高效液相色谱法 (2)优秀课件.ppt

高效液相色谱法1第1页，本讲稿共23页 第六节第六节 高效毛细管电泳高效毛细管电泳一、高效毛细管电泳仪器一、高效毛细管电泳仪器2第2页，本讲稿共23页3第3页，本讲稿共23页4第4页，本讲稿共23页二、高效毛细管电泳基本原理二、高效毛细管电泳基本原理在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为象，称之为电泳电泳。由于。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同可实现分离移速率不同可实现分离。经典电泳分离法的不足：所用经典电泳分离法的不足：所用分离柱的柱径大，柱较短，分分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于离效率不高（远低于HPLC），），温度影响大。温度影响大。高效毛细管电泳在技术上采取高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进。了两项重要改进。5第5页，本讲稿共23页高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一是采用了一是采用了0.05mm内径的毛细管；内径的毛细管；二是采用了高达数千伏的电压。二是采用了高达数千伏的电压。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。温度效应，使电场电压可以很高。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，柱长增加，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。米，特殊柱子可以达到数百万。6第6页，本讲稿共23页电泳现象与电渗流现象电泳现象与电渗流现象电泳现象电泳现象：带电离子在电场作用下的迁移，速度：带电离子在电场作用下的迁移，速度v电泳电泳电渗流现象电渗流现象：玻璃表面存在硅羟基玻璃表面存在硅羟基,pH3时时,形成双电层，在高形成双电层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速度电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速度v电渗流电渗流7第7页，本讲稿共23页分离过程：分离过程：电场作用下电场作用下,柱中出现：柱中出现：电泳现象电泳现象和和电渗流现象电渗流现象带电粒子的迁移速度带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度的矢量和电泳和电渗流两种速度的矢量和正离子：两种效应的运动方向一致正离子：两种效应的运动方向一致,在负极最先流出在负极最先流出中性粒子无电泳现象中性粒子无电泳现象,受电渗流影响受电渗流影响,在阳离子后流出在阳离子后流出阴阴离离子子：两两种种效效应应的的运运动动方方向向相相反反，v电电渗渗流流 v电电泳泳时时,阴阴离离子子在在负负极极最最后后流流出出,在在这这种种情情况况下下,不不但但可可以以按按类类分分离离,除除中中性性粒粒子子外外,同同种种类类离离子子由由于于受受到到的的电电场场力力大大小小不不一一样样也也同同时时被被相相互互分分离。离。8第8页，本讲稿共23页 分离类型分离类型 1.毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（CZE）最普遍、最基本的一种分离模式。最普遍、最基本的一种分离模式。2.毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（CGE）将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、可分离测定蛋白质、DNA等。等。9第9页，本讲稿共23页3.毛细管胶束电动色谱（毛细管胶束电动色谱（MECC）在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，形成一疏水内核、外部在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，形成一疏水内核、外部带负电的带负电的胶束胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。由于电泳流和。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。由于电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流的方向相反，且v电渗流电渗流 v电泳电泳，则带负电的胶束以较慢的速，则带负电的胶束以较慢的速度向负极方向移动，中性试样分子在胶束相和溶液（水相）两度向负极方向移动，中性试样分子在胶束相和溶液（水相）两相间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长。相间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长。可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。10第10页，本讲稿共23页11第11页，本讲稿共23页三、仪器装置三、仪器装置 电压：电压：030KV。分离柱不涂敷任何固定液，分离柱不涂敷任何固定液，紫外或激光诱导荧光检测器紫外或激光诱导荧光检测器（可检测到：（可检测到：10-1910-21 mol/L）12第12页，本讲稿共23页四、影响柱效的因素及改进方法四、影响柱效的因素及改进方法热效应热效应：焦耳热是影响柱效的主要因素。采用外部冷却的方法：焦耳热是影响柱效的主要因素。采用外部冷却的方法散热，选择合适的电压和电解质也是提高柱效的有效途径。选散热，选择合适的电压和电解质也是提高柱效的有效途径。选择合适的电解质降低电阻，电流低于择合适的电解质降低电阻，电流低于200微安，一般几十微安。微安，一般几十微安。电渗流控制电渗流控制：电渗流的大小和方向，依赖于毛细管壁与溶液：电渗流的大小和方向，依赖于毛细管壁与溶液间电势的极性和大小。间电势的极性和大小。使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可和甲醇可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗流。加入反转剂，则可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗流。加入反转剂，则可以改变电渗流的方向。以改变电渗流的方向。13第13页，本讲稿共23页五、主要特点和应用五、主要特点和应用高分辨率高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。高灵敏度高灵敏度：可检测出低至：可检测出低至10-21 mol/L浓度的物质。浓度的物质。高分析速度高分析速度：可在：可在3分钟内分离分钟内分离30种阴离子；种阴离子；1.7分钟分离分钟分离19种阳种阳离子离子;4分钟可分离分钟可分离10种蛋白质种蛋白质.试样用量少试样用量少：仅需几：仅需几nL（10-9 L）的试样的试样仪器简单，操作成本低仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动液。：分析一个试样仅需几毫升流动液。不足之处：不足之处：进样不够方便。进样不够方便。应用范围相对较窄。应用范围相对较窄。14第14页，本讲稿共23页第七节第七节 纸层析和薄层层析法纸层析和薄层层析法一、纸层析和薄层层析分离过程一、纸层析和薄层层析分离过程纸层析和薄层层析也属于色谱分析法。但与其它色谱方法不同的是在分离过程中一般不使用动力源。纸层析和薄层层析流动相的移动是纸层析和薄层层析流动相的移动是依靠毛细作用依靠毛细作用。将试样点在色谱滤纸或层析板的一端，并将该端浸在作为流动相的溶剂（常称之为展开剂）中，随着溶剂向上的移动，经过试样点时，带动试样向上运动。15第15页，本讲稿共23页比移值比移值16第16页，本讲稿共23页17第17页，本讲稿共23页二、操作技术二、操作技术层析纸和层析板层析纸和层析板:特制的色层滤纸。特制的色层滤纸。按需要剪裁成长条形（或筒型）。层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶或氧化铝，200250目）均匀地涂在长条形玻璃板上（厚度0.150.5mm）。干燥后即可使用。18第18页，本讲稿共23页1.展开剂展开剂展开剂：由一种或多种溶剂按一定比例组成。展开剂：由一种或多种溶剂按一定比例组成。如用纸层析分离氨基酸时，常用的展开剂组成和配比为：正丁醇：乙酸：水=4：1：119第19页，本讲稿共23页2.点样点样点点样样:用用微微量量注注射射器器或或玻玻璃璃毛毛细细管管吸吸取取一一定定量量试试样样点点在在原原点点上上。试样点的直径一般应小于试样点的直径一般应小于5mm。可并排点多个试样同时展开。可并排点多个试样同时展开。20第20页，本讲稿共23页3.显色检测显色检测有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用铅笔将有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用铅笔将组份斑点描绘出来。组份斑点描绘出来。常用的显色方法常用的显色方法:喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。21第21页，本讲稿共23页三、特点及应用三、特点及应用优点：优点：平板色谱简单、方便、及操作费用低；平板色谱简单、方便、及操作费用低；可可以以在在一一块块层层析析板板上上同同时时展展开开多多个个试试样样及及将将多多条条滤滤纸纸同同时时展开；展开；采采用用方方形形薄薄层层板板还还可可以以方方便便的的进进行行二二维维展展开开，即即按按一一般般方方法法展展开后，改变方向和展开剂再次展开，进一步改善分离效果；开后，改变方向和展开剂再次展开，进一步改善分离效果；试样一般不需要经过预处理即可分离。试样一般不需要经过预处理即可分离。22第22页，本讲稿共23页缺点缺点:分离效率较低，不适用挥发性试样分离。分离效率较低，不适用挥发性试样分离。定性定量不便。定性定量不便。应用：应用：平板色谱法在染料、农药、医药、有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基酸、蛋白质及中草药中有效成分的分离分析中经常被使用；可以用于无机离子的分离；作为高效液相色谱的一种预试方法。23第23页，本讲稿共23页