生化分离工程实验.ppt

生化分离工程实验生化分离工程实验指导老师：何 进 教 授 电子邮箱：联系电话：助教学生：赵有文 刘 舒 胡轶敏 危雅乐 1组组李佳佳（组长）李佳佳（组长）董奇峰董奇峰 吴婷婷吴婷婷 杨后召杨后召2组组范文瑾（组长）范文瑾（组长）谢贻天谢贻天 熊雅琪熊雅琪 罗文罗文3组组刘小翠（组长）刘小翠（组长）张箐张箐 郑琦郑琦 孟庆孟庆4组组罗云超（组长）罗云超（组长）刘浩宇刘浩宇 黄玮黄玮 李智李智5组组唐清（组长）唐清（组长）李斌李斌 严楠峰严楠峰 柴芝培柴芝培6组组白腾龙（组长）白腾龙（组长）伍良伟伍良伟 余乐余乐 裴媛筠裴媛筠7组组邹铮铮（组长）邹铮铮（组长）刘娟刘娟 尹学琳尹学琳 王海云王海云8组组赵鹏（组长）赵鹏（组长）张灵芬张灵芬 潘丽娜潘丽娜 余晓岚余晓岚菌株的优化培养菌株的优化培养总总DNA或或RNA的抽提的抽提PCR或或RT-PCR扩增目的基因扩增目的基因乙醇沉淀回收线性化片断乙醇沉淀回收线性化片断大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体pET-28酶连产物转化酶连产物转化E.coli DH5 挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒(PCR及酶切验证及酶切验证)检索感兴趣的基因检索感兴趣的基因（hfq/fabz）直直接接优优化化并并合合成成连连T载测序载测序重组表达质粒转化重组表达质粒转化E.coli BL21挑取重组子挑取重组子,用菌落用菌落PCR方法验证方法验证IPTG诱导促使目的大量蛋白表达诱导促使目的大量蛋白表达细胞破碎及蛋白抽提细胞破碎及蛋白抽提目标蛋白的纯化目标蛋白的纯化蛋白质浓度测定蛋白质浓度测定-Bradford法法目标蛋白的鉴定目标蛋白的鉴定Western biotting结晶结晶结构解析结构解析本本次次试试验验内内容容本次试验的主要内容本次试验的主要内容vHis-Tag系统vpMAL系统无细胞体系目的基因的背景资料目的基因的背景资料vHfqvfabZHfq是一个高度保守的RNA结合蛋白，最初被发现是作为大肠杆菌RNA噬菌体Q复制所必需的管家因子。现在则被认为是细菌基因转录后调控的关键因子，广泛参与细菌多种生命活动的调控。大肠杆菌fabZ基因编码3-羟基脂酰ACP脱水酶，是大肠杆菌中的必须基因，该基因的突变会导致细菌细胞的死亡。生化分离工程实验（星期五）生化分离工程实验（星期五）一，接种一，接种 按1%的接种量将两种菌株分别加入到含抗生素的LB培养基中,做好标记（写清组号，菌株信息、抗性），统一放于第八组台面。系统系统His-Tag系统系统pMAL系统系统菌株编号HAZJH022宿主菌大肠杆菌BL21大肠杆菌DH5目的基因hfqfabZ培养基LB培养基LB培养基接种量1%（2 ml）1%（2 ml）加入抗生素Kan（200 ul）Amp（200 ul)生化分离工程实验（星期五）生化分离工程实验（星期五）将超净台内PA瓶中剩余的菌液用枪吸取200 l于1.5 ml离心管中，10000 rpm/min离心1 min，弃上清，加入200 l的无菌水洗涤菌体上残留的培养基 10000 rpm/min离心1 min，弃上清，然后重悬于40 l灭过菌的去离子水中，100 煮15 min，10000 rpm/min离心1 min，取上清9.2 l作为菌落PCR的模板。二，菌液PCR（验证目的基因已转入宿主菌中）PCRPCR体系体系H2O 9.2 l10 X PCR buffer 2.5 ldNTP 2.0 l上游引物 0.5 l下游引物 0.5 lTaq酶 0.3 l模板 10 l总体积 25 lPCRPCR程序程序95 5 min95 35 s56 40 s72 60 s72 10 min25 10 minCycle 30注：用质粒做阳性对照，水做阴性对照，不用重复，PCR管上做好标记！The pMAL-c2 series of vectors have an exact deletion of the malE signalsequence,resulting in cytoplasmic expression of the fusion protein.ThepMAL-p2 series of vectors contain the normal malE signal sequence,which directs the fusion protein through the cytoplasmic membrane,and the fusion proteins can be exported to the periplasm表达系统表达系统His-TagpMAL菌株HAZJH022培养温度3737转速200 rpm/min200 rpm/min适宜状态OD600=0.6OD600=0.5所需时间2.5 h2.5 h加入IPTG的终浓度1.0 mM(2 ml)0.3 mM(0.6 ml)三，诱导三，诱导注：在加入IPTG之前，摇匀菌液并各取1 ml于1.5 ml的离心管中，做好标记（组号，菌液名）记作“诱导前”，放于第八组桌面的离心管板中，于20 保存。四，配试剂四，配试剂五，五，PCR结果结果依据每组发的纸条进行生化分离工程实验（星期五）生化分离工程实验（星期五）将加入诱导剂后的菌液再放入37 200 rpm/min的摇床中诱导培养4-5小时后收集菌体。菌株菌株HAZJH022沉淀（离心管对应配平）8000 rpm/mim离心5 min8000 rpm/mim离心5 min收菌弃上清，沉淀用10ml binding buffer重悬弃上清，沉淀用10ml column buffer重悬保存2020注：在离心沉淀之前摇匀菌液取1 ml于1.5 ml的离心管中，做好标记（组号，菌液名）记作“诱导后”放在第八组的离心管板上。离心时用天平严格配平，沉淀重悬后做好标记放于第八组桌面上！六，收菌六，收菌组氨酸和组氨酸和Ni-NTAimidazole 亲和作用原理亲和作用原理6His/Ni-NTA亲和纯化步骤亲和纯化步骤系系统统原原理理示示意意图图pMALNiNi柱的清洗与保存柱的清洗与保存用水洗3次（去掉保存的20%乙醇）充电（装满NiSO4，温和摇动后自然沉降）洗涤（3次水洗，去掉游离的Ni)平衡（2次的binding buffer洗）HisTag HisTag 蛋白质的纯化步骤蛋白质的纯化步骤上样（每次15ml，样品要与柱子充分结合）加washing buffer（用100%TCA检测不出沉淀为止）加 Elution buffer（一般收集8ml）重复第48步第 1步：2倍体积 6 M 盐酸胍，0.2 M醋酸 第 2步：2倍体积水 第 3步：1倍体积 2%SDS（注意低温容易析出）第 4步：1倍体积 25%乙醇 第 5步：1 倍体积 50%乙醇 第 6步：1 倍体积 75%乙醇 第 7步：5 倍体积 100%乙醇 第 8步：1倍体积 75%乙醇 第 9步：1倍体积 50%乙醇 第 10步：1倍体积 25%乙醇 第 11步：1倍体积水 第 12步：5倍体积 100 mM EDTA，pH8.0 第 13步：3倍体积水 由于 EDTA处理后仍可有少量蛋白未能完全释放，建议在纯化不同蛋白时应另换 HisBind 树脂。树脂的再生树脂的再生当柱流速明显下降，或树脂在使用离子化缓冲液处理之后没能显示深蓝绿色，则树脂需要更彻底的清洗处理。直链淀粉柱的再生直链淀粉柱的再生水水3倍柱体积倍柱体积0.1%SDS3倍柱体积水1倍柱体积Column buffer3倍柱体积生化分离工程实验（星期六）生化分离工程实验（星期六）一、裂解细胞将冷冻保存的细胞团在室温下解冻，冰上破碎至菌液成澄清（200-300w超声610s-10s，约20 min）,天平严格配平后10000*g，4，离心20 min。上清取1 ml于1.5 ml离心管中，作标记为“上清”，沉淀用1 ml对应的buffer（his-tag为binding buffer，pMAL为column buffer）重悬后，保存在1.5 ml的离心管中，标记为“沉淀”，做好组号和菌株标记后，放于第八组台面。二，蛋白纯化二，蛋白纯化系统系统His-Tag系统系统pMAL系统系统柱子类型Ni-NTA柱支链淀粉柱操作方法3次binding buffer平衡3次column buffer平衡堵住下端后上样（10ml）静止5 min，盛接流出液后再上样，重复三次上样（10 ml）静止5min，盛接流出液后再上样，重复三次收集最后一次穿透液，取1 ml于1.5 ml离心管中，标记“穿透”收集最后一次穿透液，取1 ml于1.5 ml离心管中，标记“穿透”6次wash buffer水洗Column buffer+10mM麦芽糖的溶液洗涤（每加1 ml用1.5 ml离心管收集)共收集7管，做好标记Elution buffer洗涤（每加1 ml用1.5 ml离心管收集)共收集7管，并做好标记系统系统His-Tag系统系统pMAL系统系统操作步骤Elution buffer洗涤2次buffer+10mM麦芽糖的溶液洗涤2次加入20%乙醇保存加入20%乙醇保存后续反应酶切去除标签注：收集到的蛋白做好标记后须在冰上保存，避免其失活pMAL系统系统MBP标签的切除从A595最大的几管(一般是第一、二管)取100 l用于蛋白酶FactorXa的酶解，在100 l洗脱液中取15 ul保存在pcr管中，作为酶切对照，剩下的加入2 ul的FactorXa后置于摇床上震荡反应，室温下反应18 h，分别于第1h、3 h、6 h、17 h取样15 l。三，三，SDSPAGE样品的制备样品的制备将收集到的14管目的蛋白和之前保存的“上清”“沉淀”“穿透”（共6管）蛋白各取出20 ul于对应的已经标记的1.5 ml离心管中，加入20 ul SDS-PAGE loading buffer，将先前保存的“诱导前”“诱导后”（共4管）于10000rpm/min离心1min，弃上清，沉淀用15ul对应的buffer重悬，再加入15ul SDS-PAGE loading buffer，沸水浴15 min后，放于第八组台面。无细胞体系生化分离工程实验（星期六）生化分离工程实验（星期六）四，Bradford protein assay1、标准曲线的制作（1）标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白（BSA)配置成1.0mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝G-250溶于50 ml 95%的乙醇后，再加入120 ml 85%的磷酸，用蒸馏水稀释至1 L。管号管号1234567标准蛋白质（ml）00.010.020.040.060.080.10蒸馏水（ml）0.10.090.080.060.040.020考马斯亮蓝G-250试剂（ml）5555555A595每加完一管立即在漩涡振荡器上混合，25 min后以1号为对照调零测A595以标准蛋白质量（ug）为横坐标，用吸光度A595为纵坐标作标曲注;震荡过程中不要太剧烈，以免产生较多气泡而无法消除管号管号1234567HAZ和Fabz(ml）0.050.050.050.050.050.050.05蒸馏水（ml）0.050.050.050.050.050.050.05考马斯亮蓝G-250试剂（ml）5555555HAZ A595FabzA595五，未知蛋白浓度的测定五，未知蛋白浓度的测定将保存的纯化的蛋白各取50 ul，加50 ul蒸馏水后再加入5 ml考马斯亮蓝G-250染液试剂，漩涡震荡后静止25 min，以0.1 ml水加5.0 ml的G-250试剂调零，测其在595nm处的吸光度。生化分离工程实验（星期六）生化分离工程实验（星期六）六，配制SDS-PAGE试剂分离胶（12%)浓缩胶(5%)ddH2O9.0 ml 5.0 ml 40%丙烯酰胺6 ml 1.0 ml 分离胶-buffer5.0 ml 不加浓缩胶-buffer不加2 ml 10%APS100 l 60 l TEMED20 l 20 l 总体积20 ml 8 ml 每组配两块，均采用15孔梳子注：在配胶前注意梳子厚度（1.0mm和1.5mm）与胶板厚度的一致性生化分离工程实验（星期天）生化分离工程实验（星期天）v跑SDS-PAGEv点样：所有的样品和蛋白Marker点样前都要沸水浴5分钟使蛋白质完全变性。一般的点样量为10-20 ul。(记录点样顺序)v点样完毕后即可开始电泳，先以80伏电压跑15-20分钟，蛋白质通过积层胶后，更换到120伏，待溴酚蓝接近分离胶底部后停止电泳，取下胶板，小心撬开胶板割取分离胶，放入染色皿中，加入一定染色液（没过胶面即可）。置于摇床上染色3小时左右。v染色完毕后，回收染色液，加入脱色液，摇床脱色数次，最后一次可以过夜脱色。SDS-PAGESDS-PAGE的原理的原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(Acr)和交联剂N，N亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠SDS打断蛋白质的氢键和疏水键，包裹蛋白根据蛋白所带电荷差异和分子大小不同来分离掩盖电荷差异和形状区别，而只与分子量有关 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N、N四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。浓缩效应和分子筛效应