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第十二章 光度分析1第1页，本讲稿共47页12-1 12-1 概概 述述 光度分析：光度分析：比色分析法和分光光度法。比色分析法和分光光度法。分光光度法：分光光度法：在光谱分析中，依据物质在光谱分析中，依据物质对光的对光的选择性吸收选择性吸收而建立起来的分析方而建立起来的分析方法称为分光光度法。法称为分光光度法。2第2页，本讲稿共47页分光光度法的特点：分光光度法的特点：1.1.灵敏度较高灵敏度较高2.2.准确度高准确度高3.3.仪器设备简单、操作简便快速仪器设备简单、操作简便快速4.4.应用广泛应用广泛3第3页，本讲稿共47页12-2 12-2 物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收 一、光的基本性质一、光的基本性质光是一种电磁波，具有波粒二象性。光是一种电磁波，具有波粒二象性。光是由光子流组成，光子的能量：光是由光子流组成，光子的能量：E E=h h =h c/h c/（PlanckPlanck常数常数：h h=6.626=6.626 10 10-34 -34 J J S)S)光的波动性可用波长光的波动性可用波长、频率、频率、光速、光速c c、波数（、波数（cmcm-1-1）等参数来描述：）等参数来描述：=c c4第4页，本讲稿共47页白光白光(太阳光太阳光)：由各种单色光组成的复合由各种单色光组成的复合光光可见光区：可见光区：400-760 nm400-760 nm紫外光区：紫外光区：近紫外区近紫外区200-400 nm200-400 nm 远紫外区远紫外区10-200 nm 10-200 nm（真空紫外区）（真空紫外区）5第5页，本讲稿共47页二、物质对不同波长光的吸收特性二、物质对不同波长光的吸收特性单色光：单色光：单波长的光单波长的光(由具有相同能量的由具有相同能量的光子组成光子组成)互补色光：互补色光：两种颜色的光按适当的强度比两种颜色的光按适当的强度比混合可成白光，则这两种光称为互补色混合可成白光，则这两种光称为互补色光。光。如绿光和紫光互补，蓝光和黄光互补如绿光和紫光互补，蓝光和黄光互补物质呈吸收光的互补色光的颜色物质呈吸收光的互补色光的颜色6第6页，本讲稿共47页物质的颜色物质的颜色 物质的颜色是由于物质对不同波长的物质的颜色是由于物质对不同波长的光具有选择性吸收而产生的。光具有选择性吸收而产生的。7第7页，本讲稿共47页光的互补：光的互补：蓝蓝 黄黄8第8页，本讲稿共47页 光吸收曲线光吸收曲线 用不同波长的单色光照射某一物质测定用不同波长的单色光照射某一物质测定吸光度，吸光度，以波长为横坐标，以吸光度为纵以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标，坐标，绘制曲线，描述物质对不同波长光绘制曲线，描述物质对不同波长光的吸收能力。的吸收能力。9第9页，本讲稿共47页KMnOKMnO4 4溶液的吸收曲线溶液的吸收曲线 （KMnOKMnO4 4:abcd:abcd）10第10页，本讲稿共47页 吸收曲线讨论：吸收曲线讨论：定性分析的依据定性分析的依据：不同物质由于其组成和不同物质由于其组成和结构不同，其吸收曲线的结构不同，其吸收曲线的形状形状和和maxmax也也不相同；不同浓度的不相同；不同浓度的同一种物质，其吸收同一种物质，其吸收曲线形状相似曲线形状相似maxmax不变。不变。定量分析的依据定量分析的依据：同一种物质，在一定波同一种物质，在一定波长下的长下的吸光度吸光度A A随浓度的增加而增加。随浓度的增加而增加。在在maxmax处吸光度处吸光度A A的差异最大。的差异最大。11第11页，本讲稿共47页12-3 12-3 光的吸收定律光的吸收定律一、朗伯一、朗伯比耳定律比耳定律布格布格(Bouguer)(Bouguer)和朗伯和朗伯(Lambert)(Lambert)先后于先后于17291729年年和和17601760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。系。A Ab b 18521852年比耳年比耳(Beer)(Beer)又提出了光的吸收程度和吸又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。收物浓度之间也具有类似的关系。A Ac c12第12页，本讲稿共47页13第13页，本讲稿共47页I0：入射光强度；：入射光强度；It：透射光强度；：透射光强度；14第14页，本讲稿共47页朗伯比尔定律的数学表达式：朗伯比尔定律的数学表达式：b：液层厚度：液层厚度(光程长度光程长度)，常以，常以cm为单位；为单位；k：比例常数：比例常数；c：物质浓度。物质浓度。15第15页，本讲稿共47页 朗伯朗伯-比耳定律：比耳定律：当平行单色光通过均匀当平行单色光通过均匀的吸光物质溶液时的吸光物质溶液时,溶液的吸光度与溶液溶液的吸光度与溶液浓浓度度和和液层厚度液层厚度的乘积成正比。的乘积成正比。朗伯朗伯-比耳定律是比耳定律是吸光光度法的理论基吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。础和定量测定的依据。广泛地应用于紫外广泛地应用于紫外光、可见光、红外光区的吸收测量，也适用光、可见光、红外光区的吸收测量，也适用于原子吸收测量。于原子吸收测量。16第16页，本讲稿共47页例例 已知透光率为已知透光率为1010，求吸光度。，求吸光度。A A lglgT T lg 0.1lg 0.1 1.01.0例例 已知吸光度为已知吸光度为1.01.0，求透光率。，求透光率。T T 1010A A 10101.0 1.0 0.100.10 17第17页，本讲稿共47页b：以：以cm为单位；浓度为单位；浓度c单位单位gL-1。Aa b c a：吸光系数，：吸光系数，单位单位Lg-1cm-1。二、吸光系数、摩尔吸光系数二、吸光系数、摩尔吸光系数b：以：以cm为单位；浓度为单位；浓度c单位单位molL-1；A bc：摩尔吸光系数，：摩尔吸光系数，单位单位Lmol-1cm-1。18第18页，本讲稿共47页 与与a的关系的关系 =M M a （M M为物质的摩尔质量）为物质的摩尔质量）摩尔吸光系数摩尔吸光系数(Lmol(Lmol-1-1cmcm-1-1)在数值上等在数值上等于浓度为于浓度为1molL1molL-1-1、液层厚度为、液层厚度为1cm1cm时该溶时该溶液在某一波长下的吸光度。液在某一波长下的吸光度。吸光系数吸光系数a a(Lg(Lg-1-1cmcm-1-1)相当于浓度为相当于浓度为1gL1gL-1-1，液层厚度为，液层厚度为1cm1cm时该溶液在某一波时该溶液在某一波长下的吸光度。长下的吸光度。19第19页，本讲稿共47页比吸光系数比吸光系数(specific absorptivity)指浓度指浓度0.01g/mL,b为为1cm时的吸光度值。时的吸光度值。用用E1cm1%表示，单位表示，单位mL/gcm。E1cm1%10 a=10/M/M20第20页，本讲稿共47页例例1 1 一含一含FeFe2 2溶液浓度为溶液浓度为0.5 mg/L0.5 mg/L，用邻二氮菲显色，用邻二氮菲显色测定，吸收池厚度为两厘米，在测定，吸收池厚度为两厘米，在508nm508nm处测得吸光处测得吸光度为度为0.190.19，求摩尔吸光系数和比吸光系数。，求摩尔吸光系数和比吸光系数。21第21页，本讲稿共47页摩尔吸光系数摩尔吸光系数的讨论的讨论（1 1）不随浓度）不随浓度c c和光程长度和光程长度b b的改变而改变。的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，在温度和波长等条件一定时，仅与物质本身仅与物质本身的的性质有关，性质有关，与待测物与待测物浓度无关。浓度无关。（2 2）同一物质在）同一物质在不同波长不同波长下的下的值不同。值不同。（3 3）maxmax越大表明该物质的吸光能力越强，测定越大表明该物质的吸光能力越强，测定该物质的该物质的灵敏度灵敏度越高。越高。22第22页，本讲稿共47页三、桑德尔灵敏度（三、桑德尔灵敏度（S）定义定义：产生：产生0.001吸光度时，单位截面积吸光度时，单位截面积（cm2）光程内所含吸光物质的质量。单位）光程内所含吸光物质的质量。单位（g/cm2）S越小，显色反应灵敏度越高。越小，显色反应灵敏度越高。23第23页，本讲稿共47页（一）物理性因素（一）物理性因素（二）化学性因素。（二）化学性因素。四、偏离朗伯四、偏离朗伯比耳定律的原因比耳定律的原因24第24页，本讲稿共47页（一）（一）物理性因素物理性因素（1 1）入射光为非单色光。）入射光为非单色光。朗伯朗伯比耳定律的前提条件之一是入射比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。光为单色光。分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯带。复合光可导致对朗伯比耳定律的比耳定律的正或负偏离。正或负偏离。25第25页，本讲稿共47页(2)(2)朗伯朗伯-比耳定律只适用于稀溶液。比耳定律只适用于稀溶液。朗伯朗伯-比耳定律假定：所有的吸光质点之间不比耳定律假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用，这种假定只有在发生相互作用，这种假定只有在稀溶液稀溶液时才基时才基本符合。本符合。当溶液浓度较大时，吸光质点间可能发生缔当溶液浓度较大时，吸光质点间可能发生缔合、离解、互变异构等相互作用，直接影响合、离解、互变异构等相互作用，直接影响了对光的吸收。了对光的吸收。26第26页，本讲稿共47页(二二)化学性因素化学性因素27第27页，本讲稿共47页12-4 12-4 吸光度的测量吸光度的测量一、分光光度计的基本组成一、分光光度计的基本组成光源单色器样品室检测器显示28第28页，本讲稿共47页29第29页，本讲稿共47页 1 1光源光源钨灯钨灯 320 3202500 nm 2500 nm 可见光区可见光区氘灯氘灯 190 190400 nm 400 nm 紫外光区紫外光区 2 2单色器单色器将光源发射的复合光分解成单色光并可从将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出任一波长单色光的光学系统。中选出任一波长单色光的光学系统。核心器件为：棱镜或光栅核心器件为：棱镜或光栅30第30页，本讲稿共47页 3.3.样品室样品室 吸收池主要有吸收池主要有石英池石英池和和玻璃池玻璃池两种。紫外两种。紫外区须用石英池，可见区用玻璃池。区须用石英池，可见区用玻璃池。4.4.检测器检测器 光信号变成可测的电信号，常用的有光电光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。池、光电管或光电倍增管。5.5.信号显示记录系统信号显示记录系统 检流计、数字显示、微机进行仪器自动控检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理。制和结果处理。31第31页，本讲稿共47页32第32页，本讲稿共47页二、二、吸光光度测量条件的选择吸光光度测量条件的选择（一）选择适当的（一）选择适当的入射波长入射波长 一般应该选择一般应该选择maxmax为入射光波长。为入射光波长。（二）选择适当的（二）选择适当的参比溶液参比溶液 消除吸收池表面及溶液对入射光的反射和吸收消除吸收池表面及溶液对入射光的反射和吸收带来的误差。带来的误差。33第33页，本讲稿共47页参比溶液的选择一般遵循以下原则：参比溶液的选择一般遵循以下原则：当待测组分、显色剂及其他试剂均无色，用当待测组分、显色剂及其他试剂均无色，用纯溶剂（水纯溶剂（水)作参比溶液；作参比溶液；当显色剂无色，而待测试液有色，用当显色剂无色，而待测试液有色，用“试试样空白样空白”(”(不加显色剂不加显色剂)作参比溶液；作参比溶液；34第34页，本讲稿共47页当显色剂或其它试剂有色，而试液本身无当显色剂或其它试剂有色，而试液本身无色，用色，用“试剂空白试剂空白”(”(不加试样溶液不加试样溶液)作参比作参比溶液；溶液；平行操作空白平行操作空白35第35页，本讲稿共47页 （三）控制适宜的吸光度读数范围（三）控制适宜的吸光度读数范围误差表示：误差表示：c c/c c=（0.434/0.434/T TlglgT T）T T 浓度测量值的相对误差（浓度测量值的相对误差（c c/c c）不仅与仪器）不仅与仪器的透光度误差的透光度误差T T 有关，而且与其透光度读数有关，而且与其透光度读数T T 的值也有关。的值也有关。36第36页，本讲稿共47页最佳读数范围与最佳值最佳读数范围与最佳值T T 在在10%10%70%70%浓度相对误差浓度相对误差较小，较小，最佳读数范围。最佳读数范围。用仪器测定时应尽量使溶液透用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在光度值在T T%=10%=1070%(70%(吸吸光度光度 A A=0.15=0.151.01.0)。相对误差最小相对误差最小 T Tminmin36.8%,36.8%,A Aminmin0.4340.43437第37页，本讲稿共47页12-512-5显色反应及显色条件的选择显色反应及显色条件的选择一、对显色反应的要求一、对显色反应的要求1 1、选择性好、选择性好2 2、灵敏度高、灵敏度高3 3、生成物稳定、生成物稳定4 4、显色剂在测定波长处无明显吸收、显色剂在测定波长处无明显吸收38第38页，本讲稿共47页二、显色条件的选择二、显色条件的选择 1.1.显色剂用量：显色剂用量：选择曲线变化平坦处作为显色条件。选择曲线变化平坦处作为显色条件。吸光度与显色剂用量关系曲线cRcRcRAAA39第39页，本讲稿共47页2.2.溶液的溶液的pHpH值值 选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的所对应的pHpH范围。范围。pHA3.3.显色时间与温度显色时间与温度 显色反应一般在室温下进行，有的反应需加热，显色反应一般在室温下进行，有的反应需加热，应通过实验找出适宜的温度范围。应通过实验找出适宜的温度范围。40第40页，本讲稿共47页三、干扰的消除三、干扰的消除 1.加入掩蔽剂加入掩蔽剂 2.选择适当的显色反应条件选择适当的显色反应条件 3.选择适宜的波长选择适宜的波长 4.分离干扰离子分离干扰离子41第41页，本讲稿共47页四、常用显色剂四、常用显色剂分类：分类：无机显色剂无机显色剂和和有机显色剂有机显色剂，常用有机，常用有机显色剂。显色剂。有机显色剂可以同金属离子形成稳定的有特有机显色剂可以同金属离子形成稳定的有特征颜色的螯合物，灵敏度高。征颜色的螯合物，灵敏度高。常用的有：铬天菁常用的有：铬天菁S S、偶氮胂、偶氮胂、邻菲罗林、邻菲罗林、二硫腙。二硫腙。42第42页，本讲稿共47页12-6 12-6 分光光度法的定量方法分光光度法的定量方法一、标准曲线法一、标准曲线法0.20.80.40.6A 0 1 2 3 4 5C/mgL-143第43页，本讲稿共47页二、标准对比法二、标准对比法二、标准对比法二、标准对比法44第44页，本讲稿共47页 三、多组分的同时测定三、多组分的同时测定 45第45页，本讲稿共47页A A1 1=aa1 1bCbCa abb1 1bCbCb b A A2 2=aa2 2bCbCa abb2 2bCbCb b AA1122双组分的吸收曲线46第46页，本讲稿共47页12-9 12-9 应用实例应用实例例一例一 全血中铁的测定全血中铁的测定 Fe3+2SCN-Fe(SCN)2+红色例二例二 尿铜的测定尿铜的测定 Cu和二乙氨基二硫代甲酸钠 黄棕色例三例三 血液中的葡萄糖血液中的葡萄糖 葡萄糖和邻甲苯胺 蓝色蓝色47第47页，本讲稿共47页