本讲稿共117页3，发酵热的测定（1）通过测定一定时间内冷却水的流量和冷却水进出口温度，由下式求得这段时间内的发酵热。（2）通过罐温的自动控制，先使罐温达到恒定，再关闭,自控装置测得温度随时间上升的速率S，按下式可求得发酵热：第46页，本讲稿共117页第47页，本讲稿共117页二、温度对微生物影响。分为嗜冷菌，嗜中温菌，嗜热菌生长活化能2533 KJ/mol小于死亡的活化能104122KJ/mol死亡速率比生长速度对温度更敏感三、温度对发酵影响温度低，反应速度低，周期长温度高，反应速度快，但菌易衰老，影响产量。菌合成与产物合成温度要求不同。第48页，本讲稿共117页温度通过以下方式影响发酵过程（1）影响各种酶的反应速率和蛋白质性质（2）影响发酵液的物理性质（3）影响生物合成的方向。例如，四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金霉素。在低于30温度下，该菌种合成金霉素能力较强。当温度提高，合成四环素的比例也提高。在温度达35则只产生四环素而金霉素合成几乎停止。第49页，本讲稿共117页发酵过程中，微生物生长速率变化 dX/dt=X-X 式中 ：比生长速率 ：比死亡速率当处于生长状态时，可忽略。与 与温度有关根据Arrenhnius公式=Ae-E/RT=Ae-E/RT通常E大于E，所以 比 对温度变化更为敏感。第50页，本讲稿共117页例：青霉菌生产青霉素青霉菌生长活化能E=34kJ/mol青霉素合成活化能E=112kJ/mol青霉素合成速率对温度较敏感，温度控制相当重要。第51页，本讲稿共117页五、最适温度的确定在发酵过程中，最适温度是一种相对概念，是指在该温度下最适于菌的生长或发酵产物的生成。最适发酵温度与菌种，培养基成分，培养条件和菌体生长阶段有关。最适发酵温度的选择：在发酵的整个周期内仅选一个最适培养温度不一定好。温度的选择要参考其它发酵条件。温度的选择还应考虑培养基成分和浓度六、温度的控制发酵罐：夹套（10M3以下）盘管（蛇管）（10M3以上）第52页，本讲稿共117页第五节 微生物的耗氧与氧的供给大多数发酵过程是好氧的，因此需要供氧。如果考虑呼吸的化学计量，则葡萄糖的氧化可由下式表示：C6H 12O6 十6O26H2O十6CO2 只有当这两种反应物均溶于水后，才对菌体有用。氧在水中的溶解度比葡萄糖要小约6000倍左右(氧在水中的饱和度约为l0mg/L)。许多发酵的生产能力受到氧利用限制，因此氧成为影响发酵效率的重要因素。第53页，本讲稿共117页第54页，本讲稿共117页谷氨酸发酵氧供应要适量合理供氧 一、微生物的需氧量，即微生物的耗氧量，Oxypen consumcd微生的耗氧量用：1、耗氧速率来表示单位体积的培养液在单位时间的耗氧量叫耗氧速率（r）单位 毫摩分子/升小时 mM/lh耗氧速率与培养液中微生物的呼吸强度和细胞浓度有关第55页，本讲稿共117页实例一实例一在对黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)生物合成氨基酸进行研究时发现，溶氧浓度对相关的氨基酸的生物合成具有很大的影响。研究表明：菌体的临界溶氧浓度为0.01mg/L；并根据“安全”的程度予以考虑供氧的程度，也即把菌体的呼吸率作为最大呼吸率的一个组成部分。因此，氧安全值低于最大呼吸率就意味着其溶氧浓度低于临界值。第56页，本讲稿共117页当溶氧浓度低于1.0时，谷氨酸和天冬氨酸族氨基酸合成受到影响，但苯丙氨酸，缬氨酸和亮氨酸最佳合成的溶氧浓度分别为0.55、0.60和0.85。从合成途径中可知，谷氨酸和天冬氨酸族的氨基酸来自于三羧酸循环(TCA)的中间体，而苯丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸来自于糖酵解的中间体，即来自于丙酮酸和磷酸稀醇式丙酮酸。第57页，本讲稿共117页第58页，本讲稿共117页r=QO2*CCCC g/l呼吸强度QO2 mM/gh每克干菌体每小时所消耗的氧的毫摩尔数 呼吸强度与菌特性有关如青霉素菌4.2 mM/gh 链霉菌4.0 mM/gh还与生理状态、培养条件（氧浓度）有关。第59页，本讲稿共117页临界氧浓度2、临界氧浓度，当培养液溶解氧浓度达到这一点，即在此之后，呼吸度与氧浓度无关。临界氧浓度是培养液最低氧浓度一般在0.0030.05M/L 图第60页，本讲稿共117页Dissolved Oxygen Concentration第61页，本讲稿共117页微 生 物 温度（C）临界氧浓度（mmol/L）固 氮 菌 30 0.018大肠杆菌 37 0.008酵 母 30 0.004产黄青霉 24 0.022第62页，本讲稿共117页3、微生物的需氧量与以下因素有关菌种特性 一般在25100mM/lh，但有个别菌特别，如石油酵母，200mM/lh生理状态（1）与菌龄有关 幼老（2）与生理阶段有关:1.生长阶段合成阶段 如卷曲霉素 2.生成阶段合成阶段 如头孢霉素培养基成分与浓度 C、N源 微量成分 浓度高则耗氧量大（补料后，微生物耗氧量升高）微量元素 如P浓度高，耗氧大大提高。金属离子低，一般耗氧降低。CO2浓度高，耗氧量低。细胞浓度：细胞浓度高，耗氧量高温度：温度升高，耗氧高，所以高温发酵，供氧加强 第63页，本讲稿共117页二、氧的供给（一）氧的溶解度（二）氧的传递 （三）溶解速率（dC/dt）第64页，本讲稿共117页（一）氧的溶解度微生物需氧，而氧又难溶于培养液。25.1大气压.纯氧,溶于水的溶解度为1.26mmol/l.25.1大气压.空气溶于水的溶解度为0.26mmol/l.25.1大气压.空气,溶于发酵液的溶解度为0.20mmol/l.如青霉素发酵80小时，其耗氧为40mM/h.l不够消耗20秒的,好氧性发酵要不断供氧。第65页，本讲稿共117页（二）氧的传递搅拌成为细泡 阻力有来自培养液。细菌细胞。供氧不足，微生物缺氧，窒息。要求耗氧速率与溶氧速率达到平衡。当溶氧的速率耗氧速率，则溶氧浓度，微生物生长受影响。第66页，本讲稿共117页（三）溶氧速率（dC/dt）溶氧速率（dC/dt）：单位体积的培养液在单位时间里溶解的氧量。单位：mM/lh。dC/dt=KL a(C*-C)C*饱和氧浓度C实际氧浓度KL液膜传质系数（m/h）a比界面面积(M2/M3)a=A/V A培养液气液接触面积V培养液体积KL a氧的吸收系数（氧传递系数）单位1/h提高培养液溶解氧速率常用以下方法：第67页，本讲稿共117页提高培养液溶解氧速率常用方法提高C*据享利定律 （1）在通入的空气中掺入的纯氧 （2）提高罐压力 也是提高氧分压的一种方法 提高KLa,最重要的一种方法（1）搅拌 （2）提高通气量 降低培养液粘度 降低培养液温度 添加某些物质增加溶氧 与培养液液柱体积有关 第68页，本讲稿共117页提高C*C*=HPO2据享利定律可提高氧分压PO2提高氧分压方法（1）在通入的空气中掺入纯氧由于产品产值高，微生物耗氧量大，在微生物耗氧最大时通入纯氧。（2）提高罐压力 也是提高氧分压的一种方法不常用，现发酵保持正压0.11.0kg/m2是为防止染菌,提高罐压还可压碎气泡.但更大加速了 的溶解度.第69页，本讲稿共117页提高KL a最主要的一种方法KL a与罐搅拌型式、通气量有关提高KL a方法（1）搅拌可增加气泡进行走时间，增加气液的接触面积，（把大泡变为小泡）。可降低液膜厚度，降低了传递阻力，有利于气、液、固三相物质均匀混和，既有利于氧溶解，也有利于微生物的吸收，有利于代谢废物的分散和排出，有利于产物的均匀分布，在一定范围内提高搅拌速率可提高溶解速率，当搅拌率超过一定限度不但会降低溶氧速率，且不利于菌生长，造成空转，使搅拌器接触不到培养液，不能打碎气泡，且剪切作用加速细胞的自溶。第70页，本讲稿共117页（2）提高通气量也是可增占加KLa，但通气量太大，也会降低KLa产生过载，一部分没经过搅拌器打碎，跑出培养液。通气量太大，增加发酵液的蒸发，使之浓缩，还会因温度不高而降低培养液温度。第71页，本讲稿共117页降低培养液粘度：粘度越大，就减少了培养液的湍动程度，使液膜变厚，粘度越大，气泡稳定性越大，粘度与培养液浓度，成分有关，增加1%蛋白胨KLa降低40%，粘度与茵丝浓度有关。降低培养液温度：在允许条件下降低，可增加溶解速率。添加某些物质增加溶氧。如加入高分子水溶性物，表面活性剂可增加溶氧，但不得影响菌生长，不使产物提炼变难，要经济。与培养液液柱体积有关，相同体积下，液柱高的溶氧高，氧利用率高，高径比（H/D）由1升至2，KLa可提高40%，再提至3还可提高30%，现发酵罐高径比常为2.53.5，大型罐比小型罐溶氧多。第72页，本讲稿共117页第六节 pH值，、基质浓度对发酵的影响一、pH值对发酵过程的影响及控制培养液的ph值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是一个重要参数。1、菌类在一定的pH值范围内繁殖，代谢菌的代谢活动会改变发酵液的PH值。2、发酵过程pH值变化当外环境变化不大时，菌本身有调节pH的能力，但有限。pH值变化会引起多种酶的改变从而影响菌对基质的利用速率和细胞的结构，影响菌生长和产物合成。第73页，本讲稿共117页引起pH下降因素 上升因素第74页，本讲稿共117页3、pH值控制培养基的配比中间补料控制pH值，补糖或补氨水、尿素PH电极控制加补料或酸、碱来控制pH。第75页，本讲稿共117页二、和呼吸商 既是发酵产物又是合成的一种基质。可 作为细胞代谢的重要指示 对菌的生长和产物合成有直接影响。1、释放率（CER）CER与菌体生长速率成比率关系2、呼吸商（RQ）值 OUR菌耗氧速率molO2/lhRQ值反映菌的代谢情况当RQ值不同，菌走不同代谢途径。当利用不同基质时，RQ值也不相同。第76页，本讲稿共117页1、CO2对发酵的影响（1）CO2对菌体具有抑制作用当排气中CO2的浓度高于4%时，微生物的糖代谢和呼吸速率下降。例如，发酵液中CO2的浓度达到1.610-1mol，就会严重抑制酵母的生长；当进气口CO2的含量占混合气体的80%时，酵母活力与对照相比降低20%。第77页，本讲稿共117页（2）CO2对发酵的影响对发酵促进。如牛链球菌发酵生产多糖，最重要的发酵条件是提供的空气中要含5%的CO2。对发酵抑制。如对肌苷、异亮氨酸、组氨酸、抗生素等发酵的抑制影响发酵液的酸碱平衡。第78页，本讲稿共117页2、CO2对发酵影响的机理CO2及HCO3-主要是影响细胞膜的结构，导致膜的流动性及表面电荷密度发生改变，影响到细胞膜的输送效率，导致细胞生长受到抑制、形态发生改变。培养液中的CO2主要作用于细胞膜的脂质核心部位；HCO3-影响细胞膜的膜蛋白。第79页，本讲稿共117页3、CO2的控制CO2在发酵液中的浓度变化不像溶解氧那样有一定的规律。它的大小受到许多因素的影响，如细胞的呼吸强度、发酵液的流变学特性、通气搅拌程度、罐压大小、设备规模等。在发酵过程中通常通过调节通风和搅拌来控制。第80页，本讲稿共117页三、基质浓度对发酵的影响及补料控制。monod 模型下图为代表性图式a sks b适于monod。C为高浓度基质产生抑制。基质过高，则菌生长受抑，产物合成也受抑，高浓基质会引起碳分解产生物阻遏现象，并阻碍产物形成。第81页，本讲稿共117页第82页，本讲稿共117页无机盐p对多种发酵物生产有影响要求p浓度高，核酸要求p盐浓度达2%多数要求p浓度低，低至0.1%以下。如金霉素要求磷浓度0.020.04%.高p浓度改变了糖代谢途径。第83页，本讲稿共117页（三）补料当高产菌株选用，其氧化基质一般强要求工艺跟上去工艺改革。采用丰富培养基，成分全，浓度高达采用丰富培养基，成分全，浓度高达10%15%。由于这样菌生长快速，大部分原料用于菌生长，营养物用于产物形成有局限性，同时培养液粘度大，使得溶解氧（DO）下降，培养液渗透压也升高，到一定程度，会影响菌的生长状态，产生很多泡沫，由于粘度大，泡沫也稳定。第84页，本讲稿共117页补料：在发酵过程中，中途补加的料液，补偿补料：在发酵过程中，中途补加的料液，补偿作用作用优点：优点：(1)用控制营养物资的浓度的方法来控制菌的用控制营养物资的浓度的方法来控制菌的生长速度，使菌生长不致太快衰老，自溶推迟，生长速度，使菌生长不致太快衰老，自溶推迟，达到增加合成时间，提高产物量的作用。达到增加合成时间，提高产物量的作用。（2）作为控制，扭正异常发酵的手段）作为控制，扭正异常发酵的手段如发酵罐中通气不良，可能是菌丝成团或萎缩，如发酵罐中通气不良，可能是菌丝成团或萎缩，用补稀料，补水的办法。用补稀料，补水的办法。如生长缓慢，可加磷、促使之生长。如生长缓慢，可加磷、促使之生长。发现有不严重杂菌，可在补料中加抑菌剂。发现有不严重杂菌，可在补料中加抑菌剂。第85页，本讲稿共117页（3）增加发酵液总体积）增加发酵液总体积补料的内容：缺何补何，所补之物与菌种有关。补料的内容：缺何补何，所补之物与菌种有关。与基础培养基原料有关，与培养条件有关。与基础培养基原料有关，与培养条件有关。如补（如补（C源、源、N源，源，微量元素）微量元素）补料时机：适时适量补料时机：适时适量时间适宜：则效果显著时间适宜：则效果显著补料不单纯以时间来决定补料不单纯以时间来决定根据取样分析的结果来定根据取样分析的结果来定第86页，本讲稿共117页第七节第七节 泡沫控制与发酵终点判断泡沫控制与发酵终点判断一、泡沫的产生及其影响一、泡沫的产生及其影响1、产生、产生在微生物浸没培养过程中，通气搅拌，代谢气体逸出，培养基中糖，蛋白质，在微生物浸没培养过程中，通气搅拌，代谢气体逸出，培养基中糖，蛋白质，代谢物等稳定泡沫的表面活性物质。代谢物等稳定泡沫的表面活性物质。2、影响、影响降低发酵罐装料系数降低发酵罐装料系数增加了菌群的非均一性增加了菌群的非均一性增加染菌机会增加染菌机会 导致产物损失导致产物损失消泡剂的加入增加提取的困难消泡剂的加入增加提取的困难 第87页，本讲稿共117页3、泡沫控制：、泡沫控制：泡沫控制：机械消泡泡沫控制：机械消泡，消泡剂消泡从微生物本身着手消泡剂消泡从微生物本身着手机械消泡：靠机械力引起强烈振动或压力变化促使泡沫破裂机械消泡：靠机械力引起强烈振动或压力变化促使泡沫破裂罐内：搅拌轴上的方装消沫浆，可在其转系上加少量消罐内：搅拌轴上的方装消沫浆，可在其转系上加少量消泡剂泡剂罐外：将泡沫引出罐外，通过喷咀的人为作用或离心力来消罐外：将泡沫引出罐外，通过喷咀的人为作用或离心力来消泡沫。泡沫。优点：不需引进外界物质，减少培养液性复杂化程度，优点：不需引进外界物质，减少培养液性复杂化程度，减少污染机会。减少污染机会。缺点：不能从根本上消除了引起稳定泡沫的因素。缺点：不能从根本上消除了引起稳定泡沫的因素。消泡剂消泡消泡剂消泡第88页，本讲稿共117页（1）机理）机理a、当泡沫的表层有在着由极性的表面活性物质、当泡沫的表层有在着由极性的表面活性物质形成双电系层，可加入另一种具有相反电荷的表形成双电系层，可加入另一种具有相反电荷的表面活性剂，以降低泡沫的机械强度，或加入具强面活性剂，以降低泡沫的机械强度，或加入具强极性的物质与发泡剂争夺液膜上的空间，降低液极性的物质与发泡剂争夺液膜上的空间，降低液膜强度，使泡沫破裂。膜强度，使泡沫破裂。b、泡沫的液膜具较大的表面粘度时，可加入、泡沫的液膜具较大的表面粘度时，可加入某些分子内聚力较小的物质，以降低液膜的粘某些分子内聚力较小的物质，以降低液膜的粘度，使液膜的液体流失，导致泡沫破裂。度，使液膜的液体流失，导致泡沫破裂。第89页，本讲稿共117页（2）种类）种类a、天然油脂：、天然油脂：玉米油、米糠油、豆油、鱼油、猪油等玉米油、米糠油、豆油、鱼油、猪油等即可作为消泡，也可作为碳源和中间补料。即可作为消泡，也可作为碳源和中间补料。b、化学消泡剂、化学消泡剂聚醚类聚醚类 高级醇类高级醇类 硅酮类硅酮类聚氧乙烯丙烯甘油（泡敌）聚氧乙烯丙烯甘油（泡敌）十八醇十八醇分散剂：帮助消沫剂扩散和缓慢释放，具加速和延长消分散剂：帮助消沫剂扩散和缓慢释放，具加速和延长消泡剂作用，减少消泡剂粘性。泡剂作用，减少消泡剂粘性。第90页，本讲稿共117页消泡剂的种类和性能消泡剂的种类和性能天然油脂：常用的有玉米油、米糠油、豆油、棉子油、鱼油及猪油等。聚醚类：在生产上应用较多的是聚氧丙烯甘油和聚氧乙烯氧丙烯甘油(又称泡敌)。高级醇类 十八醇是较常用的一种，可以单独或与载体起使用。据报导，它与冷榨猪油一起控制青男素发酵的泡沫，效果较好。聚二酵具有消沫效果持久的特点，尤其适用于霉菌发酵。硅酮类 硅酮类消沫剂主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物。分散剂：帮助消沫剂扩散和缓慢释放，具加速和分散剂：帮助消沫剂扩散和缓慢释放，具加速和延长消泡剂作用，减少消泡剂粘性。延长消泡剂作用，减少消泡剂粘性。第91页，本讲稿共117页选择消泡剂的依据选择消泡剂的依据对发酵过程无毒，对人、畜无害和不影响酶的生物合成。消泡作用迅速，效果高和持久性能好能耐高压蒸气灭菌而不变性，在灭菌温度下对设备无腐蚀性或不形成腐蚀性产物。不影响以后的提取过程。消沫剂的来源多，价格低，添加装置简单。不干扰分析系统，如溶解氧、pH测定仪的探头。最好还能做到不影响氧的传递。第92页，本讲稿共117页二、发酵终点的判断二、发酵终点的判断发酵要求提高生产率（发酵要求提高生产率（kg/m3h），），得率（得率（kg产物产物/kg基质）基质）发酵系数发酵系数 （kg产物产物/罐容积罐容积m3、发酵周期、发酵周期h）当下游提取精制成本占主要部分，产品价格比较贵，则除了当下游提取精制成本占主要部分，产品价格比较贵，则除了要求高的产率和发酵系数外还要求高的产物浓度，体积生产要求高的产率和发酵系数外还要求高的产物浓度，体积生产率指每升发酵液每小时形成的产物克数。率指每升发酵液每小时形成的产物克数。发酵的生产周期发酵的生产周期第93页，本讲稿共117页缩短发酵周期可提高总的生产率。缩短发酵周期可提高总的生产率。放罐时间早放罐时间早 残留过多养分，不利于提取，残留过多养分，不利于提取，放罐时间晚放罐时间晚 菌自溶，延长过滤的处理时间，产菌自溶，延长过滤的处理时间，产物不稳定物不稳定放罐前，加糖，补料慎重放罐前，加糖，补料慎重 第94页，本讲稿共117页第八节 污染的防止与挽救污染：微生物发酵为纯种发酵，如有他菌侵入称为污染。污染：微生物发酵为纯种发酵，如有他菌侵入称为污染。一、杂菌污染的防止与挽救一、杂菌污染的防止与挽救（一）危害性（一）危害性1、引起异常发酵会影响产物产量、引起异常发酵会影响产物产量生产菌的生长受抑制生产菌的生长受抑制 测测OD值值 菌浓度下降菌浓度下降C、N消耗加速，消耗加速，pH值的不正常变化值的不正常变化泡沫一般增多粘稠颜色加深，使培养液发酸发臭泡沫一般增多粘稠颜色加深，使培养液发酸发臭发酵周期缩短发酵周期缩短第95页，本讲稿共117页2、影响产产物提炼炼，使产产物质质量不得保证证如溶媒存在，使培养液乳化，不易分层与危害程度相关的几个方面与产品的品种有关，酒精和丙酮丁酸较小 AA核酸严重 抗生素（窄谱 广谱）染菌与发酵周期有关，发酵周期长，较易染菌，如前中期染菌后果较严重。第96页，本讲稿共117页杂菌类型染球菌：后果较严重，其繁殖速度特快，染短杆菌：后果较严重，染菌的时间越早，危害越大，染菌量越多，危害越大。染菌原因：公共系统引起染菌，影响面大，后果严重，公共系统为空气，总过滤器，空气管道不严密，公共补料系统，公共系统染菌，就会引起连续染菌，大面积染菌。第97页，本讲稿共117页（二）引起染菌的主要途径和原因 生产环节 1、种子培养阶段可能染菌生产菌种在保存、转移时可能染菌种子扩大培养，种子罐可能染菌，培养基可能带菌防止方法防止方法：选育抗污染能力强的菌株，定期进选育抗污染能力强的菌株，定期进行分离，严格无菌操作，培养基首先要进行无行分离，严格无菌操作，培养基首先要进行无菌试验，种子本身也要做无菌试验。菌试验，种子本身也要做无菌试验。第98页，本讲稿共117页2、培养基灭菌不彻底，培养基要求灭菌彻底，培养基尽量不能破坏，灭菌过程中，培养基要达到预定体积，培养基灭菌后泡沫不可太多，培养基灭菌方法连续消毒，优点高温 短时培养基破坏较小，实罐消毒（分批清毒）培养基装到罐中，蒸气通入罐中进行消毒，培养基灭菌的几个环节易造成染菌的：冷空气排除不彻底造成假压，蒸汽预热8090（三路进气 列管 排料管进空气管）蒸气走短路，由于空气走阻力小的管道第99页，本讲稿共117页负压抽吸：灭菌后，不可立即排冷却水，要通无菌空气保压，空气冷却后收缩，压力突然下降，把外面冷空气在严密度不够的缝隙进去。泡沫过多，当进气过分，使泡沫过多，其传热性差，使其中杂菌保留。3、空气系统：空气过滤与统出问题 主是要过滤介质失效。4、设备渗漏：设备安装不合理，有死角存在第100页，本讲稿共117页（三）情况分析杂菌类型：染芽孢者：设备死角，使芽孢存活。杂菌类型：染芽孢者：设备死角，使芽孢存活。染霉菌：培养基灭菌不彻底之故。染霉菌：培养基灭菌不彻底之故。染球菌：大部分从空气来，主要是空气过滤器染球菌：大部分从空气来，主要是空气过滤器失效。失效。染染G-：大部分从水中来，是由于设备的渗漏。：大部分从水中来，是由于设备的渗漏。还可以从染菌的规模来分析：还可以从染菌的规模来分析：如车间中多罐同时染菌，且菌类型相同，则问题如车间中多罐同时染菌，且菌类型相同，则问题出在公共系统，如连消系统，空气总过滤器出在公共系统，如连消系统，空气总过滤器，共同的移种管道，加油管道，补料管道，如单共同的移种管道，加油管道，补料管道，如单罐连续染菌，与此罐相联系的系统，包括分过罐连续染菌，与此罐相联系的系统，包括分过滤器，与此罐相联的管道死角。滤器，与此罐相联的管道死角。第101页，本讲稿共117页如如偶然染菌这种情况较复杂，几种情况都可偶然染菌这种情况较复杂，几种情况都可能，偶尔单罐染菌，则为操作不慎引起。能，偶尔单罐染菌，则为操作不慎引起。从染菌时间来分析：从染菌时间来分析：如发酵早期染菌，可能种子罐染菌，培养基如发酵早期染菌，可能种子罐染菌，培养基灭菌不彻底，发酵中、早期染菌设备渗漏，灭菌不彻底，发酵中、早期染菌设备渗漏，管道有死角还可能操作不慎。管道有死角还可能操作不慎。染菌防治，以防为主。染菌防治，以防为主。严格无菌操作，加强对染菌的监测，已染菌严格无菌操作，加强对染菌的监测，已染菌要尽可能挽救，挽救的几种方法：要尽可能挽救，挽救的几种方法：第102页，本讲稿共117页种子罐染菌：种子罐染菌：先灭菌先灭菌，再倒罐，再空消再倒罐，再空消取备用种或倒种，取备用种或倒种，发酵罐染菌，根据染菌时间不同采取相发酵罐染菌，根据染菌时间不同采取相应的方法。应的方法。前期染菌：前期染菌：如染的菌危害不大，采取补如染的菌危害不大，采取补种的方法，使生产菌在发酵罐中占绝对种的方法，使生产菌在发酵罐中占绝对优势，优势，如染的菌危害性较大，一般采用先补加如染的菌危害性较大，一般采用先补加营养再重新灭菌的方法，再接种。营养再重新灭菌的方法，再接种。如染的菌危害极大，一般先放掉一部分如染的菌危害极大，一般先放掉一部分发酵液，新配一部分培养基加入，灭菌发酵液，新配一部分培养基加入，灭菌再接种，再发酵。再接种，再发酵。第103页，本讲稿共117页中后期染菌：中后期染菌：用降低罐温，调批用降低罐温，调批pH改变通气量的方法改变通气量的方法 目的在于降低杂目的在于降低杂菌繁殖速度菌繁殖速度对分法：对分法：在生产抗生素的生产中常用，降低杂菌数量，杂在生产抗生素的生产中常用，降低杂菌数量，杂菌毒物浓度。菌毒物浓度。靠加抑菌剂、杀菌剂，如抗生素，添加量根据实验来定。靠加抑菌剂、杀菌剂，如抗生素，添加量根据实验来定。提前放罐进行提炼，提前放罐进行提炼，在对菌分泌的代谢物会分解产物，杂在对菌分泌的代谢物会分解产物，杂菌会分解产物情况下用，可加磷、玉米浆，让菌加速代谢，菌会分解产物情况下用，可加磷、玉米浆，让菌加速代谢，提前放罐。提前放罐。第104页，本讲稿共117页二、噬菌体的污染的防治1、噬菌体污染的后果比杂菌要严重得多，因为噬菌体的污染、噬菌体污染的后果比杂菌要严重得多，因为噬菌体的污染在发酵工作中极其普遍。在发酵工作中极其普遍。其个体极小（其个体极小（0.1u）（菌）（菌0.50.813um）空气过滤）空气过滤介质对噬菌体基本无效，甚至厌气性发酵也会受噬菌体介质对噬菌体基本无效，甚至厌气性发酵也会受噬菌体侵染。侵染。其繁殖快，会引起生产菌的大量的快速的裂解，感染后的子其繁殖快，会引起生产菌的大量的快速的裂解，感染后的子代噬菌体可能是几十个甚至几百个。代噬菌体可能是几十个甚至几百个。会产生的发酵侵染噬菌体的恶性循环，可能引起整会产生的发酵侵染噬菌体的恶性循环，可能引起整个车间连续倒罐。个车间连续倒罐。一般来说，新建的工厂（一般来说，新建的工厂（12年）不会有噬菌体污染，几年年）不会有噬菌体污染，几年后才会染噬菌体与染杂菌正好相反，因为新建的工厂设备不严后才会染噬菌体与染杂菌正好相反，因为新建的工厂设备不严密，操作不熟练，而工厂周围这种