实验一蛋白质的等电点测定精.ppt

实验一蛋白质的等电点测定第1页，本讲稿共21页实验记录实验记录实验记录是在进行科学研究过程中积累资料、经验的一项重要工作，每一次实验记录是在进行科学研究过程中积累资料、经验的一项重要工作，每一次实验过程中都应当养成良好的习惯，及时做好记录和总结。实验过程中都应当养成良好的习惯，及时做好记录和总结。要求：要求：真实性真实性 原始性原始性 完整性完整性 条理性条理性实验报告的书写实验报告的书写实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。完整的实验报告应包括：实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。完整的实验报告应包括：实验题目、实验日期、实验目的实验题目、实验日期、实验目的 、实验原理、实验仪器和试剂、操作步骤、实验结果、实验原理、实验仪器和试剂、操作步骤、实验结果与分析、实验结论等项目。与分析、实验结论等项目。第2页，本讲稿共21页实验室规则实验室规则 上实验课时不迟到，不早退，自觉遵守课堂纪律，上课时应保持实验室安静，不得大上实验课时不迟到，不早退，自觉遵守课堂纪律，上课时应保持实验室安静，不得大声说笑。进入实验室必须穿实验工作服。声说笑。进入实验室必须穿实验工作服。实验课前认真预习有关课程，明确实验目的、要求和注意事项，熟悉实实验课前认真预习有关课程，明确实验目的、要求和注意事项，熟悉实验内容和方法步骤。验内容和方法步骤。实验时应遵守实验操作规程，按教师要求，认真操作。要细心观察实验实验时应遵守实验操作规程，按教师要求，认真操作。要细心观察实验现象，认真记录实验数据，作出结论，最后写出实验报告。现象，认真记录实验数据，作出结论，最后写出实验报告。要爱护公物，小心使用仪器和实验设备，注意节约用水、电、药品和器材。要爱护公物，小心使用仪器和实验设备，注意节约用水、电、药品和器材。第3页，本讲稿共21页所有固体废弃物如：废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于垃圾桶中。强所有固体废弃物如：废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于垃圾桶中。强酸、强碱必须倒入玻璃器皿中，用水稀释后倒入水槽。酸、强碱必须倒入玻璃器皿中，用水稀释后倒入水槽。实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。实验完毕，仪实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。实验完毕，仪器洗净放好。器洗净放好。在实验过程中必须遵守操作规程，不得随意乱动乱用。如不会使用，应请教指在实验过程中必须遵守操作规程，不得随意乱动乱用。如不会使用，应请教指导教师。凡因乱动乱用违反操作规程而损坏仪器设备，造成事故者，按有关导教师。凡因乱动乱用违反操作规程而损坏仪器设备，造成事故者，按有关规定进行赔偿和处理。规定进行赔偿和处理。严禁在实验室内吃饭、吸烟、扔废物和随地吐痰，实验结束离开实验室之严禁在实验室内吃饭、吸烟、扔废物和随地吐痰，实验结束离开实验室之前，关好窗户，切断电源，水源，确保安全。前，关好窗户，切断电源，水源，确保安全。第4页，本讲稿共21页实验室安全实验室安全n使用玻璃、金属器材时注意防止割伤及机械创伤。如发生意外，找实验室工作使用玻璃、金属器材时注意防止割伤及机械创伤。如发生意外，找实验室工作人员人员(少量急用药物备用少量急用药物备用)。n浓酸、浓碱腐蚀性很强，必须极为小心地操作。用吸量管量取这些试剂浓酸、浓碱腐蚀性很强，必须极为小心地操作。用吸量管量取这些试剂(包括有毒物包括有毒物)时，时，必须使用橡皮球，绝对不能用口吸取。必须使用橡皮球，绝对不能用口吸取。n微生物、动物的组织、细胞培养物、血液和分泌物微生物、动物的组织、细胞培养物、血液和分泌物 都可能存在细菌和病毒感染的潜在都可能存在细菌和病毒感染的潜在危害，处理生物材料必需小心谨慎，做完实验必须用肥皂、洗涤剂或消毒液洗手。危害，处理生物材料必需小心谨慎，做完实验必须用肥皂、洗涤剂或消毒液洗手。n被污染的物品，必须进行高压消毒或烧成灰烬。被污染的物品，必须进行高压消毒或烧成灰烬。n被污染的玻璃用具应在清洗和高压消毒前立即浸泡在适当的消毒液中。被污染的玻璃用具应在清洗和高压消毒前立即浸泡在适当的消毒液中。5第5页，本讲稿共21页试剂使用规则试剂使用规则使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原瓶。取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原瓶。取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干净烧杯中，再用干净吸管吸取标准液，以免污染取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干净烧杯中，再用干净吸管吸取标准液，以免污染瓶中的标准液体。瓶中的标准液体。使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。勿用嘴吸取，以免造成意外。第6页，本讲稿共21页吸量管的使用吸量管的使用正确拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端。正确拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端。取液：用吸耳球吸取液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量取液：用吸耳球吸取液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上端。管上端。调刻度：吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用调刻度：吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平食指控制液体下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。面上。放液：吸量管移入准备接受溶液的容器中，使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸放液：吸量管移入准备接受溶液的容器中，使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。吸量管应最后靠壁量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。吸量管应最后靠壁1515秒。秒。第7页，本讲稿共21页吸量管上端标有吸量管上端标有“吹吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖字。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶液。此类吸量管为的溶液。此类吸量管为“吹出式吹出式”，未标，未标“吹吹”字的吸量管，则不必吹出管字的吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。尖的残留液体。(0.5ml(0.5ml以下的都要吹）以下的都要吹）吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中，以免污染吸吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中，以免污染吸量管及试剂。量管及试剂。吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应及时吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应及时用自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，用自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，待实验完毕后，用自来水冲洗干净，晾干备用。待实验完毕后，用自来水冲洗干净，晾干备用。吸量管的使用注意事项吸量管的使用注意事项第8页，本讲稿共21页玻璃器皿的一般清洗方法玻璃器皿的一般清洗方法n一般玻璃仪器：如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水洗刷后，用洗衣粉刷一般玻璃仪器：如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水洗刷后，用洗衣粉刷洗，再用自来水反复冲洗，最后用蒸馏水淋洗洗，再用自来水反复冲洗，最后用蒸馏水淋洗2 23 3次。干燥备用。次。干燥备用。n容量分析仪器：吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自来水冲洗，待晾干后，容量分析仪器：吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自来水冲洗，待晾干后，再用铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水淋洗再用铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水淋洗2 23 3次，干燥备用。次，干燥备用。n比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗。洗不净时，用盐酸或适当溶剂冲洗，比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗。洗不净时，用盐酸或适当溶剂冲洗，再用自来水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗，切忌用试管刷或粗糙布再用自来水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗，切忌用试管刷或粗糙布(纸纸)擦拭。擦拭。n上述所有玻璃器材洗净上述所有玻璃器材洗净(以倒置后器壁不挂水珠为干净的标准以倒置后器壁不挂水珠为干净的标准)后，根据需要后，根据需要晾干或烘干。晾干或烘干。第9页，本讲稿共21页实验一、蛋白质的两性性质和实验一、蛋白质的两性性质和等电点测定等电点测定第10页，本讲稿共21页一、实验目的一、实验目的1 1、了解蛋白质的两性解离性质、了解蛋白质的两性解离性质2 2、学习测定蛋白质等电点的一种方法、学习测定蛋白质等电点的一种方法(沉淀法沉淀法)第11页，本讲稿共21页二、实验原理二、实验原理n蛋白质是蛋白质是两性电解质两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡：。在蛋白质溶液中存在下列平衡：n蛋白质分子的解离状态和解离程度受蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度溶液的酸碱度影响。影响。第12页，本讲稿共21页n常用方法：利用常用方法：利用溴甲酚绿指示剂溴甲酚绿指示剂的变色来观察的变色来观察蛋白质的两性性质。蛋白质的两性性质。3.85.6第13页，本讲稿共21页n当溶液的当溶液的pHpH为一定值时，蛋白质极性基团解离的正负离为一定值时，蛋白质极性基团解离的正负离子数相等，净电荷为子数相等，净电荷为0 0，此溶液的，此溶液的pHpH值为该值为该蛋白质的等蛋白质的等电点电点。n不同蛋白质具有各自特定的等电点，与该蛋白质的不同蛋白质具有各自特定的等电点，与该蛋白质的组成结构有关。组成结构有关。n在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用性质的变化测定各种蛋白质的等电点。性质的变化测定各种蛋白质的等电点。n常用方法常用方法：观察蛋白溶液在不同：观察蛋白溶液在不同pHpH值下的溶解度。值下的溶解度。问题：蛋白质等电点的测定还有哪些方法问题：蛋白质等电点的测定还有哪些方法?第14页，本讲稿共21页n本实验通过本实验通过观察不同观察不同pHpH溶液中酪蛋白的溶解度来测溶液中酪蛋白的溶解度来测定其等电点定其等电点。n用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同配制各种不同pHpH值的缓冲液。向各缓冲溶液中值的缓冲液。向各缓冲溶液中加入酪蛋白后，加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的沉淀出现最多的缓冲液的pHpH值值即为酪蛋白的等电点即为酪蛋白的等电点。第15页，本讲稿共21页三、试剂仪器和试剂三、试剂仪器和试剂1 1、仪器设备、仪器设备 n试管及试管架试管及试管架n滴管滴管n吸量管吸量管n容量瓶容量瓶 第16页，本讲稿共21页n0.5%0.5%酪蛋白溶液酪蛋白溶液n0.01%0.01%溴甲基溴甲基酚绿指示剂酚绿指示剂n0.10 mol/L 0.10 mol/L 盐酸溶液盐酸溶液n0.10 0.10 mol/L mol/L 氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液n1.00 mol/L 1.00 mol/L 醋酸溶液醋酸溶液n0.10 mol/L 0.10 mol/L 醋酸溶液醋酸溶液n0.01 mol/L 0.01 mol/L 醋酸溶液醋酸溶液2 2、试剂、试剂第17页，本讲稿共21页四、实验步骤与结果四、实验步骤与结果1 1、观察蛋白质的两性反应、观察蛋白质的两性反应步骤步骤操作操作现象现象解释结论解释结论1 1取试管取试管1 1，加，加2020滴滴0.5%0.5%酪蛋白溶液和酪蛋白溶液和5-75-7滴滴0.01%0.01%溴甲酚绿指示剂，混匀溴甲酚绿指示剂，混匀观察溶液颜色和观察溶液颜色和沉淀沉淀结合思考结合思考1 1，解释，解释2 2缓慢滴加缓慢滴加0.1mol/L0.1mol/L盐酸溶液，随滴盐酸溶液，随滴随摇，直至大量沉淀发生随摇，直至大量沉淀发生观察溶液颜色和观察溶液颜色和沉淀沉淀结合思考结合思考2 2，解释，解释3 3继续滴加继续滴加0.1mol/L0.1mol/L盐酸溶液盐酸溶液观察观察溶液颜色和溶液颜色和沉淀沉淀结合思考结合思考1 1，解释，解释4 4滴加滴加0.1mol/L0.1mol/L氢氧化钠溶液进行中氢氧化钠溶液进行中和，直至沉淀出现和，直至沉淀出现观察溶液颜色和观察溶液颜色和沉淀沉淀结合思考结合思考2 2，解释，解释5 5继续滴加继续滴加0.1mol/L0.1mol/L氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液观察溶液颜色和观察溶液颜色和沉淀沉淀结合思考结合思考1 1，解释，解释第18页，本讲稿共21页（2 2）观察其混浊度。静置）观察其混浊度。静置1515分钟后，再观察其混浊度。分钟后，再观察其混浊度。结果可用结果可用“+、+、+”表示浑浊度，表示浑浊度，最混浊的一管最混浊的一管pHpH即接近酪蛋白的等电点即接近酪蛋白的等电点。（1）取5支试管，按书中表格分别加入各试剂，混匀。2 2、测定酪蛋白等电点、测定酪蛋白等电点第19页，本讲稿共21页n实验结果：实验结果：按照实验报告要求计算实验结果。按照实验报告要求计算实验结果。n分析：分析：通过操作本次实验，探讨影响本实验结果的主要影响因素。通过操作本次实验，探讨影响本实验结果的主要影响因素。分析实验成功或失败的主要原因。分析实验成功或失败的主要原因。五、实验结果与分析五、实验结果与分析第20页，本讲稿共21页六、实验结论六、实验结论n酪蛋白的等电点接近多少？第21页，本讲稿共21页