生化反应工程实验.ppt
一实验目的一实验目的1.1.掌握细胞反应动力学的研究方法；掌握细胞反应动力学的研究方法；2.2.巩固还原糖和生物量的测定原理与方法；巩固还原糖和生物量的测定原理与方法；3.3.掌握酶反应速度的实验测定方法；掌握酶反应速度的实验测定方法；4.4.掌握最大反应速度掌握最大反应速度r rmaxmax和米氏常数和米氏常数K Km m的测定方法。的测定方法。二实验原理二实验原理对细对细胞反胞反应应：实验可得不同实验可得不同t t的底物浓度的底物浓度CsCs值和值和CxCx值值(细胞浓度细胞浓度)。要求动力学参数要求动力学参数KSKS，maxmax；必求必求，测定时间区间测定时间区间tt内细胞浓度平均值。内细胞浓度平均值。碱性磷酸碱性磷酸酶酶碱性条件下，催化磷酸碱性条件下，催化磷酸单酯单酯水解。根据水解。根据酶酶催化反催化反应应机理：机理：可推可推导导出米氏方程：出米氏方程：通通过测过测定不同底物定不同底物浓浓度度C CS S下的反下的反应应速度速度r r，可确定，可确定r rmaxmax和和K Km m。在在510nm波长处比色测定波长处比色测定OD值，从而计算出酶的活性（反应速度值，从而计算出酶的活性（反应速度r）。）。ONa OP=O ONa OH+Na2HPO4+H2O 碱性磷酸酶碱性磷酸酶一定一定pH、T催化反催化反应应：醌类化合物（红色）醌类化合物（红色）OH+AAP铁氰化钾铁氰化钾OH三菌种、培养基、实验试剂和主要仪器三菌种、培养基、实验试剂和主要仪器1 1枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌AS1.398AS1.3982 2Tris-Tris-培养基：葡萄糖培养基：葡萄糖0.4%0.4%；NaCl0.5%NaCl0.5%；（；（NHNH4 4）2 2SOSO4 41%1%；KCl0.1%KCl0.1%；CaClCaCl2 20.1mmol/L0.1mmol/L；MgClMgCl2 21mmol/L1mmol/L；NaNa2 2HPOHPO4 420mol/L20mol/L；酪蛋白水解物；酪蛋白水解物0.1%0.1%，溶于，溶于0.1mol/LTris-HCl0.1mol/LTris-HCl缓冲液（缓冲液（pH7.4pH7.4）中。分装于）中。分装于150ml150ml三角瓶三角瓶中，每瓶装中，每瓶装50ml50ml，于，于115115，灭菌，灭菌30min30min，冷却。，冷却。（周二下午做（周二下午做)3 30.1mol/LTris-HCl0.1mol/LTris-HCl缓冲液（缓冲液（pH7.4pH7.4）4 40.1mol/L pH8.8Tris-0.1mol/L pH8.8Tris-醋酸缓醋酸缓冲液冲液 5 540mmol/L40mmol/L底物溶液底物溶液 6 60.5mol/L0.5mol/L氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液 7 70.3%0.3%（W/VW/V）4-4-氨基安替比林（氨基安替比林（AAPAAP）溶液）溶液 8 80.5%0.5%（W/VW/V）铁氰化钾溶）铁氰化钾溶液液 9 93,53,5二硝基水杨酸试剂二硝基水杨酸试剂(DNS(DNS试剂试剂)10)101mg/ml1mg/ml葡萄糖标准液葡萄糖标准液 11.11.甲苯甲苯1212移液管，刻度试管，容量瓶，滤纸，三角瓶，布式漏斗，电子天平，移液管，刻度试管，容量瓶，滤纸，三角瓶，布式漏斗，电子天平，恒温水浴槽，摇床，干燥箱，恒温水浴槽，摇床，干燥箱，721721分光光度计，灭菌锅，冰箱。分光光度计，灭菌锅，冰箱。四实验方法与步骤四实验方法与步骤1.1.种子液制备（以班为单位）种子液制备（以班为单位）枯草杆菌在固体斜面培养基上活化后。接入枯草杆菌在固体斜面培养基上活化后。接入8 8个装有个装有50ml Tris-50ml Tris-培培养基的养基的150ml150ml三角瓶中，于三角瓶中，于3030振荡培养振荡培养18h18h作为种子液作为种子液。（周三下午（周三下午2:30做做)2.2.发酵液制备（以组为单位）发酵液制备（以组为单位）将上述培养好的种子液接入将上述培养好的种子液接入1010个装有个装有50mlTris-50mlTris-培养基的培养基的150ml150ml三角三角瓶中，接种量瓶中，接种量5 5（v v：v v），于），于3737振荡培养振荡培养0h0h、1h1h、2h2h、2.5h2.5h、3h3h、3.5h3.5h、4h 4h、4.5 h4.5 h、5 h 5 h、5.5h(5.5h(发酵到上述每一定时间取一瓶，测定发酵到上述每一定时间取一瓶，测定发酵液的残糖含量和生物量，测定原理与方法见附录一，二发酵液的残糖含量和生物量，测定原理与方法见附录一，二)。培养培养时间时间（hrhr）0 01 12 22.52.53 33.53.54 44.54.55 55.55.5生物量生物量mg/mlmg/ml残糖残糖mg/mlmg/ml表表1 1 发酵动力学实验数据发酵动力学实验数据3 3枯草杆菌碱性磷酸酶酶液的制备枯草杆菌碱性磷酸酶酶液的制备 取种子液取种子液2 2瓶，分别加入甲苯（甲苯与种子液体积比瓶，分别加入甲苯（甲苯与种子液体积比1 1：2020）（加一滴甲苯）（加一滴甲苯/1ml/1ml培养液），摇匀，培养液），摇匀，3737保温保温30min30min，制成酶液备用。，制成酶液备用。酶促反应动力学的研究酶促反应动力学的研究试剂（ml）102030405060空白底物溶液0.10.20.30.40.81.0pH8.8 Tris缓冲液1.01.01.01.01.01.01.0蒸馏水0.90.80.70.60.21.0NaOH溶液1.01.01.01.01.01.01.00.3%AAP溶液1.01.01.01.01.01.01.0铁氰化钾溶液2.02.02.02.02.02.02.0充分混匀，放置10minA510nm反应前：反应前：反反应应后：后：试剂（ml）123456底物溶液0.10.20.30.40.81.0pH8.8 Tris缓冲液0.60.60.60.60.60.6蒸馏水0.90.80.70.60.237水浴保温5min酶液0.40.40.40.40.40.4充分摇匀，37准确保温15minNaOH溶液1.01.01.01.01.01.00.3%AAP溶液1.01.01.01.01.01.0铁氰化钾溶液2.02.02.02.02.02.0充分混匀，放置10minA510nm 酶酶活力（活力（单单位）位）=OD=OD5105101000=1000=（ODOD510510反反应应后后ODOD510510反反应应前前）10001000r r即即为为酶酶活力。活力。底物浓度对酶反应速度的影响底物浓度对酶反应速度的影响rrmaxmax和和KmKm的测定的测定 取取1313支试管，编号，按下表准确操作。以空白管调零点，在支试管，编号，按下表准确操作。以空白管调零点，在510nm510nm波长处比波长处比色测定色测定A A510nm510nm。五实验结果五实验结果1.1.发酵动力学确定发酵动力学确定发发酵酵实验实验数据数据处处理理做确定确定maxmax与与KsKs。进进而确定而确定发发酵酵动动力学。力学。4.5 4.5 5.0 5.08 85.0 5.0 5.5 5.594.0 4.0 4.5 4.57 73.5 3.5 4.0 4.06 63.0 3.0 3.5 3.55 52.5 2.5 3.0 3.04 42.0 2.0 2.5 2.53 31.0 1.0 2.0 2.02 20.0 0.0 1.0 1.01 1tt序号序号 2.2.底物浓度对酶反应速度的影响底物浓度对酶反应速度的影响rrmaxmax和和K Km m的测定的测定CSr1/CS1/r酶酶反反应实验应实验数据数据处处理理在坐标纸上做在坐标纸上做1/r1/CS 图，由此求图，由此求Km和和rmax值。值。3,53,5二硝基水杨酸比色法二硝基水杨酸比色法(DNS(DNS法法)测定还原糖测定还原糖附录一附录一一原理一原理 在一定范在一定范围围内，内，还还原糖的量与棕原糖的量与棕红红色物色物质颜质颜色的深浅成正色的深浅成正比关系，在比关系，在 540nm 540nm波波长长下下测测定光密度定光密度值值，查对标查对标准曲准曲线线便可求便可求出出还还原糖的量原糖的量。二二试剂试剂1.3,51.3,5二硝基水二硝基水杨杨酸酸试剂试剂(DNS(DNS试剂试剂)2.1mg/ml2.1mg/ml葡萄糖葡萄糖标标准液准液取取7 7支支25ml25ml刻度试管，编号，按下表操作。刻度试管，编号，按下表操作。二二.制作制作标标准曲准曲线线管号管号空白空白1 12 23 34 45 56 6葡萄糖葡萄糖标标准液（准液（mlml）0 00.20.20.40.40.60.60.80.81.01.01.21.2蒸蒸馏馏水（水（mlml）2.02.01.81.81.61.61.41.41.21.21.01.00.80.8DNSDNS试剂试剂(ml)(ml)1.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.5加加热热摇摇匀，在沸水浴中加匀，在沸水浴中加热热5 5分分钟钟冷却冷却立即用流立即用流动动冷水冷却冷水冷却蒸蒸馏馏水（水（mlml）6.56.56.56.56.56.56.56.56.56.56.56.56.56.5光密度光密度(O.D.540nm)(O.D.540nm)将上述各管溶液混匀后，在将上述各管溶液混匀后，在540nm540nm波长下，用空白波长下，用空白管溶液调零，测定吸光度值。以光密度值为横坐标，管溶液调零，测定吸光度值。以光密度值为横坐标，以葡萄糖毫克数为纵坐标，绘制标准曲线。以葡萄糖毫克数为纵坐标，绘制标准曲线。取取1010支试管为例，按表操作。将各管混匀后，测定各管支试管为例，按表操作。将各管混匀后，测定各管的光密度。的光密度。用制作用制作标准曲线中的标准曲线中的空白管溶液调零。空白管溶液调零。三三.测测糖糖 残糖浓度残糖浓度(mg/ml)=(mg/ml)=还原糖毫克数还原糖毫克数/0.3/0.3样样品品1 12 23 34 45 56 67 78 89 91010发发酵液酵液(ml)(ml)0.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.3蒸蒸馏馏水水(ml)(ml)1.71.71.71.71.71.71.71.71.71.71.71.71.71.71.71.71.71.71.71.7DNSDNS试剂试剂(ml)(ml)1.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.5加加热热混匀，在沸水浴中加热混匀，在沸水浴中加热5分钟分钟冷却冷却立即用流动冷水冷却立即用流动冷水冷却蒸蒸馏馏水水(ml)(ml)6.56.56.56.56.56.56.56.56.56.56.56.56.56.56.56.56.56.56.56.5ODOD值值(540nm)(540nm)在标准曲线上查出相应的还原糖含量，按下述公式计算出在标准曲线上查出相应的还原糖含量，按下述公式计算出发酵液残糖浓度。发酵液残糖浓度。菌体量菌体量(C(CX X)的测定：的测定：附录二附录二 生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。本生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。本实验两组采用比浊法，两组采用直接称重法。实验两组采用比浊法，两组采用直接称重法。比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与光密度成正比，所以可细菌悬浮液的浓度在一定范围内与光密度成正比，所以可用比色计测定菌液的光密度用比色计测定菌液的光密度(OD(OD值值)表示样品菌液浓度。表示样品菌液浓度。具体操作：将培养具体操作：将培养0 h0 h、1h1h、2h2h、2.5h2.5h、3h3h、3.5h3.5h、4h 4h、4.5 h4.5 h、5 h5 h、5.5 h5.5 h的菌悬液摇匀后，于的菌悬液摇匀后，于560nm560nm波长下，测波长下，测定定0D0D值作为值作为C CX X。用未接种的培养基作空白对照用未接种的培养基作空白对照。1.1.比浊法比浊法 此法分此法分为为湿重法和干重法。干重法系湿重法和干重法。干重法系单单位体位体积积培养物培养物经过经过滤滤（或离心）后，在（或离心）后，在105105烘箱中烘干至恒重（烘箱中烘干至恒重（1 11.5hr1.5hr），冷），冷却至室温称重。却至室温称重。具体操作：先称取干燥的具体操作：先称取干燥的滤纸滤纸重量，重量，记为记为W W1 1（g g），取），取发发酵液酵液过过滤滤，上清液保存于冰箱，上清液保存于冰箱进进行糖行糖浓浓度度测测定，菌体和定，菌体和滤纸滤纸一起于一起于105105烘至恒重后称烘至恒重后称滤纸滤纸和菌体重量，和菌体重量，记为记为W W2 2（g g），根据下式），根据下式计计算菌体生物量，算菌体生物量，单单位位 g/L g/L。2.2.直接称重法直接称重法 1 1 郭勇编著，现代生化技术郭勇编著，现代生化技术.广州：华南理工大学出版社，广州：华南理工大学出版社，200120012 2 程国华编著，生物化学实验技术程国华编著，生物化学实验技术.沈阳：沈阳农业大学，沈阳：沈阳农业大学，19981998六六.参考文献参考文献
