药物毒理学研究.ppt

药物毒理学 是根据药物的物理化学特性，运用毒理学的原理和方法，对其进行全面系统的安全性评价并阐明其毒性作用机制，以便降低药物对人类健康危害程度的一门科学。药物毒理学的研究目的 在于阐明药理有害作用出现的模式，机制，剂量时间反应关系等内在的规律性，以便临床上安全合理的使用药物。一、当前国外药物毒理学研究的发展趋势1药物毒理学研究逐步走向规范化、标准化2药物毒理学研究对象从群体转向个体 患者对药物反应的个体差异是由于个体在药物处置过程中的生物大分子，如药物代谢酶（DMF）、药物转运体、药物靶分子及DNA修复酶的遗传差异及用药时某些环境和生理因素各不相同造的。遗传药理学（pharmacogenetics）主要研究药物毒性反应个体差异形成的原因和机制，用以指导未来药物合成和临床应用。其研究重点为药物毒性反应个体差异的遗传基础及与毒性反应易感性相关的生物学标记物。由于患者间在药物处理过程中存在非常大的遗传差异，导致药物在体内的代谢酶、遗传损伤的修复、甚至药物的作用靶点也各不相同，最终导致在患者中疗效和毒副作用千差万别。因此在临床用药及进行药物安全性评价时，临床医师及毒理学家所关注的对象也不应为某一群体，而是单个的患者。临床用药应向个体化用药（individualized medicine）的方向发展。遗传药理学家通过药物毒副反应发生机制的研究找出其相关的基因型及表现型，并通过生物学标志物筛选出发生毒副反应的高危人群或个体，供医师临床用药时参考和决策。3基因技术进入药物毒理学各个研究领域（1）转基因动物药物毒性筛选模型（2）基因点阵芯片技术用于研究药物所致 的基因表达模式的改变（3）基因敲除技术用于阐明药物的毒性作 用机制4药物毒性作用机制研究进一步深化 近年来在细胞周期调控、细胞凋亡、细胞癌变、信号转导、细胞发育及分化、细胞粘附和迁移等基本生物学过程中所取得的快速发展，为药物毒理学家提供了许多崭新的研究领域，如Shuey等运用5-氟尿嘧啶抑制胸苷酸合成酶导致细胞周期阻滞为中心机制建立了生理性药代模型，并用于评价其发育毒性，有效地解决了从动物实验外推到人时出现不确定性这一难题。5毒代动力学已成为毒理研究中的重要组成部分在毒性评价前进行毒代动力学试验的优点下：（1）有助于确定毒性试验的毒代动力学概况；（2）有助于选择合适的投药剂量、剂型及途径（3）有助于评价和解释可能出现的毒性（无作用剂 量/中毒剂量，毒性作用机制）；（4）有助于进行动物和人之间的毒代动力学及毒性比较；（5）有助于在期临床试验时推荐用药起始剂量。6 3Rs在药物毒理学研究中的应用 所谓3Rs是在生物医学实验中减少（reduction）、替代(replacement)和优化(refinement)使用实验动物的简称。20世纪70年代早期，由于实验动物使用量增加和动物保护运动的兴起，3Rs 研究引起了社会各界的极大关注。80年代初，著名生理学家Denid Smith在对3Rs 方面的调查研究基础上，发表了动物试验替代物(Altermatives to Animal Experiment)一书,他在书中对替代物所下的定义被人们广泛接受。目前，国际上3Rs是毒理学中比较活跃的研究领域，如各种Draize眼刺激试验的替代法；皮肤过敏试验中用局部淋巴结试验（local lymph node assay,LLNA）替代豚鼠Bueher试验；用酵母生长抑制试验替代动物急性毒性试验；用全胚胎、胚胎器官体外培养或其它动物（如鸡、鱼、果蝇、海胆或两栖动物）的胚胎的体外培养替代致畸性过筛等。替代药物毒理学主要是在通过结构活性分析得知某类药物毒性靶器官的情况下，用组织培养、器官培养、器官灌流、细胞培养等体外试验技术，评价药物毒性大小，探索药物毒性作用机制。二、未来应重点开展的研究领域1、规范测试，建立我国的GLP规范化、标准化管理体系2、转变观念，多环节多渠道开展药物毒理学研究 在新药的发现、开发、评价、审批及后期临床使用和监测等多个环节中，药物毒理学均发挥积极的指导和规范作用。我们应彻底转变将药物毒理学研究作为新药开发和研究的某一环节的旧观念，充分认识药物毒性和药理活性之间相辅相成、相互转化的关系。化被动为主动，准确把握药物毒性作用出现的模式，剂量-时间-反应关系等内在规律性。在新药开发的早期运用高通量体外筛选模型评价某种先导化合物的潜在毒性，并努力运用各种先进的技术手段来加以解决。该领域应重点投入的研究课题为：（1）药物毒理学资料计算机网数据库的建立（2）药物靶器官毒性作用机制及定量构效关系研究（3）药物体外替代性毒性筛选模型的建立和运用 急性毒性快速筛选模型 致突变性体外评价模型 致癌性体外评价模型（尤其是体外恶性转化试验）发育毒性体外评价模型（4）药物毒理学研究中的3Rs的研究和应用3注重机制，加强药物毒理学的基础研究 药物毒理学基础研究是阐明药物剂量反应关系，建立体内外毒（药）理筛选模型和进行药物毒性评价的前提和首要条件。近期应在药物一般毒理学研究基础上，注意研究药物作用靶器官及其作用机制、细胞凋亡和细胞信号转导系统在药物毒性发生中的作用。遗传毒理学要着重在细胞、DNA水平上研究药物诱发体内外突变的过程、模式及机制，突变与癌变发生的相互关系；在致癌机制方面应重点阐明药物诱发癌变与细胞周期的关系，DNA甲基化、基因组印迹、异染色体效应等遗传上位效应在癌变发生中的作用。该领域应重点投入的课题有：（1）细胞凋亡和细胞信号转导系统在药物毒性发生中的作用（2）药物作用靶器官及其作用机制研究（3）转基因动物在药物毒理学研究中的应用（4）药物突变、癌变作用机制及药物突变与癌变作用的相互关系4抓住重点，加强中草药、生物制品及精神药物毒性评价方法的研究 未来中草药毒理学应加强药物毒性成份的分离、定性；中草药的生殖、免疫及神经毒性的发生和机制；胎儿、儿童及老人等中草药毒性高敏人群中毒性发生的模式及筛选；各中草药间毒性相互影响及配伍禁忌等研究。生物制品种类繁多，特性各异。其毒性评价一般按毒理学基本原则，并根据其自身的理化和生物特点及拟订的临床使用病例做个案（case-by-case）处理。生物制品毒性评价中应重点考虑其免疫毒性，包括交叉反应、免疫原性、超敏反应、免疫耐受性的诱导等。未来的研究重点应为：（1）建立免疫指标基础值；（2）免疫指标改变的毒理学意义；（3）制订切实可行的免疫毒性评价方案和原则；（4）确定免疫毒性的发生模式、机制。近年来，我国精神药物的身体依赖性问题日益突出，并带来一系列严重的社会问题。这就要求我们一方面做到防患于未然，在精神类新药中增加精神成瘾性评价及对亲代、子代行为功能的影响等内容，另一方面加大对药物心理和身体依赖性发生机制的研究，探索其出现的频率、模式及量效关系，从而找出合适的戒除方法。该领域中应重点投入的课题有：（1）中草药毒性评价模型、方法及某些特殊问题的研究（2）生物制品毒性（尤其是免疫毒性）评价方法的建立和认证（3）精神依赖性药物诱发行为致畸的机制研究。5科学评价，重视毒代动力学研究 首先应对我国使用量较大的药物开展毒代动力学模型的研究，并建立相应的血药浓度化学分析方法。在此基础上进行毒代动力学评价的标准化、规范化研究；确定适当的动物数量、受试物种数量、生物分析方法和毒代模型。国内有些新药评价单位已有开展药物毒代动力学研究的经验，并具备相应的配套实验设备及计算机模型拟合软件；若与新药毒性评价、新药开发研究相结合，相信会提高我国药物毒理学的整体发展水平。此外，我国中草药资源丰富，如何开展某些中草药活性成份的毒代动力学试验，建立相应的血药浓度分析方法并提高分析结果准确度也是一项值得进一步研究的课题。该领域重点投入的课题为：（1）新药评价中毒代动力学方法和模型的建立和应用（2）生理性药代动力学模型的建立及其在药物毒性风险评价中的应用（3）此外，以下几个领域是我国药物毒理学研究中的薄弱环节，也应引起足够的重视。6加强药物致畸作用机制研究，扩大药物发育毒性评价的范围 近年来发育生物学发展迅速，许多参与胚胎发育和器官形态发生的基因、生物大分子陆续被发现，类视黄醇、苯妥英钠及其他重要致畸机制研究中的热点。在此基础上，一系列体外药物或化学物致畸评价筛选模型应运而生，其中器官形成期细胞分化模型，转基因胚胎干细胞生长分化模型及植入后全胚培养模型，经大范围实验室间认证显示出较好的应用前景。开展发育毒物对胚胎发育中重要基因表达的影响、化学致畸药致氧化性损伤及基发生机制、致畸物对发育途径的影响等研究。7大力开展药物遗传药理学研究 近年来的群体遗传学研究表明我国各民族在细胞色素P450、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）等药物代谢酶（DME），某些药物靶分子，DNA损伤修复酶及药物转运体等方面存在广泛的基因多态性；各民族之间在DME上存在较大差异，并且与西方发达国家的DME谱也有明显不同。今后应积极开展环氧化物羟化酶、相酶等以前未开展的DME的遗传多态性研究，同时还应开展MDR P糖蛋白、血清白蛋白及DNA修复酶的基因多态性研究，在打好遗传药理学研究的基础上，进一步探讨上述群体间或个体间的遗传差异与药物毒性反应、致突变、致癌及致畸潜能的关系。8发挥药物毒理学在认识和探索生命现象本质和规律中的作用 首先，药物毒理学有助于认识高等动物解毒防御机制的进化规律。植物药比合成药的毒性低、副作用小，这是由于经过长期自然选择，生物体内进化出一系列对抗植物毒素的代谢解毒系统（如植物毒素解毒酶，CYP450，DNA修复酶），以降低其对机体的损害。此外，如妊娠早期带有染色体异常的严重畸形胎儿流产，出现晨吐反应可降低群体中有害基因的遗传负荷和胎儿对植物毒素的摄入量。相对而言，对合成药等进化史上新出现的毒物，高等动物的解毒机制还未能进化完善，因而要求药物毒理学家作出科学的毒性评价。其次，药物毒性反应模式、致突变、致畸机制的研究可促进对生长、增殖、发育和遗传等生命现象的认识。如类视黄醇致畸机制的研究，证实了视黄醇受体在胚胎发育过程中的重要作用；通过对多环芳烃、过氧化小体增殖剂致肝毒、肝癌效应的研究，先后分离并克隆了这两类毒物的体内受体（AhR,PPARs），并阐明了其生理功能。其三，药物毒理学的发展为研究某些细胞受体或蛋白的生物功能提供多种必需的工具药，如秋水仙碱（微管）、松胞素B（微丝蛋白）、放线菌素D（阻滞DNA合成）、放线菌酮（阻断蛋白质转译）、河豚毒素（阻滞Na通道）等，从而促进了细胞分子生物学的发展。毒作用机制的研究毒作用机制的研究 毒物对靶位点（分子）的作用毒物对靶位点（分子）的作用 靶位点学说（靶位点学说（target sent theory）共价结合学说（共价结合学说（coralcnt bindery theory）n（1）毒物与靶分子的结合作用）毒物与靶分子的结合作用 毒物与靶分子毒物与靶分子以共价和非共价形式结合。非共价结合的能量相以共价和非共价形式结合。非共价结合的能量相对较低，这种结合是可逆的。共价结合一般是不对较低，这种结合是可逆的。共价结合一般是不可逆的，能永久性地改变内源性分子的结构。故可逆的，能永久性地改变内源性分子的结构。故这类反应具有重要的毒理意义。如一氧化碳、氰这类反应具有重要的毒理意义。如一氧化碳、氰化物、硫化物和叠氮化合物与血红蛋白中的铁可化物、硫化物和叠氮化合物与血红蛋白中的铁可以形成共价结合。如图以形成共价结合。如图4-4示：最终毒物与靶分示：最终毒物与靶分子的作用是产生毒性的第二步。子的作用是产生毒性的第二步。n毒物对靶分子的作用，可以引起靶分子的功能紊毒物对靶分子的作用，可以引起靶分子的功能紊乱和结构破坏。如毒物常作用于蛋白质结构的关乱和结构破坏。如毒物常作用于蛋白质结构的关键部位，如巯基基因键部位，如巯基基因SH。该部位直接参与蛋。该部位直接参与蛋白质的催化功能和组装大分子的功能。很多蛋白白质的催化功能和组装大分子的功能。很多蛋白质的活性受损均起于巯基基团的破坏。各种污染质的活性受损均起于巯基基团的破坏。各种污染物或其代谢产物通常可与结构蛋白质或酶的活性物或其代谢产物通常可与结构蛋白质或酶的活性中心如半胱氨酸的巯基、丝氨酸的羟基、精氨酸中心如半胱氨酸的巯基、丝氨酸的羟基、精氨酸的胍基、赖氨酸的的胍基、赖氨酸的e-氨基等部位发生共价结合，氨基等部位发生共价结合，最终抑制这些蛋白质的功能。最终抑制这些蛋白质的功能。（2）毒物与核酸的结合毒物与核酸的结合 核酸（核酸（nucleic acid）是生物信息遗传物质，可分为）是生物信息遗传物质，可分为DNA和和RNA两大类。污染物不仅可与这些核酸物质发生共价两大类。污染物不仅可与这些核酸物质发生共价结合，还可与核酸的氢键结合，或者嵌入碱基对结合，还可与核酸的氢键结合，或者嵌入碱基对之间，千万遗传信息的错误表达。许多终毒物可之间，千万遗传信息的错误表达。许多终毒物可与核酸中鸟嘌呤的与核酸中鸟嘌呤的N7、C8、O6、NH2，腺嘌，腺嘌呤的呤的N1、N3、NH2，胞嘧啶的，胞嘧啶的N3、NH2等等电子支点发生共价结合。也可与胸腺嘧啶的电子支点发生共价结合。也可与胸腺嘧啶的N3、O2、O8、O6，以及尿嘧啶和胞嘧啶的，以及尿嘧啶和胞嘧啶的C6等低电等低电子云点发生共价结合子云点发生共价结合 毒物引起的细胞功能障碍毒物引起的细胞功能障碍n 机体协调细胞的各种活动，是通过每个细胞机体协调细胞的各种活动，是通过每个细胞执行其各自目的的指令或程序而达成的，即细胞执行其各自目的的指令或程序而达成的，即细胞是否进入分裂、分化或死亡；细胞是否分泌各种是否进入分裂、分化或死亡；细胞是否分泌各种物质、转移或代谢营养物质等。外源性毒物能引物质、转移或代谢营养物质等。外源性毒物能引起细胞调节失控，如基因表达失控，许多天然化起细胞调节失控，如基因表达失控，许多天然化合物如激素、维生素等通过与转录因子结合而激合物如激素、维生素等通过与转录因子结合而激活或影响基因的正常表达。信号传递失调，包括活或影响基因的正常表达。信号传递失调，包括蛋白质磷酸化或支磷酸化反应，都会改变由转录蛋白质磷酸化或支磷酸化反应，都会改变由转录因子调节的基因表达。细胞稳定失调引起的毒性，因子调节的基因表达。细胞稳定失调引起的毒性，如细胞稳态的破坏如细胞稳态的破坏ATP合成的损伤；细胞内合成的损伤；细胞内Ca2+浓度的升高都对细胞有损害作用，是影响浓度的升高都对细胞有损害作用，是影响细胞结构和功能而导致死亡的常见机制。细胞结构和功能而导致死亡的常见机制。细胞内钙离子浓度升高：通过主动细胞内钙离子浓度升高：通过主动运输将钙离子泵出细胞外，或隔离在内运输将钙离子泵出细胞外，或隔离在内质网膜和线粒体内。毒性化学物通过激质网膜和线粒体内。毒性化学物通过激发钙离子流入细胞内或抑制钙离子的排发钙离子流入细胞内或抑制钙离子的排出，钙离子通过图出，钙离子通过图4-9中中14途径被运到途径被运到细胞间抽，引起细胞膜内的钙离子浓度细胞间抽，引起细胞膜内的钙离子浓度升高，因而对细胞有损害作用，会造成升高，因而对细胞有损害作用，会造成能量储备的耗竭，微丝失去功能和水解能量储备的耗竭，微丝失去功能和水解酶的激化。酶的激化。修复和修复失调修复和修复失调 损伤的分子可通过几种途径得到修复。蛋损伤的分子可通过几种途径得到修复。蛋白质的某些变化，如蛋白巯基的氧化和白质的某些变化，如蛋白巯基的氧化和DNA的的甲基化是可逆的。通过水解作用而去除分子的甲基化是可逆的。通过水解作用而去除分子的损伤部分或者插入重新合成的结构，是常见的损伤部分或者插入重新合成的结构，是常见的修复机制可见于化学性变异的修复机制可见于化学性变异的DNA和过氧化的和过氧化的脂肪。在某些情况下，受损的分子可以全部分脂肪。在某些情况下，受损的分子可以全部分解而重新合成。例如在有机磷中毒后重新生成解而重新合成。例如在有机磷中毒后重新生成胆碱酯酶。蛋白质中是有催化作用的巯基经氧胆碱酯酶。蛋白质中是有催化作用的巯基经氧化后，又通过还原反应而被重新循环利用。化后，又通过还原反应而被重新循环利用。n DNA修复：尽管细胞核修复：尽管细胞核DNA容易与容易与亲电子物和自由基发生反应，但亲电子物和自由基发生反应，但DNA是是相对稳定的。其原因是由于相对稳定的。其原因是由于DNA是有多是有多种修复损伤的功能。种修复损伤的功能。