生物化学实验指导.ppt

生物化学实验指导课件天水师范学院生物系二OO二年二月天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南前言随着生物化学的发展和生物化学教学内容的不断丰富。生物化学实验也在不断更新和提高。1992年，我们编写了一本生物化学实验指导作为专科生实验教材，并在实验教学的过程中不断修改并加以充实。这次编写的生物化学实验指导是在以往工作的基础上，结合生物化学实验教学改革、作为本、专科生物化学实验教改项目的一个重要内容。在这次编写过程中，我们确立了这样一个指导思想去掉了许多定性和验证性实验，加大了定量分析的内容；在同一项目实验中，同时介绍了不止一种方法和技术增加了部分大实验，力求使学生有一个完整的实验训练过程，有利于培养学生实验设计能力、分析问题能力和独立操作能力，以达到知识、能力和素质的全面提高。本实验指导共计十五个实验，分基础实验、提高实验、高级实验三篇，内容覆盖了当今生物化学研究中常用的方法与技术。生物化学实验指导天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南实验一实验一 蛋白质的沉淀、变性反应实验二实验二 蛋白质的等电点测定(pH法)实验三实验三 酶的特性实验四实验四 菜花(花椰菜)中核酸的分离 和鉴定 基础实验天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南实验实验一一 3，5二硝基水杨酸比色定糖法 实验实验二二 Fo1in酚法测定血清蛋白质含量 实验实验三三 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 实验实验四四 蛋白质分子量测定（葡聚糖凝胶薄 层层析法）实验实验五五 脂肪酸的-氧化 实验实验六六 核酸浓度测定定磷法 实验实验七七 血液中转氨酶活力的测定(分光光 度法)实验实验八八 维生素C的定量测定 提高实验天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南实验一实验一 酯酶的分离、纯化与活性测定 实验二实验二 酯酶同功酶的垂直板不连续聚 丙烯酰胺凝胶电泳分析 实验三实验三 底物浓度对酶促反应速度的影 响（米氏常数的测定）高级实验天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南注意事项返回实验器材、药品实验原理实验操作酯酶的分离、纯化与活性测定酯酶的分离、纯化与活性测定 天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南 酯酶是A酯酶，B酯酶和胆碱酯酶的总称，它与人体有机磷药物中毒机制有关。本实验利用离子交换层析法分离和纯化酯酶，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素(CM纤维素)，阴离子交换剂有弱碱性的二乙氨基乙基纤维素(DEAE纤维素).蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团相结合，结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力，这又与溶液的pH有关，因为pH决定离子交换剂和蛋白质的解离程度。盐类的存在可以降低离子交换剂的解离基团与蛋白质的相反电荷基团之间的静电引力。因此，被吸附的蛋白质的洗脱通过改变pH或离子强度(或二者同时改变)来实现；与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。本实验采用CM纤维素离子交换剂，通过柱层析，经梯度洗脱从鼠肾丙酮粉抽提液中分离、纯化酯酶。梯度洗脱法是在洗脱过程中，使洗脱液的pH或盐浓度(或两者同时)发生连续的梯度变化，从而使吸附在柱上的各组分在不同的梯度下洗脱下来。本实验采用的是盐离子浓度梯度洗脱法，其装置由两个彼此相连的容器组成，在与层析柱相连接的一个容器(混合瓶)中，放入梯度洗脱开始时所需浓度的盐溶液(低浓度)，并配有搅拌装置，另一容器(贮液瓶)中放入高浓度的盐溶液，其浓度即梯度洗脱最后所需的浓度。两个容器的底部必须保持水平，液面的高度也应该相同。这样，当两容器之间的通道打开，并使混合瓶溶液流进层析柱时，梯度即开始形成。由于这两个容器是连通的，当混合瓶的溶液开始流入层析柱，它的液面高度就逐渐下降，为了维持两容器的液面高度的一致，高浓度的盐溶液即从导管流入混合瓶，结果混合瓶中溶液的盐浓度呈梯度上升。原理原理返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南操作操作一粗酶制剂的制备二CM纤维素离子交换剂的处理三层析柱的安装和平衡四加样和梯度洗脱五酯酶活性的测定六结果处理返回流程图流程图结 果 处 理酯酶活性测定梯度洗脱上样组合层析装置层析柱安装层析介质处理粗酶制剂制备天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南一、粗酶制剂的制备一、粗酶制剂的制备 杀死大白鼠，迅速剖腹取肾，置于冰浴中剔除脂肪和结缔组织。新鲜肾组织和15丙酮，按10g重量和100m1容积的比例，一同置入Waring捣碎器中捣碎，为避免温度升高，捣碎0.5min后，把匀浆倒入烧杯中，置于冰盐浴冷至15，再捣碎0.5min，反复3次。然后把匀浆倾人布氏漏斗抽滤，用15丙酮洗涤3次，按上述方法再捣碎滤饼，抽滤和洗涤一次。将最后得到的滤饼散置于表面皿，放入真空干燥器干燥数天，即得丙酮粉干品，每10g新鲜肾组织可制得丙酮粉34g。按100mg丙酮粉加入5m11102mo1lpH6.0磷酸缓冲液的比例，将二者放入烧杯中，置于冰箱内抽提30min，不时搅拌。抽提液在3000rmin下离心10min，上清液即为粗酶制剂(保存于冰箱待用)。测定此粗酶制剂的蛋白含量(按Fo1in酚试剂法)和酶活性。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南二、二、CM纤维素离子交换剂的处理纤维素离子交换剂的处理 称10gCM纤维素干品置于烧杯中，加入100ml0.5mollNaOH0.5mol从NaCl溶液，混匀，静置15min后，在布氏漏斗中抽滤，水洗滤饼至中性。此滤饼再悬浮于100m11mo1lHCl溶液中，混匀，静置10min后放入布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。再将滤饼悬浮于100m10.5mo1lNaOH0.5mo1lNaCl溶液中，混匀，静置15min后放入布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。最后将滤饼悬浮于所选择的起始洗脱缓冲液中。使用后的回收处理和上述步骤相同，只是省略了将滤饼悬浮于1mo1lHCl溶液这一步。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南三、层析柱的三、层析柱的安装安装和平衡和平衡 洗净一支1.540cm的玻璃(管)柱(也可选用规格合适的商品层析柱)，准备两个橡皮塞，将其中一个的中央插入一根玻璃细管，上面覆盖一圆形尼龙网片或一块绢布。玻璃细管上连接一根细胶管，与部分收集器相连，将这个橡皮塞安入层析柱的下端，另一橡皮塞中央也插人一根玻璃细管，并接上一根胶管与洗脱液混合瓶下口相连。此橡皮塞塞入层析柱的上端。两端胶管上各备一个螺旋夹。将层析柱架至垂直，夹紧下端胶管，向层析柱内加入蒸馏水(约23柱高)，然后将预处理好的离子交换纤维素装入柱内，使其自由沉降至柱的底部，放松柱下端螺旋夹，让柱内液体慢慢流出。待树脂沉降至所需高度(约30cm)后，置一圆形滤纸或尼龙片于胶面，待胶面只剩下一薄层水时，夹紧下端夹子，向柱内加入数ml洗脱起始缓冲液，松开下端夹子，用起始缓冲液渗洗平衡，先是压力较小，后增至洗脱时的压力(平衡10h左右为宜)。若平衡压力过大，柱内树脂被压迫太紧，影响流速。平衡好的柱面应存留一薄层缓冲液，旋紧下端螺旋夹。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南四、加样和梯度洗脱四、加样和梯度洗脱 用滴管将4m1粗酶制剂溶液(总蛋白含量15mg)沿柱内壁徐徐地加到纤维素柱面，然后慢慢放松下端螺旋夹，使样品液面降至纤维素柱表面，再加入少许洗脱起始缓冲液洗涤柱壁，如上操作，反复进行2次。梯度洗脱采用图39.1的装置实现。A为贮液瓶，B为混合瓶，二者容量相等，且置于同一水平面。C为A，B二瓶连通管的活塞，D为搅拌器，E为混合瓶的通嘴活塞。A盛高浓度洗脱缓冲液，B盛等体积起始洗脱缓冲液。洗脱前先开动搅拌器，后启开活塞C和E，B瓶洗脱液浓度呈直线式递增。关紧活塞C和E，在A瓶中加入110lmo1lpH6.0磷酸缓冲液150m1，在B瓶中加入5103mol/lpH6.0磷酸缓冲液150m1，将混合瓶B上的胶管与层析柱连接上之后，开动搅拌器，打开A，B两瓶之间连通管的活塞C，再打开B瓶的通嘴活塞E，控制流速在2ml20min。开动部分收集器，分管收集流出液，每管收集2ml。实验在010的温度范围内进行。测定各管流出液的酶活性，同时用Fo1in酚试剂法测定，每管流出液的蛋白含量。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南五、酯酶活性的测定五、酯酶活性的测定 底物乙酰2，6二氯酚靛酚被酯酶水解后生成的2，6二氯酚靛酚在pH8.0的条件下显蓝色，底物浓度恒定时，酶促反应速度取决于酶的活性。测定时，取4m15102mo1lpH8.0的磷酸缓冲液，加0.2m1底物(最终浓变为1.25104mo1l)，再加适量酶溶液(0.5m1含200g蛋白质)和水，使反应系统的最终容积为6m1，在30下反应5min后立即在600nm波长处测定A值。本实验是各管取0.5m1梯度洗脱液测定酶活性。若光吸收值越大，表示酶活性越高。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南六、结果处理六、结果处理 1.以梯度洗脱流出液的管数为横坐标，以相应流出液的蛋白含量为纵坐标，作出洗脱洗脱曲线图，峰和为两个主要酶蛋白峰。蛋白含量以1m1梯度洗脱液(Fo1in酚试剂法测定)在500nm波长处比色的光吸收值表示。2.以梯度洗脱流出液的管数为横坐标，以相应流出液酶活性(取0.5m1测定，在600nm波长处的A值)为纵坐标，绘制出酶活性曲线图，得到两个主要酶活性峰I和(见图)。3.以梯度洗脱流出液的管数为横坐标，梯度洗脱液浓度为纵坐标，绘制出梯度洗脱液浓度曲线图。4.分别合并峰I和两个组分，测定它们的蛋白含量和酶活性，并计算比活性。比活性的计算方法如下：酯酶比活性=酶作用底物后在600nm波长处的A值/mg蛋白量最后列出鼠肾粗酶制剂(丙酮粉原抽提液)和层析洗脱液酯酶比活性的比较以及蛋白回收率（见表）。由表列的数据看出，酯酶集中在峰。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南蛋白含量、酶活性和梯度洗脱液浓度曲线蛋白含量、酶活性和梯度洗脱液浓度曲线 代表蛋白含量曲线，表示酶活性曲线，表示洗脱液浓度曲线。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南粗酶制剂和层析洗脱液酯酶比活性的比较 返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南试剂与器材试剂与器材 一、试剂一、试剂1丙酮21102mo1l pH6.0磷酸缓冲液35102mo1l pH8.0磷酸缓冲液43.75103mo1l乙酰2，6-二氯酚靛酚丙酮溶液50.5mo1l NaOH0.5mo1lNaCl溶液61mo1lHCl溶液75103mo1l pH6.0磷酸缓冲液80.1mo1lpH6.0磷酸缓冲液9CM纤维素(0.069mmo1g干粉，PK3.5)。二、二、器材器材1waring捣碎器2布氏漏斗3抽滤瓶4表面皿5离心机6国产724型分光光度计7梯度混合器81.540cm玻璃柱9试管10自动收集器11移液管12量简13烧杯14玻璃漏斗。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南注意事项返回实验器材、药品实验原理实验操作 酯酶同功酶的垂直板不连酯酶同功酶的垂直板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分析续聚丙烯酰胺凝胶电泳分析天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacryamide gel electrophoresis简称PAGE）根据其有无浓缩效应，分为连续与不连续系统2大类，前者电泳体系中缓冲液PH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；后者电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应、还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。目前常用的多为垂直的圆盘及板状两种。前者凝胶是在玻璃管中聚合，样品分离区带染色后呈圆盘状，因而称为圆盘电泳（disc electrophoresis）,其装置如图87；后者，凝胶是在间隔几毫米的平行玻璃板中聚合，故称为板状电泳（slab electrophoresis）,其装置图见第二部分实验18。两者电泳原理完全相同。现以等（1964）用高PH不连续圆盘PAGE分离血清蛋白为例，阐明各种效应的原理。不连续体系由电极缓冲液、样品胶、浓缩胶及分离胶组成，它们在直立的玻璃管中（或2层玻璃板中）排例顺序依次为上层样品胶、中间浓缩胶、下层分离胶，如示意图88。样品胶是核黄素催化聚合而成的大孔胶，T=3%，C=2%，其中含有一定的样品及pH6.7 的Tris-HCI,凝胶缓冲液，其作用是防止对流，促使样品浓缩以免被电极缓冲液稀释。目前一般不用样品胶，直接在样品液中加入等体积40%蔗糖，同样有防止对流及样品被稀释的作用。实际上，浓缩胶是样品胶的延续，凝胶浓度及PH值与样品胶完全相同，其作用是使样品进入分离胶前，被浓缩成窄的扁盘，从而提高分离效果。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，T=7.07.5%，C=2.5%，凝胶缓冲液为PH8.9Tris-HCI,大部分血清中各种蛋白质在此PH条件下，按各自负电荷量及分子量泳动。此胶主要起分子筛作用。上、下电泳槽是用聚苯乙烯或二甲基丙烯酸（商品名为Lucite）制作的。将带有3层凝胶的玻璃垂直放在电泳槽中，在两个电极槽中倒入足够量PH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液，接通电源即可进行电泳。在此电泳体系中，有两种孔径的凝胶、2种缓冲体系，3种PH值，因而形成了凝胶孔径、PH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。PAGE具有较高的分辨率，就是因为在电泳体系中集样品浓缩效应、分子筛效应及电荷效应为一体。原理原理返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南操作操作一凝胶贮备液及电极缓冲液的配制二电泳槽的安装三凝胶的制备四样品的制备和点样五电泳六染色返回染 色电 泳 上 样注 浓 缩 胶浓缩胶制备注分离胶分离胶制备电泳槽安装流程图流程图天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南一、凝胶贮备液及电极缓冲液的配制一、凝胶贮备液及电极缓冲液的配制 请参见试剂与器材方法所述配置凝胶贮备液及电极缓冲液返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南二、电泳槽的安装二、电泳槽的安装 本实验使用夹芯式垂直板电泳槽。将胶板嵌入胶膜，后安装于垂直槽间。拧紧螺丝固定，水平放置。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南三、凝胶的制备三、凝胶的制备 1分分离离胶胶:取上述凝胶贮备液(表71)按A：C：G：水1：2：4：1的比例配制，先将贮备液A，C和水放在一小烧杯中另将贮备液G放人另一小烧杯中，一起放在真空干燥器中，用真空泵抽气15min,取出将G并入，混匀，立即将凝胶液缓缓注入已准备好的干洁胶室中。胶室两侧和底部要防止渗漏，注胶过程中要防止气泡产生。胶液加至离玻璃板顶部约3cm处，此时将电泳槽垂直放置；立即用装有6号针头的注射器注入蒸馏水使胶的表面覆盖少量水层。约40min后，胶和水层之间出现清晰的界面，表明聚合完成。2浓缩胶浓缩胶:取上述凝胶贮备液按B:D:E：F=1：2：1：4的比例同上法配制浓缩胶。用注射器或吸水纸吸去分离胶上面的水层，立即将配好的浓缩胶注入已凝固的分离胶上，胶液加到接近胶室的顶部,插入样品梳，置于日光灯下照约lh,静止聚合。胶聚合好后，小心地取出梳子，用吸水纸吸去样品室内的水分，加入电极缓冲液。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南四、样品的制备和点样四、样品的制备和点样 取2g5d龄的小麦幼苗，剪碎后放人研钵内，在冰浴中匀浆，匀浆过程中加入4m1稀释4倍的浓缩胶缓冲液。匀浆液在5000g下离心10min,取2m1上清液与lmL40蔗糖溶液和半滴01溴酚蓝溶液混合，用微量注射器吸取0.05m1混合液，注入样品槽内。按同样操作提取制备水稻样品溶液，将小麦和水稻样品相间点样，点样量可有所不同。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南五、电泳五、电泳 加样后，向两个电极液槽内注入电极缓冲液，接通电源，并立即电泳。前槽接入电源的负极，后槽接入正极。电泳开始后，电流控制在1520mA，样品进入分离胶后电流可加大到30mA，这时电压一般在100V左右，此后，维持恒流不变。当指示染料到达离凝胶底部2cm时停止电泳，电泳约需3h。电泳到时后，关闭电源，吸出电极缓冲液，取出夹套和玻璃板。用流水冲洗，借助水的润滑作用将胶平放入15cm的大培养皿中。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南六、染色六、染色 将100m1酯酶染色液称取50mg醋酸荼酯，50mg-醋酸茶酯，100mg坚牢蓝RR(或坚牢蓝B)，先用约5m1丙酮溶解，再用001mol/LpH50磷酸缓冲液稀释到150mol注入培养皿中，于室温下显色约20min，可看到桃红色的磷酸酯酶同工酶区带。弃去染色液，用蒸馏水冲洗。同工酶带采用薄层扫描仪测定，可用5醋酸固定保存。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南试剂与器材试剂与器材 一、试剂一、试剂1凝胶贮备液的配制：各贮备液需于4下冷藏，由于过硫酸胺不稳定，因而应在用前制备。2电极缓冲液的配制：Tris 606g，甘氨酸28.52g,加蒸馏水配成1000m1，pH8.3,用时稀释10倍。二、二、器材器材1垂直板电泳槽2直流稳压或稳流电源3医用注射器4烧杯5量筒6真空抽气装置7研钵8离心机9培养皿10剪刀11镊子12滴管返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南试剂ABCDEFGHCl(1mol/L)48ml48mlTris36.6g5.98gTEMED0.23ml0.46mlAcr20g10gBis0.735g2.5g核黄素4mg蔗糖40g过硫酸胺0.14g加水至100ml100ml100ml100ml100ml100ml100mlPH8.96.7A、B、C、D、E、F、G各贮备液的配制各贮备液的配制 返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南注意事项返回实验器材、药品实验原理实验操作Fo1in酚法测定血清蛋白质含量酚法测定血清蛋白质含量 天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南原理原理 蛋白质浓度可从它们的物理化学性质，如折射率、比重、紫外吸收等测定而得知；或用化学方法，如定氮、双缩脲反应、Fo1in酚试剂反应等方法来求算。其中双缩脲法和Fo1in酚法是一般实验室中经常使用的方法。它们操作简便、迅速，不需要复杂而昂贵的设备，又能适合一般实验室的要求，若作一般浓度的测定较为适宜。Fo1in酚法灵敏度高，较双缩脲法灵敏100倍。本实验采用的是Fo1in酚法。Fo1in酚法所用的试剂是由两部分组成的。试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应。试剂乙(磷钨酸和磷钼酸混合液)在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝混合物)。由于蛋白质中含有带酚基的酪氨酸，故有此呈色反应。因此，用Fo1in酚法测定蛋白质含量灵敏度较高。所测蛋白质样品中若含酚类及柠檬酸均有干扰作用。浓度较低的尿素(约0.5左右)、胍(0.5左右)、硫酸钠(1)、硝酸钠(1)、三氯乙酸(0.5)、乙醇(5)、乙醚(5)、丙酮(0.5)等溶液对显色无影响。这些物质浓度高时，必须做校正曲线。含硫酸铵的溶液只需加浓碳酸钠氢氧化钠溶液即可显色测定。若样品酸度较高，显色后色浅，则必须提高碳酸钠氢氧化钠溶液的浓度12倍。另外，此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。本实验以血清为材料，测定血清的蛋白质含量。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南操作操作一标准曲线的制作二血清样品的测定三计算返回流程图流程图 比色测定比色测定加加Folin-酚试剂乙酚试剂乙加加Folin-酚试剂甲酚试剂甲加标准酪蛋白加标准酪蛋白试管准备试管准备天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南一一、标准曲线的制作标准曲线的制作取12支试管（平行两份），分别加入0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00ml标准酪蛋白溶液(500gml)，用水补足1.00ml。按顺序向各管加入5mlFo1in酚试剂甲，混匀。室温下放置10min。再依次向各管加入0.5mlFolin酚试剂乙，立即摇匀，在30保温(或室温下放置)30min。然后，在500nm处，在724B型分光光度计上进行比色测定，多测几次，并取其平均值。以光密度(OD)为纵坐标，以酪蛋白溶液浓度为横坐标，在方格坐标纸上作图，绘制出酪蛋白的标准曲线。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南 二、血清样品的测定二、血清样品的测定取2支试管，各加入一定量的血清稀释液(应使其蛋白质含量在酪蛋白标准曲线范围之内)，本实验取0.2ml血清稀释液，再加入0.8ml蒸馏水使样品体积达到lml。其他操作与“标准曲线的制作”相同。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南三、计算三、计算 将血清样品的光密度读数在标准曲线上查出相应的标准酪蛋白溶液的浓度，再折算成每毫升血清稀释液含蛋白质的微克数。然后乘以稀释倍数，得出每毫升未稀释血清含蛋白质的克数。最后，再折算成临床化验上通用的单位g%，即100ml血清中含蛋白质的克数。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南试剂与器材试剂与器材 一、试剂一、试剂1 标准酪蛋白溶液：称 取125mg酪蛋白粉末，用0.1N氢氧化钠溶液润湿，溶解，加蒸馏水到250ml，则配成500gml的标准酪蛋白溶液。2Fo1in酚试剂甲3Fo1in酚试剂乙4血清：使用前稀释100倍。二、器材二、器材1试管及试管架2吸量管(5、1、0.5ml)3724B型分光光度计4电热恒温水浴返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南Fo1in酚试剂甲的配制酚试剂甲的配制由下述四种溶液配制：(1)4碳酸钠溶液；(2)0.2N氢氧化钠溶液；(3)1硫酸铜(CuS045H20)溶液；(4)2酒石酸钾钠溶液。在使用前，将(1)与(2)等体积混合配成碳酸钠氢氧化钠溶液，将(3)与(4)等体积混合配成硫酸铜酒石酸钾钠溶液。然后，将这两种溶液按50:1的比例混合，即为Fo1in酚试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南 Fo1in酚试剂乙的配制酚试剂乙的配制在2000ml的磨口廻流装置内加入钨酸钠(Na2WO42H20)100g，钼酸钠(Na2MoO42H20)25g，蒸馏水700ml，85磷酸50ml和浓盐酸100ml，充分混合后，以小火廻流10h。再加入硫酸锂(LiSO4)150g，蒸馏水50ml及数滴液体溴。然后，开口继续沸腾15min，以驱除过量的溴。冷却后定容到1000ml，过滤，滤液呈绿色。用Fo1in酚试剂乙滴定标准氢氧化钠溶液(1N左右)，以标定Fo1in酚试剂乙的酸度；以酚酞为指示剂。当溶液颜色由红色变为紫红、紫灰、再突然转变成墨绿时，即为终点。该试剂酸度一般为2N左右，此为贮存液。也可以用氢氧化钠去滴定Fo1in酚试剂乙，但终点较不易掌握。此时溶液颜色由浅黄变为浅绿，再变为灰紫为终点。使用前应予以适当稀释，使其成为1N的酸，此为Fo1in酚试剂乙应用液。以上两液均应装于棕色瓶内，贮于冰箱中，可以长期保存。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南注意事项返回实验器材、药品实验原理实验操作蛋白质的沉淀、变性反应蛋白质的沉淀、变性反应 天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南原理原理 在水溶液中，蛋白质分子的表面，由于形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的，相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，则以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。这种反应可分为以下两种类型：一、可逆沉淀反应一、可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于原来的溶剂中。这种作用称为可逆沉淀反应，又叫作不变性沉淀反应。属于这一类的反应有盐析作用；在低温下，乙醇、丙酮对蛋白质的短时间作用以及利用等电点的沉淀等。二、不可逆沉淀反应二、不可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构型遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解于原来溶剂中的作用叫作不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、超声波，有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南操作操作一、蛋白质的可逆沉淀反应蛋白质的盐析作用二、蛋白质的不可逆沉淀反应三、蛋白质可逆沉淀与不可逆沉淀的比较返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南 一、蛋白质的可逆沉淀反应一、蛋白质的可逆沉淀反应蛋白质的盐析作用蛋白质的盐析作用 用大量中性盐使蛋白质从溶液中沉淀析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭受破坏而沉淀析出。析出的蛋白质仍保持其天然蛋白的性质，减低盐的浓度时，还能溶解。沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度不同，而盐类不同也有差异。例如：向含有清蛋白和球蛋白的鸡蛋清溶液中加硫酸镁或氯化钠至饱和，则球蛋白沉淀析出。加硫酸铵至饱和，则清蛋白沉淀析出。另外，在等电点时，清蛋白可被饱和硫酸镁或氯化钠或半饱和的硫酸铵溶液沉淀析出。所以在不同条件下，用不同浓度的盐类可将各种蛋白质从混合溶液中分别沉淀析出，该法称为蛋白质的分级盐析。目前在酶的生产和制备、科研工作和临床化验等工作中广泛应用。取一支试管加入3m1蛋白质氯化钠溶液和3m1饱和硫酸铵溶液，混匀，静置约10min，球蛋白则沉淀析出，过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌，直至粉末不再溶解，达到饱和为止。析出的沉淀为清蛋白。静置，倒去上部清液，清蛋白沉淀，取出部分加水稀释，观察它是否溶解，留存部分作透析用。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南 二、蛋白质的不可逆沉淀反应二、蛋白质的不可逆沉淀反应 1重金属沉淀蛋白质2有机酸沉淀蛋白质3无机酸沉淀蛋白质4加热沉淀蛋白质返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南1、重金属沉淀蛋白质、重金属沉淀蛋白质 重金属盐类易与蛋白质结合成稳定的沉淀而析出。蛋白质在水溶液中是酸碱两性电解质，在碱性溶液中(对蛋白质的等电点而言)，蛋白质分子带负电荷，能与带正电荷的金属离子结合成蛋白质盐；在有机体内，蛋白质常以其可溶性的钠盐或钾盐的形式存在；当加入汞、铅、铜、银等重金属盐时；则蛋白质形成不溶性的盐类而沉淀。经过这种处理后的蛋白质沉淀不再溶解于水中，说明它已发生了变性。重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全，特别是在碱金属盐类存在时。因此，生化分析中，常用重金属盐除去体液中的蛋白质；临床上用蛋白质解除重金属盐的食物性中毒。但应注意，使用乙酸铅或硫酸铜沉淀蛋白质时，试剂不可加过量，否则可使沉淀出的蛋白质重新溶解。取3支试管，各加入约1m1蛋白质溶液，分别加入3硝酸银34滴，0.5乙酸铅13滴和0.1硫酸铜34滴，观察沉淀的生成。第一支试管的沉淀留作透析用，然后向第二、三支试管再分别加人过量的乙酸铅和饱和硫酸铜溶液，观察沉淀的再溶解。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南2有机酸沉淀蛋白质有机酸沉淀蛋白质 有机酸能使蛋白质沉淀。三氯乙酸和磺基水杨酸最有效，能将血清等生物体液中的蛋白质完全除去，因此得到广泛使用。取两支试管，各加入蛋白质溶液约0.5m1，然后分别滴加10三氯乙酸和0.5磺基水杨酸溶液各数滴，观察蛋白质的沉淀。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南3无机酸沉淀蛋白质无机酸沉淀蛋白质 浓无机酸(除磷酸外)都能使蛋白质发生不可逆的沉淀反应。这种沉淀作用可能是蛋白质颗粒脱水的结果。过量的无机酸(硝酸除外)可使沉淀出的蛋白质重新溶解。临床诊断上，常利用硝酸沉淀蛋白质的反应，检查尿中蛋白质的存在。取3支试管，分别加入浓盐酸15滴，浓硫酸、浓硝酸10滴。小心地向3支试管中，沿管壁加入蛋白质溶液6滴，不要摇动，观察各管内两液界面处有白色环状蛋白质沉淀出现。然后，摇动每个试管。蛋白质沉淀应在过量的盐酸及硫酸中溶解。在含硝酸的试管中，虽经振荡，蛋白质沉淀也不溶解。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南4加热沉淀蛋白质加热沉淀蛋白质几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，变成不可逆的不溶状态。盐类和氢离子浓度对蛋白质加热凝固有重要影响。少量盐类促进蛋白质的加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全、最迅速。在酸性或碱性溶液中，蛋白质分子带有正电荷或负电荷，虽加热蛋白质也不会凝固。若同时有足量的中性盐存在，则蛋白质可因加热而凝固。取5支试管、编号，按下表加入有关试剂(单位：滴)：将各管混匀，观察记录各管现象后，放入沸水浴中加热10min，注意观察比较各管的沉淀情况。然后，将第3，4，5号管分别用10NaOH或10乙酸中和，观察并解释实验结果。将3，4，5号管继续分别加入过量的酸或碱，观察它们发生的现象；然后，用过量的酸或碱中和第3，5号管，沸水浴加热10min，观察沉淀变化检查这种沉淀是否溶于过量的酸或碱中，并解释实验结果。试剂管号蛋白质溶液0.1%乙酸10%乙酸饱和NaCl10%NaOH蒸馏水123451010101010555227225返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南 三、蛋白质可逆沉淀与不三、蛋白质可逆沉淀与不可逆沉淀的比较可逆沉淀的比较(1)在蛋白质可逆沉淀反应中，用硫酸铵盐析所得的清蛋白沉淀倒入透析袋内，用线绳将透析袋口扎紧，并扎在玻璃棒上，使透析袋浸入盛有蒸馏水的烧杯中进行透析。每隔半小时换水一次，细心观察透析现象。(2)在蛋白质不可逆沉淀反应中，用硝酸银沉淀所得到的蛋白质沉淀倒入透析袋内，如前法进行透析。透析1h左右，比较以上两透析袋中蛋白质沉淀所发生的变化，并加以解释。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南试剂与器材试剂与器材 一、试剂一、试剂1蛋白质溶液（取5m1鸡或鸭蛋清，用蒸馏水稀释至100m1，搅拌均匀后用48层纱布过滤，新鲜配制。）2蛋白质氯化钠溶液取20m1蛋清，加蒸 馏 水 200m1和 饱 和 氯 化 钠 溶 液100m1，充分搅匀后，以纱布滤去不溶物(加入氯化钠的目的是溶解球蛋白)。3硫酸铵粉末4饱和硫酸铵溶液53硝酸银60.5乙酸铅710三氯乙酸8浓盐酸9浓硫酸10浓硝酸110.5磺基水杨酸120.1硫酸铜13饱和硫酸铜溶液140.1乙酸1510乙酸16饱和氯化钠溶液1710氢氧化钠溶液。二、器材二、器材1试管2试管架3小玻璃漏斗4滤纸5玻璃纸6玻璃棒7线绳8500m1烧杯910ml量筒。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南注意事项返回实验器材、药品实验原理实验操作 底物浓度对酶促反应速度的底物浓度对酶促反应速度的影响（米氏常数的测定）影响（米氏常数的测定）天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南原理原理早在1913年Michaelis和Menten首先提出了酶促反应进度和底物浓度的关系式。即米氏方程式：v=VS/(Km+S)式中：v为反应初速度，V为最大反应速度，S为底物浓度，Km为米氏常数，其单位为摩尔浓度。Km值是酶的一个特征性常数，一般说来，Km可以近似地表示酶与底物的亲合力。测定Km值是酶学研究中的一个重要方法。LineweaverBurk作图法是用实验方法则定及Km值的最常用的比较方便的方法。Lineweaver和Burk将米氏方程改写成倒数形式：1/v=Km/VS+1/V实验时选择不同的S，测定相对应的v。求出两者的倒数，以1/v对1/S作图，得到一个斜率为KmV的直线。将直线外推与横轴相交，其横轴截矩为-1/S=1/Km,由此求出Km值。这个方法比较简便。本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用LineweaverBurk双倒数作图法测定Km值。胰蛋白酶是胰液中的一个酶，它催化蛋白质中碱性氨基酸(L精氨酸和L赖氨酸)的羧基所形成的肽键水解。水解时生成自由氨基，因此可以用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量来追踪反应。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南操作操作分别向6个小锥形瓶中加入5ml甲醛溶液和1滴酚酞并滴加01mol/l标准氢氧化钠溶液直至混合物呈微粉红色。所有锥形瓶中的颜色应当一致。量取100ml酪蛋白溶液，加到一锥形瓶中，在37水浴中保温10min。将胰蛋白酶液也在37水浴中保温10min。然后精确地量取10ml酶液加到酪蛋白溶液中(同时记时！)。充分混合后，随即取出10ml反应混合物(作为零时的样品)至一含甲醛的锥形瓶中。向所取的反应混合物中加入酚酞(每毫升混合物加入1滴酚酞)用0.1mollNaOH滴定直至呈微弱但持续的粉红色，在接近到达终点之前，再加入指示剂(每毫升氢氧化钠溶液加入1滴酚酞)。然后，继续滴至终点，记下所用0.1moll氢氧化钠溶液的毫升数。在2、4、6、8和10min时，分别取出10ml消化样品，准确地照上法操作在每个样品中滴定终点的颜色应当一致的。用增加的滴定度对时间作图，测定初速度。配制不同浓度的酪蛋白溶液(7.5、10、15、20、30g/l)测定不同底物浓度时的活力。用实验测得的结果，以1/v对1/S作图，求出V和Km的数值。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南试剂与器材试剂与器材 一、试剂和材料一、试剂和材料140gl酪蛋白溶液(pH8.5)1000ml，(40g酪蛋白溶解在大约900ml水中再加20mllmollNaOH，连续振荡此悬浮液，微热直至溶解，最后用lmol lHCl或 1mol lNaOH调 到pH8.5，并用水稀释至l000ml)。2胰蛋白酶溶液(40gl)2000ml(可用由胰脏制备的粗胰蛋白酶制剂配制并放入冰箱内保存。)3甲醛溶液(400gl)500ml4酚酞(2.5gl乙醇)200ml5标 准 NaOH(约 0.1mol l)溶 液 4000ml二、器材二、器材150ml及150ml锥形瓶225ml碱滴定管，滴定台、蝴蝶310ml及5ml吸管4100ml量筒5恒温水浴返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南注意事项返回实验器材、药品实验原理实验操作蛋白质的等电点测定蛋白质的等电点测定(pH法法)天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南原理原理蛋白质是两性电解质。蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等