家畜繁殖新技术.docx

家畜繁殖新技术繁殖新技术产生的源由：动物繁殖学为动物科学的专业基础课程动物繁殖学三大组成局部繁殖生理：生殖激素生殖生理配种受精妊娠分娩繁殖技术：人工授精同期发情胚胎移植体外受精等繁殖疾病：不育不孕生殖障碍影响繁殖技术进展的因素繁殖学是整个畜牧学科应用技术与理论讨论进展最快的一门学科，繁殖技术乂是现代生物工程 技术（Biotechnology）的基础。前者表达在生殖内分泌的讨论进展一下丘脑对生殖的调控作用，后 者突出表现在核移植技术的胜利六次革命人类作出了三大创举：曼哈顿方案阿波罗登月方案人类基因组方案生物工程技术的概念：采用生物体系应用先进的生物学和工程技术加工或不加工底物原料以供 应所需的各种产品或到达某种目的的一门新型的生物科学技术。生物工程技术的作用：可大大 提高动物的繁殖效率提高生长速度降低生产本钱可转变畜产品的结构可培育人们需要的新的动 物品种可用动物代替生物反响器繁殖新技术的内容一生物工程技术在家畜繁殖上的应用基因 重组采用技术转基因细胞融合采用技术嵌合体胚胎与核移植技术核 移植组织培育采用技术一体外受精细胞大量培育技术一胚胎干细胞生物反响堆 与醵技术随工程胚胎分割的生理基础：胚胎发育早期的卵裂球具全能性即发育成一完整个体的力量胚胎分割的意义在于：可使可用胚胎数成倍生长、可获得遗传上几乎完全相同的后代、可作为 生物学讨论模型胚胎分割的方法归纳为四种：1、Willadsen的分割法程序：分割移入空透亮带双层琼脂包埋中间受体同种受体2、Williams的分割法程序：分割移入空透亮带同种受体3、玲木分割法程序：透亮带内分割注入大分子物质溶液同种移植4、简易分割法胚胎分割的应用前景1与胚胎移植结合可提高受胎率2可得到同卵双生后代在牛避开李生母犊不育3可作为抱负的试验讨论材料4为胚胎性别鉴 定供应了条件胚胎分割存在的一些问题1体重并非完全相同2毛色和斑纹往往有差异3生出的动物消失特别与畸形嵌合体：两个或两个以上受精卵发育的复合个体 嵌合体的制作：、聚合法1、胚胎聚合法（程序）：1）采集胚胎2）除去透亮带3）洗涤4）配对5）融合一一化学融合法（聚乙二醇法.仙台病毒法.外源凝集素法）一电融合法6）培育7）移植2、卵裂球聚合法（程序）（同胚胎聚合法）将两枚或两枚以上胚胎在除去透亮带后将离散的分裂球按需要取出共同放入一空透亮带内PHA集合琼脂包埋移植二、囊胚注入法又称向囊胚内注入细胞法优点：1）对着床需透亮带的动物非常有利2）既可制造ICM嵌合体又可使TR成为嵌合体三、囊胚重组法嵌合体的标记标记物必需满意的条件1）固定在细胞内的物质不能跑到细胞外2）稳定存在于最初标记的细胞及因分裂而增殖的细胞3）发育期间普遍存在于机体外组织4）应简洁识别5）在胚胎中应处于中性标记方法1）人工标记一活体染色素或油等珠状物放射性物质等2）遗传标记一反响生物个体或群体特征的某些性状物质体外受精：将动物的精子与卵子置于体外在人工条件下完成受精的过程称为体外受精体外受精的优点：基础讨论方面1能直接观看到受精的动态过程2可以得到难以得到的一些动物的受精卵应用讨 论方面3可以作为治疗不孕症的一种方法4可为其它新技术的应用供应更多的胚胎来源 体外受精的程序1配子获得输卵管卵+体内获能的精子输卵管卵+体外获能的精子卵泡卵+体内获能的精子卵泡 卵体+外获以能的精子1卵子的实行非激素处理法激素处理法2精子的实行屠宰法射出的精子2配子培育培育基单纯培育基复合培育基2.1 配子处理与培育系统精子处理DPercoll密度梯度离心法2）精子上游分别法精子孵育诱发获能+体液（卵泡液、血清等）+限定培育液或合成培育液方法1）高PH孵育法2）钙离子载体法3）肝素钙孵育法培育系统：开放式培育系统、封闭式培育系统和滴培育滴培育：培人皿一培育液一卵子一冲洗-石腊油一CO2培育箱培育（动物有特定温度表）卵子成熟的标志卵丘细胞的成熟判别：I）卵丘细胞的分散程度2）卵丘细胞内空泡变大3）卵丘细胞异染色质增多、核孔明显、核空泡化卵母细胞核的成熟判别：4）核迁移至动物极质膜下成为生发泡（Gcmiinal Vesicle。V）卵母细胞质的成熟判别：5）胞内皮质颗粒由匀散状态向质膜下迁移6）高尔基复合体由核四周移向皮质迁移一消逝7）线粒体由核四周皮质区核四周8）早期粗面内质网（RER）丰富成熟时RER削减授精（安排卵子到精子悬浮液中）过程看到的现象：1、在透亮带外表可以看到很多精子2、多精子受精频率增加3、精子超活化现象受精的标准1）少数动物卵母细胞内可见到精了2）卵母细胞质中有膨胀的精子头部3）卵周隙内存在其次极体或明确的第一极体4）卵子激活排出其次极体5）雌雄原核形成并融合6）卵周隙变大有时见到精子4影响受精的因素：温度精子数培育的条件牛体外受精操作程序：1配制配了洗涤液、培育液、受精液2采集处理配了- 3授精体外受精液中有关成分的作用1犊牛血清和血白蛋白乳酸丙酮酸2咖啡因和肝素3FSH 和 PMSG精子注射：把精子直接注射到透亮带下卵周隙中或留意到卵细胞质中有人将前者称为精子转移或精子植入，后者称为精子注射精子注射处理与要求：注入细胞质的精子可以是不活动的精子或精核注入卵周隙的精子应为活动的已获能的和已发生顶体反响的精子才能获得较高的受精率为 避开精子在注射针内移动必需限制精子活动：一是将精子加入含有甲基纤维素的粘稠培育液中 二是将精子冷却到10oC三是为便于精子注射可设法加大卵周隙：生精细胞显微受精生精细胞显微受精是采用变态前的球形精子细胞（次级精母细胞或初级精母 细胞）与不同发育时期的卯母细胞进行受精它包括透亮带下授精和卵母细胞质内受精3.1 意义与作用：揭示雌雄配子间的相互作用和受精本质保护和挽救濒危珍稀动物品种采用 初情期以前幼年动物繁殖后代治疗老龄与先天性特别引起的雄性动物不育症假设用精细胞进行转 基因所得的后代肯定是全部携带目的基因的个体将分别到体外的精细胞移植到睾丸中没有精细 胞的小鼠曲精细管内可获得移植精细胞发育的后代3.2 方法电融合法卵胞质内注射法3.3 技术讨论与应用细胞周期与卵激活差异正常受精卵子停滞于其次次减数分裂中精子已完成减数分裂显微受精显微受精胜利的动物与存在问题胜利的动物：小鼠刘灵等仑鼠兔存在的问题：2/3的雄原核较小但不影响胚胎进一步发育ICSI与IFV比较25%受精卵不能同步形成雌雄原核7%受精卵可能形成3个原核体外受精胚胎在体外的发育往往不能与子宫完全同期化，在囊胚移植时需要做帮助脱出透亮带处理，而且体外受精的结果不同。核移植1、概念：借助显微操作和细胞融合技术把遗传型不同的胚胎细胞核和卵细胞质相结合重组成新 的合子的过程得到的胚胎称为重组胚（reconstiluled embryos）或核移植胚2目的：I）查明胚胎细 胞核和体细胞核是否保持合了细胞核的全部遗传信息2）体细胞核是否能代替合子核所起的作用3）转移供体核基因生产多个同基因动物4）作为动物和人类疾病模型5）作为生产药物的自然 工厂现代生物学中克隆技术又称为“生物放大技术”它经受三个进展阶段：1）微生物克隆2）生物技术克隆3）动物克隆克隆技术进展的过程哺乳动物核移植的 起始人 Mcgranth 和 Sol ter第一个报道胜利的是Illmensee和Hope二核移植必需具备的条件1显微操作设施2制作吸管装置3体外培育系统三核移植的方法I核供/受体细胞来源与当前需要解决的问题核供体：胚胎细胞：目前主要是用桑根期前的卵裂球成体细胞：胎儿的成纤维细胞乳腺上皮细胞输卵管细胞卵丘细胞孤雌生殖细胞成体细胞从增殖的角度可分为三类：1）连续分裂细胞2）休眠细胞 3）分化细胞核受体：处于中期II的卵母细胞调整细胞周期的方法其一采纳人I：捕获的方法，即通过限制细胞培育基中某些成份，从而使大局部细胞滞留在细胞 周期的某一阶段；其二通过选择细胞类型来获得当前需要解决的问题：远缘细胞核移植受体细胞选择关于核供体和核受体细胞质的协调性重构胚的卵裂速度与供核体细胞的发育速度全都与生殖系 统关系越亲密的细胞重构胚发育潜力越大核质重构后代性状主要与供体相像或为核质混合状态 性别掌握方法X和Y精子的分别X和Y精子的分别方法A沉降法B密度梯度离心法：C电泳法D流式细胞分选法性别鉴定1非损害性方法1）测定与X染色体相关联的酶的活性2）免疫法（H-Y抗原法或单克隆抗体法）方法：免疫动物选择（高度近交系）制备抗血清HY抗原检测A细胞毒性分析法B免疫荧光分析法C囊胚形成抑制法；2损害性方法1）细胞遗传学分析（又称核型鉴定）特点精确率100%获得高质量的中期染色体分裂相难取样滋养层细胞卵裂球分割半胚2）分子生物学分析法（DNA探针（原位杂交技术FISH） 方法以待检测的核酸序列为模板 用TAQ酶催化引物 限制DNA合成经变性 退火 延长三 个步骤可使扩增片断以2N的指数积累即在2小时内使待检测的核酸扩展数百万倍特点特异好 灵敏度高简便快速难点分别Y染色体序列分别SRY序列确定序列位置及拷贝数转基因是将特定的外源基因导入动物受精卵或胚胎使之稳定整合于动物的染色体组并能遗传给 后代的技术。能检测出导入新DNA的动物就称为转基因动物。通过使用试验手段将外源基因导入动物的生殖细胞并由此发育成个体且整合外源基因又能向后 代遗传的动物称为转基因动物。携带外源基因并能表达遗传的动物称为转基因动物而外源基因可能只整合入动物局部组织、细 胞的基因组，称为嵌合体动物。转基因的意义经典育种方法的限制性遗传信息只能在同种或亲缘关系很近的种间才有可能交换重组选择的条 件是变异或突变自然变异的比例缺乏1%可在没有亲缘关系的种间进行遗传信息交换和重组可 在很短时间产生听从于人们需要的突变详细表现在：可作为生命现象解密的工具1）转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病学和治疗性讨论；2）可以提高家畜的经济性状3）可从遗传上转变畜产品的组成结构4）以家畜为宿主生产有用的生理活性物质转基因技术的优点：可以培育诞生产性状优良的超级动物群可以制备出高增殖的蛋白和激素类药物可以按人的需求 供应动物产品二家畜转基因的方法原生质体融合法重组病毒感染法微细胞介导法高速冷冻法细胞融合法显微 注射法精了 载体法胚胎细胞介导法逆转录病毒法等乳腺暂态表达家畜转基因的方法I 显微注射法（microinjection）在显微镜下借助玻璃微吸管将外源基因注射进细胞的一种方法。这种方法是建立得最早 也是最有效的方法其最大的优点是基因转移率高不需原核载体DNA片段导入外源基因长度可 达 lOOkb2精子我体法既往精子作载体所采纳的方法为体外孵育法，如今有采纳体内转染法：这其中可将外源基因直 接导入精细管，可直接导入附睾管。3胚胎干细胞介导法这种方法的优点：囊胚腔易于注射整合率高（50%）可在体外对靶细胞进 行基因的定位插入整合可对目的基因型干细胞进行克隆难点：EK/ES细胞株的建立4 原始生殖细胞介导法原始生殖细胞（Prmordial Germ Cell,PGCs）介导法与ES法技术原理和 方法相像。5逆转录病毒感染法（Retroviruses）方式：1） 4-8细胞胚胎先去除透亮带与反转录病毒共培育病毒感染胚细胞一病毒的RNA被逆转录成病毒DNA这样DNA就可能被整合到胚胎细胞中去一 体外培育1624小时移入受体。2）将浓缩的病毒或产生病毒的细胞注射到48细胞的透亮带下同上。优点：无需显微操作感染率高宿主范围广可以同时处理大量胚胎外源基由于单拷贝整合可直接进行囊 胚腔注射。缺点：1）得到的大局部是嵌合体外源基因遗传给后的很少2）每一基因都要构建一个重组逆 转录病毒载体3）这种载体容量小通常为7kb大于9.4kb就不稳定 6、非病毒载体介导法脂质体介导法：脂质体介导的基因转移技术使用便利、本钱低廉。基本原理:采用阳离子脂质体 单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过 细胞内吞作用将外源DNA （即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。受体介导法 7体细胞核移植法（转基因+克隆）将外源基因导入到体细胞中，再将该细胞进行培育，选择其中带有外源基因的细胞进行扩增， 用这种细胞的细胞核进行核移植（把体细胞核植入一个去了核的卵母细胞中，融合并激活），将 重组胚进行体外培育或者植入同步化的假孕动物的输卵管。Q里腺智太亮法乳腺基因篇入的方法有两种：乳头管导入法乳腺直接导入法不同转基因方法技术效果比较1显微注射法优点：外源DNA大小基本不受限制（l-50kb）；导入过程直观；整合率高；缺点：设施昂贵、环节较多对操作人员有较高的技术要求低效率（尤其是大家畜）对卵子损害大，胚胎存活率低基因整合随机性转基因缄默2胚胎干细胞介导法优点：外源基因整合状况的可控性高可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性 外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选便利缺点：ES细胞系建立及培育困难：维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易；所得个体为嵌合体：3逆转录病毒感染法优点：受精卵携带外源基因的阳性率高；外源基因多单拷贝整合；操作简洁，避开注射法对卵子的损害；宿主范围广；可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高；缺点：容纳大小有限；潜在致癌性，载体简单；整合率不高，胚胎自我保护机制对其有抗性；与微注射相比，对插入序列的容量有限，总长大于9.4Kb,就不稳定或很难成活，通常为7Kb。 通过这种方法引入的DNA的表达取决于内部的启动子。4体细胞核移植法优点：转基因效率显著超过显微注射 可以便利的建立生产畜群 可以猜测基因表达水平可以使用定点整合目标基因的技术5YAC 法采用酵母人工染色体（Y A C）作为载体制作转基因动物的方法。酵母人工染色体（YAC）载体是近年来进展起来的新型教体，能克隆百万对碱基的大片段D N A。优点：保证大片段DNA的完整性保证较长外源片段在转基因动物讨论中的整合率高保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性，因而可以消退或减弱基因整合后的位置效应。因此 YA C介导法制备转基因动物具有宽阔的应用前景。转基因的整合和表达外源基因的整合的机 制H前尚不清晰，整合效率与DNA的浓度，结构形式,以及卵母细胞来源都有肯定关系外源基因 在转基因动物体内的表达主要有三种方式：A、细胞内特异表达，大多为这种方式，表达量与内源基因相像：B、外源基因在全部器官显著表达，转变了动物表型和原来外形；C、外源基因在动物发育的适当时期与内源基因一起激活。大局部转基因在宿主基因组中 的表达比较低的，之前对这种现象的解释是转基因受位置效应的影响。现在认为之所以不表达是 由于多拷贝重复序列导致了该区域异染色质化,从而使转基因缄默。培育转基因家畜的技术问题第一是技术本身的问题：理论基础积累缺乏和技术不完全，结果随机整合，且整合率低；家畜 的外源基因的整合率低于试验动物。一般是高度近交系品种整合具有稳定性。表达率不高，产生 的转基因动物效率低。不了解基因表达的发育掌握和组织特异性掌握。其次是家畜本身的问题：排卵数的差异，卵细胞透亮度差，采集原核期胚胎的精确时间难以把握，妊娠期长产仔数少费时耗资大。六基因敲除和基因嵌入技术基因敲除简洁的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除基因嵌入（gene knock in）又称基因置换，它是采用内源基因序列两侧或外面的断裂点，用同源序 列的目的基因整个置换内源基因。干细胞：是具有自我复制和多项分化潜能的原始细胞胚胎干细胞简称ES/EK细胞，是一种从小期胚胎ICM或原始生殖细胞（Primodial Garni Cells PGCs）图，经体外分化抑制培育分别和克隆得到的具全能性的细胞（图6-3）。2干细胞的类型（表6-1）成体干细胞胚胎干细胞（全能性多能性一多向分化/跨系分化 单向）一讨论进展1958年Stevens最早觉察畸胎瘤细胞（Embryonic carcinoma cell EC）,他通过把小鼠早期胚胎 移植到129只小鼠精巢或肾脏的被膜下得到EC细胞。这些细胞可在体外进行培育，被用作讨 论动物胚胎发育与遗传，以及细胞诱导分化的试验模型与正常胚胎的未分化细胞极为相像 胚奖体。注入囊胚可形成嵌合体（但常会形成肿瘤或导致胚胎死亡）有胚胎细胞发育的多能性 在体外能不断增殖并保持不分化的状态多数EC细胞不具正常的二倍体核型，染色体数也不完整 ES细胞的特征：全能性和相当于4一4.5日龄的胚胎细胞；具胚胎细胞特征核型，为正常二 倍体；具外分化力量，皮下接种可产生畸胎瘤。目前讨论的侧重点在于：1）ES细胞系的建立条件2）影响因素的研讨3）细胞核型的稳定性及变异4）ES细胞系的采用途径用PGCS建立干细胞系虽然由于其迁移特性导致贴壁率较低但来源比较丰富一存在问题：不同细胞系和同一细胞系不同亚系之间细胞的多能性和注射到胚胎腔后参加生殖系典型嵌合的力量不同分别到的ES细胞在以后的培育中由于试验室的条件不同或培育 条件中某些不良因子作用和积累以及倍增水平的增加ES细胞的染色体也会消失不稳定。胞质对后代的影响还有待讨论克隆胚的培育冷冻及重复克隆仍有待改进和提高体细胞克隆其技术 还待完善和提高胜利率 大型动物克隆还有亟待解决的问题二建立ES细胞系的方法与步骤1建立ES细胞系的条件使ES细胞成千上万倍的克隆而不分化STO （小鼠成纤维细胞无限系）成纤维细胞PMEF （原始成纤维细胞）前者国外已 商品化饲养层细胞具上述作用的缘由：这两面类细胞可释放出成纤维细胞生长和分化抑制因子, 如白血病抑制因子2饲养层细胞的制备用STO或胎儿成纤维细胞试验说明后者优于前者方法：1）取适龄的胎儿一去头内脏及血管一剪粹一蛋白酶消化一取细胞液一置DMEM中培育 细胞贴壁生长后一胰蛋白防消化分别细胞一培育2）生长抑制处理一是辐照二是 加丝裂霉 素3 ES细胞的分别：ES细胞取自附植前的胚胎措施：一要 选择适当胚龄的胚胎二要 采纳正确的分化抑制物方式一是免疫外科手术法消化透亮带、滋养层细胞以暴露内细胞团二是直接机械剥离法将胚胎培育至孵出囊胚阶段然后用机械方法直接捡出内细胞团细胞前一种 方法，分别率高，所得细胞的数量多，但简单繁琐；后一种方法简洁易行，但滋养层细胞不易 去除洁净。 如何确定内细胞团细胞的全能性：目前多采纳AKP和SSEA-1进行检测三是 热休克法四是延缓着床法4 ES细胞的培育ES细胞在经处理的饲养层细胞上培育液是DMEM 其中还要添加血清、B筑基乙醇、四种核甘酸及少量必需氨基酸抗菌素等值得留意的是：1） 培育时准时定期更换培育液2）细胞系生成后要准时转移消化、克隆传代或冷冻保存 5 ES 细胞系的验证明体外细胞形态特征体积大小全都细胞核大胞质胞浆少细胞排列紧密边缘整齐完 整核型上可见核和核仁与完整的染色体数和整倍体核型 在没有饲养层的状况下体外悬浮培 育能分化成多种组织体内将ES细胞注射至皮下产生畸胎瘤或与正常胚胎嵌合构成嵌合体 三应用前景研讨早期胚胎发育的条件1 讨论早期胚胎组织分化的发生与诱导3用ES细胞与正常胚胎细胞嵌合在体外重建胚胎三种方法核移植法细胞聚合法囊胚注射法 重组前可依据目的和试验设计需要对ES细胞进行处理得到特别用途的动物4 ES细胞体外定位整合外源DNA对于讨论有关早期胚胎发育与表达中基因的活动及其功 能有非常重要的意义：采用ES细胞体外定位整合外源DNA通过对特定基因的灭活或修复得到转化的ES细胞可以在体外培育中观看其细胞生理 及生化性质变化引入动物种系后可间接了解基因的功能与作用机理可通过动物模型对人类的某 些遗传疾病进行模拟定位，整合的原理是DNA的同源重组其程序：构建同源序列（靶序列） -引入ES细胞产生同源重组（即外源DNA取代与其同源的染色体DNA片断而进入受 体基因组）引入的方法：病毒感染法显微注射法电穿孔导入法基因打靶：I）选定要改造的基因2）克隆该基因的全部或局部DNA序列（靶序列）3）克 隆靶序列的载体（靶载体）插入或目的基因靶序列从靶载体上切下来筛选整合外 源DNA的ES细胞构建嵌合体关于ES细胞的讨论在人类疾病的治疗具有重要的潜在价值干细胞又一个重要的潜在用途是生产细胞和组织，它们可用于所谓的“细胞疗法很多疾 病及功能失调往往是由于细胞功能障碍或组织破坏所致。虽然这项讨论有着极为迷人的前景，但要使其成为现实，尚有很多工作和技术挑战等着我 们去解决。首先我们必需做些基础讨论，以理解导致人体中细胞特化的细胞大事，从而能够指 导这些多能干细胞发育成移植所需的特别组织类型。其次，在采用这些细胞进行移植之前，还 必需克服免疫排斥问题。由了来自胚胎或胎儿组织的人体多能干细胞与移植受者在遗传上有差 异，因此将来的讨论将集中于转变人体多能干细胞，将组织不相容性降到最低，或是创立具有 通用组织类型的组织库。ES细胞的分别培育原那么上应满意两个条件：1促进ICM细胞增殖1）培育基 DMEM 适 用于生长速度快贴壁性差的细胞Evans和Kaufman2）添加剂的运用非必需氨基酸柠檬酸核疔酸硒酸钠丙酮酸钠等（作为蛋白质合成原料或供 应能量物质）3）血清供应养分促进DN A合成（血清质量影响组织培育）4）生长因子对胚胎保持最正确生长速度有肯定作用胰岛素样生长因子胰岛素表皮生长因子 转铁蛋白成纤维细胞生长因子抑制ES细胞分化的因素：I）胚龄的选择用于分别ES细胞的胚胎，胎龄越小，分化程度越低，越具有全能性.目前，各 种动物一般采纳囊胚期的胚胎来分别ES细胞。2）饲养层选择胚胎成纤维细胞用来制作饲养层后，能够抑制ES细胞的分化，其原理一般认为 是饲养层能够分泌白血病抑制因子和aFGF、bFGFo目前采纳的饲养层细胞有3种：STO （已建系的小鼠胚胎成纤维细胞即小鼠成纤维细胞无限系）MEF （小鼠胚胎原始成纤维细胞）HEF （同源胚胎成纤维细胞）3）条件培育基和几种分化抑制因子的应用应用CM的优点：消退饲养层干扰得到纯化的ES细胞使ES细胞免受丝裂霉素C致癌剂的影响手术简洁可以进一步分析ES细胞分化的启动和关闭机制分化抑制因子BRL4）滋胚层细胞的影响滋胚层细胞能够分泌滋胚层蛋白一1和干扰素有诱导细胞分化的作用 滋胚层的存在其扩增速度极高要消耗培育基中的养分物其代谢产物蓄枳较快去除滋养层细胞的 方法：胚胎培育法免疫外科法显微手术法动物转基因讨论历程中的三大里程碑1980 Gordon等报道用DNA显微注射法获得转基因小鼠1982 Palmiter等用微注射方法得到比正常鼠大一倍的“超级鼠”1985 Hammar等获得转基因兔、绵羊和猪帮助生殖技术是指配子、胚胎或者基因物质体内外系统操作而获得新生命的技术。帮助生殖新的技术主要表达在超数排卵、体外受精阴道培育法、经子宫肌层胚胎移植技术、经 腹腔精子与卵子移植技术、配子输卯管内移植技术、合子输卵管内移植技术、配子宫腔内移植 技术、卵子和胚胎捐赠、代孕母亲、胚胎冻融技术、显微人工授精技术、着床前遗传学诊断技 术、囊胚培育技术、细胞核移植技术、人类胚胎干细胞等。1952年Robert Briggs和Thomas J.king把一个青蛙的体细胞核移植到一个去核的卵母细胞中， 发育成了蝌蚪，其中很多蝌蚪发育成了未成年青蛙。19611962年，John B.Gurdon和Robert GMcKinnell用相同克隆方法胜利地得到了成年青蛙， 这些青蛙能正常繁殖。1966年John B.Gurdon和V.Uehpinger通过移植蝌蚪小肠细胞核克隆出了成年青蛙。1970年月，John B.Gurdon等人移植成年青蛙的体细胞核得到了蝌蚪，但这些蝌蚪没有长到可以 进食阶段就死了。1980年月，Rober【G.McKinnell通过移植成年青蛙红细胞核（与人类不同，青蛙红细胞有核）， 获得了能够进食的蝌蚪，但是这些蝌蚪没有发育成青蛙。全部这些试验说明，动物已分化的体细胞好像不行能再完全逆转。因此，科学家们把对胚胎克 隆的留意力转向/细胞逆分化潜能上。1996年多莉羊的诞生，说明已分化的体细胞完全具有逆向分化的潜能，其细胞核完全具有合子 细胞核的功能。