美洲型及欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测多重荧光定量反转录聚合酶链反应法.docx

美洲型及欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测多重荧光定量反转录聚合酶链反响法1范围本标准规定了应用多重荧光定量反转录聚合酶链反响法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的材料准备、操作方法及结果判定。本标准适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典毒株、变异毒株及欧洲型毒株的检测。2术语和定义以下术语和定义适用于本标准。2. 1猪繁殖与呼吸综合征病毒 porcine reproduct i ve andresp i ratory syndrome v i rus (PRRSV)属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属,其基因组为单股正链RNAo2. 2猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典毒株指在Nsp2蛋白基因序列无缺失的以VR-2332毒株为代表的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒。2. 3猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型变异毒株附录A（规范性附录）引物、探针序列及检测结果判定a.1 PRRSV特异性引物序列引物序列相关信息见表A. lo表A. 1引物序列及扩增长度引物名称引物序列（5'-3，）针对毒株长度（bp）AM-PRRSV-FGAGTGGGTCGGCTCCAGTTC美洲型195 或 108AM-PRRSV-RGCCTCATATTCCGTCTGTGAEU-PRRSV-FCGACATACTGCTTCTTAC欧洲型110EU-PRRSV-RCGGTATTTGAATAACCACA，AM-PRRSV-F和AM-PRRSV-R引物对在扩增美洲经典株时长度为195bp,扩增美洲型变异株时长度为108 bp0a. 2 PRRSV特异性探针序列探针序列相关信息见表A.2。表A.2探针名称及序列探针名称针对毒株序列（5，一3，）AM-V-PRRSV-P美洲型经典株FAM-TAGAACTGTGACAACAACGCTGA-BHQ-1AM-C-PRRSV-P美洲型变异株VIC-AACTGTGTCTCGACCGGTGAC-BHQ-1EU-PRRSV-P欧洲型毒株Cy3-CCTTGCTATGACCAGTTGTGTTCC-BHQ2a.3 PRRSV多重荧光定量反转录聚合酶链反响曲线图PRRSV多重荧光定量反转录聚合酶链反响曲线见图A. 1。Amp lineation Riotp-V-Nsp2 >p-C-Nsp2>p-E-ORF1.Cycle图A. 1 PRRSV多重荧光定量反转录聚合酶链反响曲线图附录B(规范性附录)溶液的配制8.1 本附录所用试剂均为分析纯8.2 1 mo I /L PBS (pH 7.2)的配制mol/L PBS (pH 7. 2)配制方法如下： 氯化钠：8 g；氯化钾：0.2 g； 磷酸氢二钠：1.44 g；磷酸二氢钾：0.24 g；双蒸水：定容至1 000 mL。在800 mL的双蒸水中依次加入其余成分，用1 mol/L盐酸调节 溶液的pH值至7.2,加双蒸水定容至1000mL, 1.034Xl()5pa高压 灭菌25 min。室温保存。8.3 0.1 %焦碳酸二乙酯(DEPC)水(DEPC H20)的制备0. 1% DEPCH2O配制方法如下:DEPC： 0. 1 mL；双蒸水：100 mL。将0. 1 mL DEPC加入100 mL双蒸水中配成 0. 1 %的水溶液。室 温作用12h以上，其间间歇摇匀几次或在室温下磁力搅拌20 min, 然后1.034X 105 pa高压灭菌30 mine室温保存。注：DEPC是强的蛋白变性剂和致癌物。B.4 1 %冰乙酸异丙醇的配制%冰乙酸异丙醇配制方法如下：异丙醇：99 mL；冰乙酸：1mL。在99 mL异丙醇中加入1mL冰乙酸，摇匀。室温保存。Sterilized Fluorescent Taq DNA Polymerase 10X RT Buffer dNTP Ct valueRNase reverse diethyl Reference dye（资料性附录）本标准词汇中英文对照表中文名称英文名称或缩写灭菌双蒸水 double-distill water荧光定量QuantificationTaq DNA聚合酶10倍RT缓冲液脱氧核糖核甘三磷酸Ct值RNA酶抑制剂 inhibitor, RNasin反转录酶 transcriptase焦碳酸二乙酯 pyrocarbonate, DEPC参比染料指在Nsp2蛋白基因序列第481位和第533561位上出现30 个氨基酸的不连续缺失的以JXA1毒株为代表的美洲型猪繁殖与呼吸 综合征病毒。2.4反转录 reverse transcr i pt i on (RT)以RNA为模板合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)的过程。2. 5引物 primer与待扩增DNA片段互补的一段寡核甘酸。2. 6Ct值反响管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。2. 7多重荧光定量聚合酶链反响 multiplex real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (Multi FQ- PCR)简称多重荧光定量PCR,是PCR技术的一种特殊形式。指在同一反 应体系中加入多对引物及多个标有不同荧光基团的探针，同时扩增多 个模板并利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲 线对未知模板进行定量分析的方法(简称多重荧光定量PCR)。3材料准备3.1试剂2.1.1 特异性引物及探针引物和探针序列见附录A中的A. 1和A.2。上、下游引物及探针的使用浓度均为25 pmol/MLoRNA抽提试剂盒RNA抽提试剂盒主要成分包括： 细胞裂解液； 氯仿； 1 %冰乙酸异丙醇； 无水乙醇； 洗脱缓冲液； DEPC水； 过滤柱。3. 1.3反转录试剂盒反转录试剂盒主要成分包括：10X RT缓冲液；氯化镁（MgC12）溶液；dNTP 混合物:包括 dATP、dTTP、dCTP> dGTP；RNA酶抑制剂；AMV反转录酶；随机引物9聚体。3.1.4 荧光定量PCR试剂盒荧光定量PCR试剂盒主要成分包括：Taq DNA聚合酶预混剂(内含蜃Taq酶，dNTP混合物，氯化镁(MgC12)等)；ROX参比染料H。3.1.5 其他试剂其他试剂如下：1 mol/L 灭菌 PBS (pH 7. 2)；DEPC水。注：配制方法按附录B. 2、B. 3o3.2仪器设备及耗材3. 2. 1仪器设备本方法使用以下仪器设备：普通PCR仪；荧光定量PCR仪；核酸蛋白分析仪； 高速台式冷冻离心机； 混匀器； 乳钵或玻璃研磨器； 微量移液器。3.2.2 一次性耗材一次性耗材如下： 乳胶手套； 离心管； PCR反响管； 吸头； 八联荧光PCR反响管。注：离心管、PCR反响管、吸头等应使用无RNA酶的一次性塑料制 品，否那么应在使用前经DEPC水处理，然后用1.034X 1()5 pa高 压灭菌30 mino4操作方法4.1操作环境以下操作应在无RNA酶的环境下进行。4. 2待检样品处理无菌采取病猪肺脏、脾脏和淋巴结等共约2 g,置于乳钵或玻璃 研磨器中，充分研磨,按1:4的比例加入灭菌的Imol/LPBS (pH7.2) 混匀，反复冻融3次；细胞培养物那么直接反复冻融3次。然后以3 000 X g离心5 min,收集上清，用于总RNA抽提，或置-20 c保存备用。血清样品可直接用于总RNA抽提，或置-20保存备用。4.3 待检样品总RNA提取取200迎待检样品上清或血清置于无RNA酶的1.5 niL离心管 中，按照RNA提取试剂盒操作说明书抽提总RNA。总RNA可直接作为 模板进行反转录，或置-20 °C保存备用。4.4 反转录反响液总量lOpLo在冰浴条件下，在PCR反响管中按以下用量 分别加入各成分：10X RT缓冲液：1 ML；AMV 反转录酶(5U/|iL) ： 0. 5(nL；dNTP 混合物(各 10mM/L) ： 1 |liL ；RNA 酶抑制剂(40 U/pL) ： 0. 25 pL；MgCk 溶液(25 mM/L) ： 2-L；随机引物9聚体(50pmol/|nL) ： 0. 5 ML；待检总RNA模板：4 |1L；DEPC水：补足总体积至10 pLo加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反响管置于普通PCR仪内进 行反转录。反响程序为：30 , lOmin； 42 , 30min； 95 , 5min0 获得的cDNA直接用于荧光定量PCR扩增，或置-20保存备用。4.5多重荧光定量PCR在冰浴条件下，在八联荧光PCR反响管中按以下用量分别加入各 成分：Premix Ex TaqTM： 12. 5 pL；ROX参比染料H： 0. 5|iL；上下游引物(25pmol/|LiL)：各 0. 5 pL；探针(25 pmol/|LiL):各 1 |nL；待检样品：2 pL；灭菌双蒸水：补足总体积至25rL。加完试剂后瞬时离心混匀，将八联荧光PCR反响管置于荧光定量 PCR仪内，按如下程序进行反响：第一阶段预变性95 °C, 20s；第二 阶段95 , 1s； 60 , 20 s ,共40个循环；荧光收集设置在第二 阶段每次循环的退火延伸时进行。4.6阳性对照及阴性对照4. 6.1阳性对照PRRSV美洲型经典株p-C-Nsp2质粒、美洲型变异株p-V- Nsp2质粒及欧洲型P-E-0RF1质粒为本实验室构建的阳性对照标准品。用核酸蛋白分析仪测定其光吸收值（0D26。）后计算浓度，用灭菌双蒸水稀释至 拷贝/UL,作为阳性对照标准品，一20C保存备用。4. 6.2阴性对照用DEPC水代替模板作为阴性对照模板。5结果判定结果分析条件设定直接读取检测结果。阈值设定原那么根据仪器噪声情况进行调整， 以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。4.1 质控标准阴性样品无Ct值。4.1.1 阳性对照的Ct值均应小于28.0,并出现典型的扩增曲线。否 那么，此次检测无效。5-3结果描述及判定3.1假设被检样品出现PRRSV美洲型经典株特异性扩增曲线时，判定 为PRRSV美洲型经典株阳性;否贝I,判定为PRRSV美洲型经典株阴性。5.3.2 假设被检样品出现PRRSV美洲型变异株特异性扩增曲线时，判定 为美洲型PRRSV变异株阳性;否那么，判定为PRRSV美洲型变异株阴 性。5.3.3 假设被检样品出现欧洲型PRRSV特异性扩增曲线时判定为欧洲 型PRRSV阳性；否那么，判定为欧洲型PRRSV阴性。注：PRRSV多重荧光定量反转录聚合酶链反响的结果曲线图见附录A. 3o