蛋白质性质优秀课件.ppt

蛋白质性质第1页，本讲稿共24页+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉第2页，本讲稿共24页四、蛋白质的变性四、蛋白质的变性(denaturation)定义：某些物理或化学因素使蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏，导致其生物活性的丧失和一些理化性质的改变，这种现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。第3页，本讲稿共24页1.变性作用的本质 蛋白质变性作用的本质是破坏了形成与稳定蛋白质分子空间构象的次级键，从而导致蛋白质分子空间构象的改变或破坏，而并不涉及蛋白质一级结构的改变或肽键的断裂。生物活性的丧失是变性的主要表现；构象的破坏是蛋白质变性的结构基础。第4页，本讲稿共24页2.变性作用的特征（1）生物活性丧失 （2）某些理化性质的改变 失去结晶的能力；易为蛋白酶水解，因此食用变性蛋白更有利于消化；无序松散肽链相互交链形成大的絮凝、凝固、沉淀等；变性还可以引起球状蛋白质不对称性增加、粘度增加、扩散系数降低等。第5页，本讲稿共24页3.引起蛋白质变性的因素物理因素：高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等（表面张力）。这主要通过能量效应破坏了蛋白质结构维持的次级键，这里的多数方法是作为杀菌、灭酶除杂的主要杀菌、灭酶除杂的主要手段手段，注意搅拌振荡往往是同时引起泡沫效应，有泡沫的表面张力作用引起的蛋白质变性可发生于实验室，更重要的是在生化工程的蛋白质液体传输、产气发酵等产生的泡沫变性应尽量避免（消泡措施）。第6页，本讲稿共24页化学因素：强酸和强碱（破坏解离状态等）、强酸和强碱（破坏解离状态等）、尿素和胍盐（氢键破坏剂）、尿素和胍盐（氢键破坏剂）、去污剂（破坏疏水键、离子键）、去污剂（破坏疏水键、离子键）、浓乙醇（破坏疏水键等）、重金属盐（如浓乙醇（破坏疏水键等）、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）和三氯乙酸（与蛋等）和三氯乙酸（与蛋白质不可逆结合形成沉淀）等。白质不可逆结合形成沉淀）等。不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同，可根据需要选用。化学变性中后三种多生成沉淀，前三类多为可溶性变性，特别是去污剂（SDS、Tween）和氢键破坏剂（尿素、胍盐、酰胺）可用来蛋白质增溶提取及蛋白质化学特性研究中。第7页，本讲稿共24页4.变性作用的意义对活性蛋白质的生产和应用也有着重要的指导作用。实践中有时必须尽力避免，制备有生物活性的酶、蛋白质、激素或其他生物制品（疫苗、抗毒素等）时，要求所需成分不能变性，而不需要的杂蛋白则应使其变性或沉淀除去。此时，应选用适当的方法严格控制操作条件，尽量减少所需蛋白质的变性。有时还可加些保护剂、抑制剂等以增强蛋白质的抗变性能力。有时则充分利用。如酒精、紫外线消毒，高温、高压灭菌等是使细菌蛋白变性而失去活性；中草药有效成分的提取或其注射液的制备也常用变性的方法（加热、浓酒精等）除去杂蛋白；在第8页，本讲稿共24页5.蛋白质的可逆变性与复性当变性条件不剧烈，这种变性作用是可逆的，说明蛋白质分子内部结构的变化不大。这时，如果除去变性因素，在适当条件下变性蛋白质可恢复其天然构象和生物活性，这种现象称为蛋白质的复性（renaturation）。例如胃蛋白酶加热至8090时，失去溶解性，也无消化蛋白质的能力，如将温度再降低到37，则又可恢复溶解性和消化蛋白质的能力。如果变性条件剧烈持久，蛋白质的变性是不可逆的，如大多数的热变性、重金属沉淀和强酸强碱变性是不可逆的。蛋白质变性是否可逆由变性与复性的条件控制和蛋白质种类都有关系，蛋白质高级结构越复杂（多亚基，多结构域）越难以复性。第9页，本讲稿共24页 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性第10页，本讲稿共24页五、蛋白质的颜色反应蛋白质在可见光下可分为有色与无色两大类：有色蛋白质都是含有色素基团的结合蛋白质 常见的有植物的叶绿蛋白（辅基是叶绿素），动物的血红蛋白（辅基为血红素），细胞色素、一些藻类的藻胆色素合和菌蕈色素蛋白质，这些色素基团以卟啉及其衍生物（含镁、铁离子）为主，亦可有其它的色素及金属鳌合物，常见的还有黄素（结合核黄素）蛋白质等，这类有色蛋白质既构成了色彩斑斓的自然界，又具有重要的功能，同时又可直接观察方便蛋白质研究。第11页，本讲稿共24页蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收 由由于于蛋蛋白白质质分分子子中中含含有有共共轭轭双双键键的的酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸，因因此此在在280nm波波长长处处有有特特征征性性吸吸收收峰峰。蛋蛋白白质质的的OD280与与其其浓浓度度呈呈正正比比关关系，因此可作蛋白质定量测定。系，因此可作蛋白质定量测定。而对于多数（可见光下）无色蛋白质常常需要通过颜色反应进行定性定量分析第12页，本讲稿共24页1.用于蛋白质定量的颜色反应 双缩脲反应：双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。将尿素加热到180，2分子尿素缩合成1分子双缩脲并放出1分子氨。（P35图）双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生紫红色络合物，此反应称双缩脲反应（biuret reaction）。蛋白质分子中含有许多肽键，结构与双缩脲相似，因此也能产生双缩脲反应，所以可用此反应来定性定量地测定蛋白质。凡含有两个或两个以上肽键结构的化合物都可有双缩脲反应。第13页，本讲稿共24页 酚试剂反应：酚试剂又称福林（Folin）试剂。酪氨酸中的酚基能将酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（钼蓝和钨蓝的混合物）。由于蛋白质分子中一般都含有酪氨酸，所以可用此反应来测定蛋白质含量（Lowry法或Folin-酚法），测定时是在双缩脲试剂（Cu+2）的基础上再引入Folin试剂，灵敏度大大提高。第14页，本讲稿共24页2.用于蛋白质定性的颜色反应 蛋白质黄色反应：蛋白质黄色反应：蛋白质溶液遇硝酸后先产生白色沉淀，加热则变成黄色，再加入碱后颜色会加深呈橙黄色。凡含有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的蛋白质均有此反应 米隆反应：米隆反应：米隆试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合物。将此试剂加入蛋白质溶液后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。含有酪氨酸的蛋白质及酪氨酸都有此反应。乙醛酸反应：乙醛酸反应：将乙醛酸加入蛋白质溶液，然后沿试管壁慢慢注入浓硫酸，则在两液层之间会出现紫色环。含有色氨酸（吲哚基）的化合物都有此反应。坂口反应：坂口反应：精氨酸分子中的胍基能与次氯酸钠（或次溴酸钠）及-萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色产物。此反应可用来测定精氨酸的含量或鉴定含有精氨酸的蛋白质。醋酸铅反应：醋酸铅反应：凡含有半胱氨酸、胱氨酸的蛋白质都能与醋酸铅起反应，生成黑色的硫化铅沉淀，因为其中含有-S-S-或-SH基。第15页，本讲稿共24页3.蛋白质染色法 考马斯亮蓝(Coomassie brilliant biue)G-250，蓝色（max=560590），用于定性定量（Bradford法）研究，特别是在蛋白质电泳结果染色中应用广泛；氨基黑10B，传统的蛋白质通用染料，灵敏度较考马斯亮蓝低，现较少使用；阿尔山兰（Alcian blue），为糖蛋白染色专用；油红O（Oil red），脂蛋白染色。胶体金（带负电荷的疏水胶体，洋红色），遇蛋白质变为蓝色，也可作为灵敏的染色剂。第16页，本讲稿共24页蛋白质的光吸收特点可总结为：一是有色蛋白质对可见光有特征吸收；二是所有蛋白质都对紫外光有吸收，最大吸收峰（max）为280nm；三是无色蛋白质通过颜色反应产生的呈色物质都有自己的特征吸收；更方便的是用染料对蛋白质的染色检测，荧光试剂（染料）可以赋予蛋白质特殊的光学特性，分析精度更高。第17页，本讲稿共24页六、蛋白质的含量测定六、蛋白质的含量测定 测定蛋白质总量常用的方法有：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（lowry法）和紫外吸收法等。第18页，本讲稿共24页蛋白质定量检测方法的比较第19页，本讲稿共24页第六节 蛋白质的分类分类原则：1、功能分类：常可分为活性蛋白质和非活性蛋白质两大类。其中活性蛋白质大多数是球状蛋白质，它们的特性在于都有识别功能（即与其它分子结合的功能）包括在生命活动过程中一切有活性的蛋白质以及它们的前体，如酶、激素蛋白质、运输蛋白质、保护或防御蛋白质、受体蛋白、毒蛋白、控制生长和分化的蛋白质以及膜蛋白等。非活性蛋白质则主要包括一大类对生物体起支持和保护作用的的结构蛋白质，如硬蛋白，包括胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白和丝心蛋白等，还包括贮存蛋白质。第20页，本讲稿共24页2.根据分子形状分类按其分子外形的对称程度可分为球状蛋白质（globular protein）和纤维状蛋白质（fibrous protein）两大类。球状蛋白质的分子对称性较好，外形接近球形或椭球形，溶解性较好，能结晶；大多数蛋白质属于这一类。纤维状蛋白质分子对称性差，分子类似细棒或纤维。它又可分为可溶性纤维状蛋白质（如肌球蛋白（myosin）、血纤维蛋白原（fibrinogen）等）和不溶性纤维状蛋白质（如胶原、弹性蛋白、角蛋白以及丝心蛋白等）。第21页，本讲稿共24页3.根据化学组成分类 简单蛋白质（simple protein）完全由氨基酸构成，如清蛋白（白蛋白）、球蛋白、组蛋白、精蛋白（硫酸鱼精蛋白）、硬蛋白、核糖核酸酶、胰岛素等。结合蛋白质（conjugated protein），除了蛋白部分外，还有非蛋白成分（称为辅基prosthetic group），如血红蛋白、核蛋白等。其中的非蛋白部分称为其完全水解产物仅为氨基酸。第22页，本讲稿共24页结合蛋白质的种类第23页，本讲稿共24页4.根据溶解度分类P36表1-10可溶性蛋白质、醇溶性蛋白质和不溶性蛋白质三大类 1.清蛋白；2.球蛋白；3.醇溶蛋白；4.谷蛋白；5.精蛋白；6.组蛋白；7.硬蛋白。蛋白质还可按来源分:植物蛋白；动物蛋白；微生物蛋白（单细胞蛋白 SCP）第24页，本讲稿共24页