仪器分析课件-高效液相色谱法3-考研试题文档资料系列.ppt

第三章第三章高效液相色谱法高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatographyHighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)一、高效液相色谱法的特点一、高效液相色谱法的特点1.1.高效液相色谱法概述高效液相色谱法概述高效液相色谱法概述高效液相色谱法概述2.高效液相色高效液相色谱谱与气相色与气相色谱谱的比的比较较GCHPLC应用范围应用范围热稳定、低沸点的热稳定、低沸点的物质物质热不稳定、高沸点、热不稳定、高沸点、离子型的物质离子型的物质热力学理论热力学理论较成熟较成熟正在发展中正在发展中分析成分析成本本低低高高分离能力分离能力与柱的类型有关与柱的类型有关较高较高3.高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较经典液相色谱法经典液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法粒径粒径(m)75-6003-50（常用（常用5-10）柱前压力柱前压力(atm)0.01-1.020-300分析时间分析时间(h)1-200.05-1.0色谱柱长度色谱柱长度(cm)50-2002-30柱效柱效(块块/m)2-50104-105样品用量样品用量(g)1-1010-6-10-24.高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点n n高压高压n n高速高速n n高效高效n n高灵敏度高灵敏度5.应用举例应用举例丹参Radix Salviae Miltiorrhizae丹参的HPLC指纹图谱二、高效液相色谱理论基础二、高效液相色谱理论基础n nH=A+B/H=A+B/u+Cuu+Cun nA=2A=2 dpdpn nB0B0n nC=?C=?1.高效液相色谱中的速率方程高效液相色谱中的速率方程 迁移的流动相的传质阻力迁移的流动相的传质阻力 滞留的流动相的传质阻力滞留的流动相的传质阻力高效液相色谱中的速率方程高效液相色谱中的速率方程涡流扩散项涡流扩散项涡流扩散项涡流扩散项 纵向扩散纵向扩散纵向扩散纵向扩散 流动相传质流动相传质流动相传质流动相传质 滞留区传质滞留区传质滞留区传质滞留区传质 固定相内传质固定相内传质固定相内传质固定相内传质2.对速率方程的讨论对速率方程的讨论n n选用选用选用选用细颗粒细颗粒细颗粒细颗粒填料可获高柱效填料可获高柱效填料可获高柱效填料可获高柱效n n流动相流速低，有利于达到高柱效流动相流速低，有利于达到高柱效流动相流速低，有利于达到高柱效流动相流速低，有利于达到高柱效n n选用选用选用选用黏度小的流动相黏度小的流动相黏度小的流动相黏度小的流动相有利于提高柱效有利于提高柱效有利于提高柱效有利于提高柱效n n温度的影响温度的影响温度的影响温度的影响n n液膜厚度的影响液膜厚度的影响液膜厚度的影响液膜厚度的影响3.柱外效应柱外效应n n由由由由于于于于色色色色谱谱谱谱柱柱柱柱之之之之外外外外的的的的因因因因素素素素引引引引起起起起的的的的色色色色谱谱谱谱峰峰峰峰的的的的展展展展宽宽宽宽，例例例例如如如如进进进进样样样样系系系系统统统统、连连连连接接接接管管管管路路路路及及及及检检检检测测测测器器器器的的的的死体积等。死体积等。死体积等。死体积等。三、高效液相色谱仪三、高效液相色谱仪1.高效液相色谱仪流程高效液相色谱仪高效液相色谱仪2.高压输液系统高压输液系统 往复泵原理示意图往复泵原理示意图 往复泵往复泵n n 梯度洗提梯度洗提n n梯度洗提 即程序控制流动相的组成，使在整个分离过程中，溶剂即程序控制流动相的组成，使在整个分离过程中，溶剂强度按照特定的变化规律增加。强度按照特定的变化规律增加。优点：优点：优点：优点：分离复杂混合物，使所有组分都处在最佳的分离复杂混合物，使所有组分都处在最佳的k k值范值范围内。围内。缺点：缺点：缺点：缺点：检测器的使用受到限制，分析结果的重复性取决检测器的使用受到限制，分析结果的重复性取决于流速的稳定性。柱子需进行再生处理。于流速的稳定性。柱子需进行再生处理。溶剂溶剂A溶剂B电磁阀A电磁阀B混合室泵溶剂A溶剂B高压泵A高压泵B混合室低压溶剂梯度方框图高压溶剂梯度方框图n 梯度洗提流程应用举例应用举例3.进样系统进样系统 六通进样阀结构示意图4.分离系统分离系统色谱柱色谱柱 包括柱管与固定相两部分包括柱管与固定相两部分一般色谱柱长一般色谱柱长5 530cm30cm，内径为内径为4 45mm5mm凝胶色谱柱内径凝胶色谱柱内径3 312mm12mm微柱内径微柱内径1-2mm1-2mm，长长1-5cm1-5cm制备往内径较大，可达制备往内径较大，可达25mm 25mm 以上以上5检测系统检测系统 n紫外检测器n示差折光检测器n荧光检测器n电导检测器（1）紫外检测器n n固定波长的紫外检测器固定波长的紫外检测器n n可变波长的紫外检测器可变波长的紫外检测器n n二极管阵列检测器二极管阵列检测器固定波长的紫外检测器固定波长的紫外检测器Z Z型流通池结构型流通池结构型流通池结构型流通池结构 可变波长的紫外检测器可变波长的紫外检测器 二极管阵列检测器二极管阵列检测器二极管阵列检测器之三维图二极管阵列检测器之三维图二极管阵列检测器之三维图二极管阵列检测器之三维图二极管阵列检测器之二极管阵列检测器之二极管阵列检测器之二极管阵列检测器之IsoabsorbanceIsoabsorbance Plot Plot 响应特性响应特性n n选择性检测器，如芳烃类化合物的检测选择性检测器，如芳烃类化合物的检测选择性检测器，如芳烃类化合物的检测选择性检测器，如芳烃类化合物的检测n n灵敏度高，可检测灵敏度高，可检测灵敏度高，可检测灵敏度高，可检测1010-9-9g/mLg/mL的物质的物质的物质的物质n n线性范围宽，线性范围宽，线性范围宽，线性范围宽，10104 4-10-105 5n n对温度及流动相的改变不敏感对温度及流动相的改变不敏感对温度及流动相的改变不敏感对温度及流动相的改变不敏感n n适合梯度洗提适合梯度洗提适合梯度洗提适合梯度洗提n nHPLCHPLC常规检测器常规检测器常规检测器常规检测器应用举例应用举例波长的选择（2）示差折光检测器结构结构响应特性响应特性n n通用性检测器通用性检测器通用性检测器通用性检测器n n低灵敏度低灵敏度低灵敏度低灵敏度n n基线易受温度的影响基线易受温度的影响基线易受温度的影响基线易受温度的影响n n不适合梯度洗提不适合梯度洗提不适合梯度洗提不适合梯度洗提荧光检测器荧光检测器结构结构响应特性响应特性n n选择性检测器。如选择性检测器。如选择性检测器。如选择性检测器。如PAHPAH，蛋白质，蛋白质，蛋白质，蛋白质n n高灵敏度，比紫外高约高灵敏度，比紫外高约高灵敏度，比紫外高约高灵敏度，比紫外高约10001000倍倍倍倍n n适合梯度洗提适合梯度洗提适合梯度洗提适合梯度洗提应用举例应用举例电导检测器电导检测器结构结构响应特性响应特性n n选择性检测器，对离子型化合物有响应选择性检测器，对离子型化合物有响应选择性检测器，对离子型化合物有响应选择性检测器，对离子型化合物有响应n n灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度高n n受温度的影响受温度的影响受温度的影响受温度的影响n n不能梯度洗提不能梯度洗提不能梯度洗提不能梯度洗提讨论：液相色谱检测器的选择讨论：液相色谱检测器的选择1.1.葡萄糖产品的含量测定2.2.地下水中酚类化合物的分析3.3.矿泉水中无机阴离子的测定4.4.痕量氨基酸的分析5.5.去痛片中有效成分的分析6.6.链烷基磺酸盐的测定7.7.蛋白质的分子量测定（5）几种检测器特性比较）几种检测器特性比较 示差折光示差折光紫外紫外荧光荧光电导电导应用范围应用范围通用通用选择性选择性高选择高选择性性选择性选择性可否梯度淋洗可否梯度淋洗不可不可可可可可不可不可线性范围线性范围104105103104最小检测量最小检测量gngpgng对温度敏感度对温度敏感度敏感敏感低低低低敏感敏感溶剂使用情况溶剂使用情况无限制无限制受限制受限制受限制受限制受限制受限制四、四、HPLCHPLC主要类型及其选择主要类型及其选择 n n化学键合相色谱法化学键合相色谱法化学键合相色谱法化学键合相色谱法 n n液固色谱法液固色谱法液固色谱法液固色谱法 n n离子对色谱法离子对色谱法离子对色谱法离子对色谱法 n n离子色谱法离子色谱法离子色谱法离子色谱法 n n体积排阻色谱法体积排阻色谱法体积排阻色谱法体积排阻色谱法 1.化学键合相色谱法（1 1）分离机理）分离机理n n正正正正相相相相键键键键合合合合相相相相色色色色谱谱谱谱法法法法：固固定定相相的的极极性性大大大大于于于于流流动动相相的的极极性性，适适适适用用用用于于于于分分分分离离离离油油油油溶溶溶溶性性性性或或或或水水水水溶溶溶溶性性性性的的的的极极极极性性性性或或或或强强强强极极极极性性性性化化化化合物。合物。合物。合物。分配机理：分配系数分配机理：分配系数 x x为为溶溶质质，M M为为溶溶剂剂 n n反反反反相相相相键键键键合合合合相相相相色色色色谱谱谱谱法法法法：固固定定相相的的极极性性小小小小于于于于流流动动相相的的极极性性，适适于于分分离离非非极极性性、极极性性和和离离子子性性化化合合物物。应应应应用用用用最广泛最广泛最广泛最广泛反反反反相相相相键键键键合合合合相相相相色色色色谱谱谱谱法法法法的的的的疏疏疏疏溶溶溶溶剂剂剂剂机理机理机理机理：溶溶溶溶质质质质进进进进入入入入极极极极性性性性流流流流动动动动相相相相后后后后，排排排排挤挤挤挤部部部部分分分分溶溶溶溶质质质质分分分分子子子子，其其其其疏疏疏疏水水水水基基基基团团团团由由由由于于于于流流流流动动动动相相相相的的的的斥斥斥斥力力力力推推推推动动动动而而而而直直直直接接接接与与与与非非非非极极极极性性性性固固固固定定定定相相相相上上上上的的的的烷烷烷烷基基基基缔缔缔缔合合合合，构构构构成成成成单单单单分分分分子子子子吸吸吸吸附附附附层层层层，这这这这种种种种作作作作用用用用时时时时可可可可逆逆逆逆的的的的。当当当当流流流流动动动动相相相相极极极极性性性性减减减减小小小小时时时时，这种疏溶剂斥力下降。这种疏溶剂斥力下降。这种疏溶剂斥力下降。这种疏溶剂斥力下降。（2 2）固定相）固定相 疏水基团疏水基团 如不同链长的烷烃（如不同链长的烷烃（C C8 8和和C C C C18181818）和苯基等和苯基等极性基团极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。类类类类型型型型分离方式分离方式分离方式分离方式 应应应应用特点用特点用特点用特点C-18C-18C-18C-18反相、离子反相、离子反相、离子反相、离子对对对对普适性好，保留普适性好，保留普适性好，保留普适性好，保留值值值值大。溶于水的高极性化合大。溶于水的高极性化合大。溶于水的高极性化合大。溶于水的高极性化合物、中等极性化合物物、中等极性化合物物、中等极性化合物物、中等极性化合物C-8C-8C-8C-8反相、离子反相、离子反相、离子反相、离子对对对对与与与与C-18C-18C-18C-18类类类类似，保留似，保留似，保留似，保留值值值值略小略小略小略小C-3,C-4C-3,C-4C-3,C-4C-3,C-4反相反相反相反相保留保留保留保留值值值值小，适合小，适合小，适合小，适合肽类肽类肽类肽类和蛋白和蛋白和蛋白和蛋白质质质质苯基苯基苯基苯基反相反相反相反相保留适中，保留适中，保留适中，保留适中，选择选择选择选择性不同。非极性、中等极性性不同。非极性、中等极性性不同。非极性、中等极性性不同。非极性、中等极性化合物化合物化合物化合物-CN-CN-CN-CN反相、正相反相、正相反相、正相反相、正相选择选择选择选择性与硅胶性与硅胶性与硅胶性与硅胶类类类类似，保留小，用途广似，保留小，用途广似，保留小，用途广似，保留小，用途广-NH-NH-NH-NH2 2 2 2反相、正相反相、正相反相、正相反相、正相分离糖分离糖分离糖分离糖类类类类、核苷酸、固醇等、核苷酸、固醇等、核苷酸、固醇等、核苷酸、固醇等二醇基二醇基二醇基二醇基正相正相正相正相分离有机酸、排阻分蛋白分离有机酸、排阻分蛋白分离有机酸、排阻分蛋白分离有机酸、排阻分蛋白质质质质等等等等醚醚醚醚基基基基反相、正相反相、正相反相、正相反相、正相分离酚分离酚分离酚分离酚类类类类、芳硝基化合物，保留比、芳硝基化合物，保留比、芳硝基化合物，保留比、芳硝基化合物，保留比C-18C-18C-18C-18强强强强聚苯乙聚苯乙聚苯乙聚苯乙烯烯烯烯基基基基反相反相反相反相pHpHpHpH使用范使用范使用范使用范围围围围广，广，广，广，对对对对部分分离峰形好，寿命部分分离峰形好，寿命部分分离峰形好，寿命部分分离峰形好，寿命长长长长常用固定相应用举例应用举例（3 3）流动相）流动相n n表征溶剂特性的重要参数n n溶溶溶溶剂剂剂剂强强强强度度度度：溶溶剂剂分分子子与与吸吸附附剂剂的的亲亲合合程程度度，越大，亲合力约大。越大，亲合力约大。n n溶溶解解度度参参数数：衡衡量量溶溶剂剂极极性性强强度度的的指指标标，越越大大，极极性性越越强强。是是溶溶剂剂和和溶溶质质分分子子间间色色散散力力、偶偶极极力力、接接受受质质子子或或给给予予质质子子能能力力的的总总和和。所所以以相相近近的的混混合合溶溶剂，它的选择性剂，它的选择性不同。不同。n n极极性性参参数数P P：溶溶剂剂与与乙乙醇醇、二二氧氧六六环环、硝硝基基甲甲烷烷相相互作用的度量，比较全面的反映了溶剂的性质。互作用的度量，比较全面的反映了溶剂的性质。n n粘度粘度：溶剂溶剂EPxexdxn正己烷正己烷1.880.300.017.30.1四氢呋喃四氢呋喃7.60.460.579.14.00.380.200.42乙腈乙腈37.50.340.6511.85.80.310.270.42甲醇甲醇32.70.540.9512.95.10.480.220.31水水78.50.892110.20.370.370.25n n 溶剂的选择原则n n溶剂具有稳定的化学性质溶剂具有稳定的化学性质n n溶溶剂剂的的选择选择与使用的与使用的检测检测器要有相容性器要有相容性n n溶溶剂剂的粘度要小的粘度要小n n溶溶剂剂的沸点不能太低的沸点不能太低n n溶溶剂剂的的纯纯度要高且价格便宜度要高且价格便宜 n n正正正正相相相相：正正正正己己己己烷烷烷烷、正正正正庚庚庚庚烷烷烷烷、乙乙乙乙醚醚醚醚、二二二二氯氯氯氯甲甲甲甲烷烷烷烷、氯氯氯氯仿仿仿仿等等等等，己己己己烷烷烷烷为为为为主主主主体体体体，加加加加入入入入质质质质子子子子接接接接受受受受体体体体乙乙乙乙醚醚醚醚或或或或甲甲甲甲基基基基叔叔叔叔丁丁丁丁基基基基醚醚醚醚，质质质质子子子子给给给给予予予予体体体体氯氯氯氯仿仿仿仿，偶偶偶偶极极极极溶溶溶溶剂二氯甲烷剂二氯甲烷剂二氯甲烷剂二氯甲烷 n n反反反反相相相相：水水水水、甲甲甲甲醇醇醇醇、乙乙乙乙腈腈腈腈、四四四四氢氢氢氢呋呋呋呋喃喃喃喃、乙乙乙乙醇醇醇醇及及及及其其其其混混混混合合合合物物物物等等等等，以以以以水水水水为为为为主主主主体体体体，加加加加入入入入质质质质子子子子接接接接受受受受体体体体甲醇，质子给予体乙腈，偶剂溶剂四氢呋喃。甲醇，质子给予体乙腈，偶剂溶剂四氢呋喃。甲醇，质子给予体乙腈，偶剂溶剂四氢呋喃。甲醇，质子给予体乙腈，偶剂溶剂四氢呋喃。应用举例应用举例2.液固色谱法（1 1）分离机理）分离机理 以以固固体体吸吸附附剂剂为为固固定定相相的的液液相相色色谱谱法法。由由于于溶溶质质分分子子和和流流动动相相分分子子在在吸吸附附剂剂表表面面的的吸吸附附活活性性中中心心上上进进行行竞竞争争吸吸附附，这这种种竞竞争争吸吸附附形形成成不不同同溶溶质质在在吸吸附附剂剂表表面面的的吸吸附附、解解吸吸平平衡衡。平平衡衡常常数的不同导致不同溶质得以分离。数的不同导致不同溶质得以分离。（2 2）固定相）固定相 极性极性固定相固定相：硅胶硅胶硅胶硅胶、氧化镁、氧化铝等、氧化镁、氧化铝等 非非极极性性固固定定相相：活活性性炭炭、高高分分子子多多孔孔微微球球、碳多孔微球等碳多孔微球等 （3 3）流动相）流动相n n越越大大，洗洗脱脱力力越越强强。合合适适的的洗洗脱脱强强度度可可通通过混合溶剂来得到过混合溶剂来得到n n硅硅胶胶为为固固定定相相时时：以以弱弱极极性性的的正正构构烷烷烃烃为为主主体体，加加入入二二氯氯甲甲烷烷等等中中等等极极性性溶溶剂剂调调节节合合适适的的洗洗脱脱强度。强度。n n可可用用水水对对硅硅胶胶进进行行减减活活处处理理，或或加加入入四四氢氢呋呋喃喃、乙腈、甲醇、异丙醇等改性剂乙腈、甲醇、异丙醇等改性剂举例举例（4 4）应用）应用n n中中等等分分子子量量的的油油溶溶性性样样品品如如油油品品、脂脂肪肪、芳芳烃等烃等n n不同极性取代基的化合物不同极性取代基的化合物n n结构异构体和几何异构体混合物的分离结构异构体和几何异构体混合物的分离应用举例应用举例3.离子对色谱法（1 1）分离机理）分离机理n n将一种或数种与样品离子电荷（将一种或数种与样品离子电荷（将一种或数种与样品离子电荷（将一种或数种与样品离子电荷（A A A A+）相反的离相反的离相反的离相反的离子子子子(B(B(B(B-)（称为对离子或反离子）加入到色谱系称为对离子或反离子）加入到色谱系称为对离子或反离子）加入到色谱系称为对离子或反离子）加入到色谱系统流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性统流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性统流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性统流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对（中性缔合物）的分离方法。多为反的离子对（中性缔合物）的分离方法。多为反的离子对（中性缔合物）的分离方法。多为反的离子对（中性缔合物）的分离方法。多为反相离子对色谱相离子对色谱相离子对色谱相离子对色谱 （2 2）固定相、流动相和离子对试剂固定相、流动相和离子对试剂n n固定相：固定相：固定相：固定相：多为多为多为多为C18,C8C18,C8C18,C8C18,C8反相键合相反相键合相反相键合相反相键合相n n流流流流动动动动相相相相：以以以以水水水水为为为为主主主主的的的的缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液，或或或或水水水水-甲甲甲甲醇醇醇醇、水水水水-乙腈等混合溶剂乙腈等混合溶剂乙腈等混合溶剂乙腈等混合溶剂n n离离离离子子子子对对对对试试试试剂剂剂剂：四四四四丁丁丁丁基基基基铵铵铵铵正正正正离离离离子子子子、十十十十六六六六烷烷烷烷基基基基三三三三甲甲甲甲基铵正离子，基铵正离子，基铵正离子，基铵正离子，ClOClOClOClO4 4 4 4-，十二烷基磺酸根等十二烷基磺酸根等十二烷基磺酸根等十二烷基磺酸根等 （3 3）应用）应用有机酸、有机碱特别是强酸有机酸、有机碱特别是强酸有机酸、有机碱特别是强酸有机酸、有机碱特别是强酸强碱的分析，如羧酸、磺酸、强碱的分析，如羧酸、磺酸、强碱的分析，如羧酸、磺酸、强碱的分析，如羧酸、磺酸、胺类、酚类、药物、染料等胺类、酚类、药物、染料等胺类、酚类、药物、染料等胺类、酚类、药物、染料等4.离子色谱法(1)(1)分离机理分离机理n n试样中的离子与离子交换树脂上的离子发生反应：试样中的离子与离子交换树脂上的离子发生反应：试样中的离子与离子交换树脂上的离子发生反应：试样中的离子与离子交换树脂上的离子发生反应：阳离子交换：阳离子交换：阳离子交换：阳离子交换：树脂树脂树脂树脂SOSOSOSO3-3-3-3-H H H H+M+M+M+M+=树脂树脂树脂树脂SOSOSOSO3-3-3-3-M M M M+H+H+H+H+阴离子交换：阴离子交换：阴离子交换：阴离子交换：树脂树脂树脂树脂NRNRNRNR3+3+3+3+ClClClCl-+X+X+X+X-=树脂树脂树脂树脂NRNRNRNR3+3+3+3+X X X X-+ClClClCl -n n不不不不同同同同的的的的离离离离子子子子与与与与树树树树脂脂脂脂离离离离子子子子的的的的交交交交换换换换能能能能力力力力（亲亲亲亲和和和和能能能能力力力力）不不不不同，亲和力越大，离子越难洗脱，从而得以分离。同，亲和力越大，离子越难洗脱，从而得以分离。同，亲和力越大，离子越难洗脱，从而得以分离。同，亲和力越大，离子越难洗脱，从而得以分离。n n离子交换色谱与离子色谱的分离原理一样离子交换色谱与离子色谱的分离原理一样离子交换色谱与离子色谱的分离原理一样离子交换色谱与离子色谱的分离原理一样n n离子色谱最大的改进是解决了微量组分的检离子色谱最大的改进是解决了微量组分的检离子色谱最大的改进是解决了微量组分的检离子色谱最大的改进是解决了微量组分的检测问题测问题测问题测问题 双柱抑制型：双柱抑制型：双柱抑制型：双柱抑制型：在分离柱和检测器之间加一个化学抑制在分离柱和检测器之间加一个化学抑制在分离柱和检测器之间加一个化学抑制在分离柱和检测器之间加一个化学抑制器，其作用有二，一是降低淋洗液的背景电导，二是器，其作用有二，一是降低淋洗液的背景电导，二是器，其作用有二，一是降低淋洗液的背景电导，二是器，其作用有二，一是降低淋洗液的背景电导，二是增加被测离子的电导值，改善信噪比。灵敏度高。增加被测离子的电导值，改善信噪比。灵敏度高。增加被测离子的电导值，改善信噪比。灵敏度高。增加被测离子的电导值，改善信噪比。灵敏度高。单柱非抑制型：单柱非抑制型：单柱非抑制型：单柱非抑制型：淋洗液直接进入电导检测器。简单、淋洗液直接进入电导检测器。简单、淋洗液直接进入电导检测器。简单、淋洗液直接进入电导检测器。简单、分辨率较好。分辨率较好。分辨率较好。分辨率较好。（2 2）固定相）固定相 离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂，最最最最常常常常用用用用的的的的是是是是乳乳乳乳胶胶胶胶薄薄薄薄壳壳壳壳型型型型离离离离子子子子交交交交换换换换树树树树脂脂脂脂小小小小球球球球，根根根根据据据据功功功功能能能能基基基基可可可可分分分分为为为为：强强强强酸酸酸酸型型型型（磺磺磺磺酸酸酸酸基基基基团团团团）、强强强强碱碱碱碱型型型型（季季季季铵铵铵铵基基基基）、弱弱弱弱酸酸酸酸型型型型（羧羧羧羧酸酸酸酸）、弱碱型（伯、仲、叔胺）弱碱型（伯、仲、叔胺）弱碱型（伯、仲、叔胺）弱碱型（伯、仲、叔胺）（3 3）流动相流动相 双双双双柱柱柱柱抑抑抑抑制制制制型型型型：分分分分离离离离阳阳阳阳离离离离子子子子，一一一一般般般般采采采采用用用用无无无无机机机机酸酸酸酸如如如如HClHClHClHCl，HNOHNOHNOHNO3 3 3 3等；分离阴离子，一般采用等；分离阴离子，一般采用等；分离阴离子，一般采用等；分离阴离子，一般采用NaOHNaOHNaOHNaOH、NaHCONaHCONaHCONaHCO3 3 3 3/NaCO/NaCO/NaCO/NaCO3 3 3 3。单单单单柱柱柱柱非非非非抑抑抑抑制制制制型型型型：分分分分离离离离阳阳阳阳离离离离子子子子，用用用用低低低低浓浓浓浓度度度度的的的的HClHClHClHCl，HNOHNOHNOHNO3 3 3 3等等等等；分离阴离子，可用苯甲酸及其盐、酒石酸、柠檬酸等分离阴离子，可用苯甲酸及其盐、酒石酸、柠檬酸等分离阴离子，可用苯甲酸及其盐、酒石酸、柠檬酸等分离阴离子，可用苯甲酸及其盐、酒石酸、柠檬酸等（4 4）应用）应用n n分析无机阴离子的首分析无机阴离子的首分析无机阴离子的首分析无机阴离子的首选选选选方法方法方法方法n n还还还还可可可可用用用用于于于于分分分分析析析析无无无无机机机机阳阳阳阳离离离离子子子子，有有有有机机机机酸酸酸酸、碱碱碱碱，糖糖糖糖类类类类、蛋白、蛋白、蛋白、蛋白质质质质等。等。等。等。应用举例应用举例5.体积排阻色谱法（SEC）(1)(1)分离原理分离原理n n以以以以多多多多孔孔孔孔凝凝凝凝胶胶胶胶为为为为固固固固定定定定相相相相，利利利利用用用用精精精精确确确确控控控控制制制制的的的的凝凝凝凝胶胶胶胶孔孔孔孔径径径径，使样品中不同分子大小的组分得以分离。使样品中不同分子大小的组分得以分离。使样品中不同分子大小的组分得以分离。使样品中不同分子大小的组分得以分离。V V V VR R R R=V=V=V=V0 0 0 0+K+K+K+KD D D DVp Vp Vp Vp 0K 0K 0K 0KD D D D1.01.01.01.0n n洗洗洗洗脱脱脱脱体体体体积积积积在在在在V V V V0 0 0 0 和和和和V V V V0 0 0 0 +VpVpVpVp之之之之间间间间，峰峰峰峰容容容容量量量量有有有有限限限限，10-1210-1210-1210-12个峰个峰个峰个峰n n用于分离分子大小差大于用于分离分子大小差大于用于分离分子大小差大于用于分离分子大小差大于10%10%10%10%的的的的样样样样品品品品分离原理示意图分离原理示意图n n使使使使用用用用水水水水溶溶溶溶液液液液的的的的凝凝凝凝胶胶胶胶过过过过滤滤滤滤色色色色谱谱谱谱法法法法（GFCGFCGFCGFC），主主主主要用于分析多肽、蛋白质、核酸、多糖等。要用于分析多肽、蛋白质、核酸、多糖等。要用于分析多肽、蛋白质、核酸、多糖等。要用于分析多肽、蛋白质、核酸、多糖等。n n使使使使用用用用有有有有机机机机溶溶溶溶剂剂剂剂的的的的凝凝凝凝胶胶胶胶渗渗渗渗透透透透色色色色谱谱谱谱法法法法(GPC)(GPC)(GPC)(GPC)，主主主主要要要要用用用用于于于于高高高高聚聚聚聚物物物物（如如如如聚聚聚聚乙乙乙乙烯烯烯烯、聚聚聚聚氯氯氯氯乙乙乙乙烯烯烯烯等等等等）分子量的测定分子量的测定分子量的测定分子量的测定（2 2）固定相）固定相n n软软软软质质质质凝凝凝凝胶胶胶胶：如如如如交交交交联联联联葡葡葡葡聚聚聚聚糖糖糖糖等等等等，水水水水相相相相分分分分离离离离生生生生化化化化体体体体系系系系，适于低、中压操作适于低、中压操作适于低、中压操作适于低、中压操作n n半半半半刚刚刚刚性性性性凝凝凝凝胶胶胶胶：较较较较高高高高交交交交联联联联度度度度的的的的苯苯苯苯乙乙乙乙烯烯烯烯、二二二二乙乙乙乙烯烯烯烯苯苯苯苯共共共共聚聚聚聚物，有机相洗脱，可承受物，有机相洗脱，可承受物，有机相洗脱，可承受物，有机相洗脱，可承受10Mpa10Mpa10Mpa10Mpa的压力的压力的压力的压力n n硬质凝胶硬质凝胶硬质凝胶硬质凝胶n n高交联度苯乙烯、二乙烯苯共聚物高交联度苯乙烯、二乙烯苯共聚物高交联度苯乙烯、二乙烯苯共聚物高交联度苯乙烯、二乙烯苯共聚物：凝胶渗透色谱法凝胶渗透色谱法凝胶渗透色谱法凝胶渗透色谱法n n多孔球形硅胶多孔球形硅胶多孔球形硅胶多孔球形硅胶：凝胶过滤色谱法、凝胶渗透色谱法凝胶过滤色谱法、凝胶渗透色谱法凝胶过滤色谱法、凝胶渗透色谱法凝胶过滤色谱法、凝胶渗透色谱法n n羟基化聚醚多孔微球羟基化聚醚多孔微球羟基化聚醚多孔微球羟基化聚醚多孔微球：凝胶过滤色谱法凝胶过滤色谱法凝胶过滤色谱法凝胶过滤色谱法 （3 3）流动相）流动相n n改改改改善善善善分分分分离离离离主主主主要要要要通通通通过过过过固固固固定定定定相相相相来来来来实实实实现现现现。流流流流动动动动相相相相的的的的选选选选择择择择原原原原则则则则是是是是：溶溶溶溶解解解解样样样样品品品品、与与与与凝凝凝凝胶胶胶胶浸浸浸浸润润润润、与与与与检检检检测测测测器器器器匹配、粘度小。如四氢呋喃；缓冲溶液匹配、粘度小。如四氢呋喃；缓冲溶液匹配、粘度小。如四氢呋喃；缓冲溶液匹配、粘度小。如四氢呋喃；缓冲溶液（4 4）应用）应用n n大分子的分离分析大分子的分离分析大分子的分离分析大分子的分离分析n n聚合物分子量分布的测定聚合物分子量分布的测定聚合物分子量分布的测定聚合物分子量分布的测定应用举例应用举例1.聚乙二醇聚乙二醇40000 2.40000 2.聚乙二醇聚乙二醇10000100003.3.聚乙二醇聚乙二醇3000 4.3000 4.聚乙二醇聚乙二醇1000 5.1000 5.聚乙二醇聚乙二醇6.液相色谱分离类型及条件选择液相色谱分离类型及条件选择n选择合适的液相色谱分离类型选择合适的液相色谱分离类型 了解分析对象了解分析对象n要分析的组分的大致浓度n干扰物质 n试样的性质试样的性质结构结构分子量分子量酸碱性酸碱性溶解性溶解性溶于水排阻色谱，水为流动相相对分子质量2000不溶于水排阻色谱，非水流动相同系物键合相色谱不溶于水异构体液固色谱样品分子大小差异排阻色谱反相键合相色谱相对分子质量溶于水，不离解2000排阻色谱，水为流动相碱阳离子色谱溶于水，可离解酸阴离子色谱溶于水，离子与非离子溶于水，离子与非离子反相离子对色谱反相离子对色谱n选择合适的分析条件选择合适的分析条件n n色谱柱色谱柱n n流动相流动相n n检测器的种类及条件（波长等）检测器的种类及条件（波长等）n n样品的样品的预处理预处理方法方法标准银杏提取物中中银杏内酯的含量测定标准银杏提取物中中银杏内酯的含量测定标准银杏提取物中中银杏内酯的含量测定标准银杏提取物中中银杏内酯的含量测定6%6%的内酯，的内酯，的内酯，的内酯，24%24%的黄酮的黄酮的黄酮的黄酮不汽化不汽化不汽化不汽化紫外末端吸收紫外末端吸收紫外末端吸收紫外末端吸收复杂、基体干扰较多复杂、基体干扰较多复杂、基体干扰较多复杂、基体干扰较多举例举例n n醇溶性、中性：反相键合相色谱法n n无紫外吸收：RI、ELS、MSn n含量低：ELSD、MSn n干扰大：净化，SPE、SFE反相键合相色谱法色谱柱：C18柱流动相：H2OMeOH THF(70:20:10)检测器：RI detector内标法定量讨论讨论液相色谱方法及主要分析条件选择液相色谱方法及主要分析条件选择1.1.地下水中酚类化合物的分析地下水中酚类化合物的分析2.2.矿泉水中无机阴离子的测定矿泉水中无机阴离子的测定3.3.去痛片中有效成分的分析去痛片中有效成分的分析4.4.链烷基磺酸盐的测定链烷基磺酸盐的测定5.5.蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量测定6.6.磷脂磷脂PhospholipidsPhospholipids的分离与分析的分离与分析色谱分析方法及条件选择色谱分析方法及条件选择n n 了解分析对象了解分析对象n n 明确分析要求明确分析要求n n 查找相关文献查找相关文献n n 确定分析方法确定分析方法n n 选择样品前处理方法选择样品前处理方法n n 优化分析条件优化分析条件n n 方法学验证方法学验证n n 样品测试样品测试奶制品中三聚氰胺的检测方法奶制品中三聚氰胺的检测方法主要难点：主要难点：常压熔点常压熔点354（分解），弱碱性，强极性（分解），弱碱性，强极性 奶制品干扰多奶制品干扰多1.高效液相色谱分析方法高效液相色谱分析方法离子对色谱法离子对色谱法样品预处理样品预处理1)沉淀离心去沉淀离心去蛋白蛋白2)固相萃取：固相萃取：阳离子交换固阳离子交换固相萃取柱相萃取柱未经样品前处理的奶粉样品未经样品前处理的奶粉样品经预处理后的奶粉样品经预处理后的奶粉样品n色谱柱：Polaris C18-A（4.6X250mmX5m）n缓冲液：10mM柠檬酸,10mM庚烷磺酸钠n流动相：缓冲溶液:乙腈=85:15n进样量：10uLn流速：1.0mL/minn柱温：40n波长：240nm2.液相色谱液相色谱-质谱联用质谱联用n nLC 参考条件a)a)色谱柱：强阳离子交换与反相C18混合填料，混合比例（1：4），150 mm2.0 mm（i.d.），5 m，或相当者。b)流动相：等体积的乙酸铵溶液和乙腈充分混合，用乙酸调节至pH=3.0后备用。c)进样量：10 L。d)柱温：40。e)流速：0.2 mL/min。基质匹配加标三聚氰胺的样品基质匹配加标三聚氰胺的样品LC-MS/MS 多反应监测质量色谱图多反应监测质量色谱图3.气相色谱气相色谱-质谱联用分析质谱联用分析n n样品的衍生化n nBSTFA Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide 双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺等n n毛细管气相色谱柱n n选择离子监测三聚氰胺衍生物三聚氰胺衍生物GC-MS 选择离子色谱图选择离子色谱图