氨基酸工艺学第二章谷氨酸发酵机制优秀PPT.ppt

氨基酸工艺学第二章谷氨酸发酵机制你现在浏览的是第一页，共68页第一节第一节 谷氨酸发酵机制谷氨酸发酵机制1.谷氨酸的作用：谷氨酸谷氨酸的作用：谷氨酸(g1utamate，Glu，C5H9O4N)是中枢神经系统中一种最重要的是中枢神经系统中一种最重要的兴奋性神经递质兴奋性神经递质，主，主要分布于大脑皮质、海马、小脑和纹状体，在要分布于大脑皮质、海马、小脑和纹状体，在学习学习、记忆记忆、神经元可塑性神经元可塑性及及大脑发育大脑发育等方面均起重要作用。此外，谷等方面均起重要作用。此外，谷氨酸对氨酸对心肌能量代谢心肌能量代谢和和心肌保护心肌保护起着重要作用。起着重要作用。你现在浏览的是第二页，共68页一、谷氨酸生物合成途径一、谷氨酸生物合成途径 生物体内合成谷氨酸的前体物质是生物体内合成谷氨酸的前体物质是a酮戊二酸酮戊二酸，是，是三羧酸循环三羧酸循环(TCA循环循环)的中间产物，由糖质原料生物合的中间产物，由糖质原料生物合成谷氨酸的途径包括成谷氨酸的途径包括糖酵解途径糖酵解途径(EMP途径途径)、三羧酸三羧酸循环循环、乙醛酸循环乙醛酸循环、CO2的固定反应的固定反应(伍德一沃克曼反伍德一沃克曼反应应)等。等。你现在浏览的是第三页，共68页（一）、葡萄糖的糖酵解、三羧酸循环和（一）、葡萄糖的糖酵解、三羧酸循环和乙醛酸循环乙醛酸循环 1.糖酵解途径（糖酵解途径（EMP途径）途径）将将一分子葡萄糖一分子葡萄糖分解成分解成两两分子丙酮酸分子丙酮酸,并且发生氧并且发生氧化化(脱氢脱氢)和生成少量和生成少量ATP。葡萄糖葡萄糖6磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖3磷酸甘油醛磷酸甘油醛丙酮酸丙酮酸6磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸5磷酸核酮糖磷酸核酮糖HMP途径EMP途径2.戊糖磷酸途径（戊糖磷酸途径（HMP途径）途径）可以生成酵解途径的中间产物可以生成酵解途径的中间产物6磷酸果糖磷酸果糖和和3磷酸磷酸甘油醛甘油醛。你现在浏览的是第四页，共68页肌肉中的葡萄糖代谢情况肌肉中的葡萄糖代谢情况你现在浏览的是第五页，共68页3.三羧酸循环（三羧酸循环（TCA循环）循环）谷氨酸谷氨酸（胞内）（胞内）转移到转移到胞外胞外草酰乙酸草酰乙酸柠檬酸柠檬酸顺乌头酸顺乌头酸异柠檬酸异柠檬酸-酮戊二酸酮戊二酸琥珀酸琥珀酸延胡索酸延胡索酸苹果酸苹果酸丙酮酸丙酮酸乙酰乙酰CoA乙醛酸乙醛酸+CO2乙醛酸循环中的两个乙醛酸循环中的两个关键关键酶酶异柠檬酸裂解酶异柠檬酸裂解酶和和苹果酸合成酶。苹果酸合成酶。异柠檬酸脱氢酶 NH4酮戊二酸脱氢酶酮戊二酸脱氢酶 你现在浏览的是第六页，共68页（二）谷氨酸合成的理想途径（二）谷氨酸合成的理想途径在发酵在发酵产酸产酸期，期，EMP所占比例更大，约为所占比例更大，约为74。生物素充足菌生物素充足菌EMP所占比例约为所占比例约为62；你现在浏览的是第七页，共68页（三）由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径（三）由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径 3.在谷氨酸发酵的在谷氨酸发酵的菌体生长期菌体生长期，由于三羧酸循环中的，由于三羧酸循环中的缺陷缺陷(丧失丧失a酮戊二酸脱氢酶氧化能力或氧化能力微弱酮戊二酸脱氢酶氧化能力或氧化能力微弱)，谷氨酸产生菌采用谷氨酸产生菌采用乙醛酸循环乙醛酸循环途径进行代谢，提供四途径进行代谢，提供四碳二羧酸及菌体合成所需的中间产物等。碳二羧酸及菌体合成所需的中间产物等。2.此代谢途径至少有此代谢途径至少有16步酶步酶促反应。促反应。1.谷氨酸生产菌株为谷氨酸生产菌株为缺陷型缺陷型，生产过程分为，生产过程分为菌体生菌体生长期长期和和谷氨酸积累期谷氨酸积累期。你现在浏览的是第八页，共68页 4.在菌体生长期之后，进入在菌体生长期之后，进入谷氨酸生成期谷氨酸生成期，封闭封闭乙乙醛酸循环，醛酸循环，积累积累-酮戊二酸酮戊二酸，就能够大量生成、就能够大量生成、积积累谷氨酸累谷氨酸。因此在谷氨酸发酵中，菌体生长期的最适条因此在谷氨酸发酵中，菌体生长期的最适条件和谷氨酸生成积累期的最适条件是不一样的。件和谷氨酸生成积累期的最适条件是不一样的。你现在浏览的是第九页，共68页5.由葡萄糖生物由葡萄糖生物合成谷氨酸的代合成谷氨酸的代谢途径谢途径你现在浏览的是第十页，共68页（1 1）在谷氨酸生成期，）在谷氨酸生成期，假如四碳二假如四碳二羧羧酸是酸是100100通通过过C0C02 2固定反固定反应应供供给给，在生在生长长期之后，理想的期之后，理想的发发酵按如下反酵按如下反应进应进行：行：1mol1mol葡萄糖可以生成葡萄糖可以生成1mol1mol的谷氨酸，谷氨酸的谷氨酸，谷氨酸对对葡萄糖的葡萄糖的质质量理量理论转论转化率化率为为：6.葡萄糖对谷氨酸的转化率葡萄糖对谷氨酸的转化率你现在浏览的是第十一页，共68页（2 2）在谷氨酸生成期，若）在谷氨酸生成期，若 COCO2 2固定反固定反应应完全不起作用完全不起作用，丙丙酮酮酸在丙酸在丙酮酮酸脱酸脱氢氢酶酶的催化的催化作用下，脱作用下，脱氢氢脱脱羧羧全部氧化成全部氧化成乙乙酰酰CoACoA，通，通过过乙乙醛醛酸循酸循环环供供给给四碳二四碳二羧羧酸。反酸。反应应如下：如下：3C6H12O66丙酮酸丙酮酸6乙酰乙酰CoA乙醛酸循环：乙醛酸循环：4乙酰乙酰CoA+4H2O2琥珀酸琥珀酸+4CoASH6乙酰乙酰CoA+2NH3+3O22谷氨酸谷氨酸+2CO2+6H2O你现在浏览的是第十二页，共68页3mol葡萄糖可以生成葡萄糖可以生成2mol的谷氨酸，谷氨的谷氨酸，谷氨酸对葡萄糖的酸对葡萄糖的质量理论转化率质量理论转化率为：为：(3)实际转化率：实际转化率：处于二者之间，处于二者之间，即即54.4%81.7%。CO2固定反应、乙醛酸循环的比率等对转化率影响固定反应、乙醛酸循环的比率等对转化率影响较大。较大。乙醛酸循环活性越高，谷氨酸越不易生成与积累。乙醛酸循环活性越高，谷氨酸越不易生成与积累。你现在浏览的是第十三页，共68页7.醋酸醋酸或或正石蜡正石蜡原料发酵谷氨酸的推测途径原料发酵谷氨酸的推测途径 在醋酸发酵谷氨酸或石油发酵谷氨酸时，却在醋酸发酵谷氨酸或石油发酵谷氨酸时，却只能经乙只能经乙醛酸循环供给四碳二羧酸醛酸循环供给四碳二羧酸，四碳二羧酸经草酰乙酸又，四碳二羧酸经草酰乙酸又转化为柠檬酸。转化为柠檬酸。你现在浏览的是第十四页，共68页二、谷氨酸生物合成的代谢调节机制二、谷氨酸生物合成的代谢调节机制 在工业上，通过在工业上，通过对微生物代谢途径的控制对微生物代谢途径的控制来满足生产来满足生产的需要，提高生产效益。的需要，提高生产效益。所以，研究微生物代谢调节机制有极其重要的意义。所以，研究微生物代谢调节机制有极其重要的意义。合成代谢将分解代谢产生的能量和中合成代谢将分解代谢产生的能量和中间体合成氨基酸、核酸、蛋白质等物间体合成氨基酸、核酸、蛋白质等物质。质。微生物微生物的代谢的代谢分解代谢分解代谢：合成代谢合成代谢：从环境中摄取营养物质，把它们转化从环境中摄取营养物质，把它们转化为自身物质，以此来提供能源和小分为自身物质，以此来提供能源和小分子中间体；子中间体；你现在浏览的是第十五页，共68页 1糖代谢糖代谢(EMP途径和途径和HMP途径途径)的调节的调节 糖代谢可分为糖代谢可分为分解分解与与合成合成两方面。两方面。糖分解代谢糖分解代谢包括酵解与三羧酸循环；包括酵解与三羧酸循环；（提供能量）（提供能量）合成代谢合成代谢包括糖的异生、糖原与结构多糖的合成等，包括糖的异生、糖原与结构多糖的合成等，中间代谢还有磷酸戊糖途径、糖醛酸途径等。中间代谢还有磷酸戊糖途径、糖醛酸途径等。（消耗（消耗能量）能量）你现在浏览的是第十六页，共68页(1)能荷的调节能荷的调节腺嘌呤核苷三磷酸，又叫三磷酸腺苷腺嘌呤核苷三磷酸，又叫三磷酸腺苷(腺苷三磷酸腺苷三磷酸)，简称为简称为ATP。其其结构简式是：结构简式是：APPP，其相邻的两个磷酸基之，其相邻的两个磷酸基之间的化学键非常活跃，水间的化学键非常活跃，水解时可释放约解时可释放约30.54kJ/mol的能量，因的能量，因此称为高能磷酸键。此称为高能磷酸键。你现在浏览的是第十七页，共68页能荷调节是通过能荷调节是通过ATP、ADP和和AMP分子对某些酶分子对某些酶分子进行变构调节来实现的。分子进行变构调节来实现的。Atkinson提出了能荷的概念。提出了能荷的概念。认为认为能荷能荷是细胞中高能磷酸状态的一种数量上的衡量，是细胞中高能磷酸状态的一种数量上的衡量，能荷大小可以说明生物体中能荷大小可以说明生物体中ATPADPAMP系统的系统的能量状态。能荷的大小决定于能量状态。能荷的大小决定于ATP和和ADP的多少。的多少。你现在浏览的是第十八页，共68页 能荷逐渐升高时，能荷逐渐升高时，即细胞内的能量水平逐渐升高，这即细胞内的能量水平逐渐升高，这一过程中一过程中AMP、ADP转变成转变成ATP。ATP的增加会的增加会抑制糖分解代谢，抑制糖分解代谢，抑制如柠檬酸合成抑制如柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶等酶的活性，并激活糖类合成的酶，酶、异柠檬酸脱氢酶等酶的活性，并激活糖类合成的酶，加速糖原的合成。加速糖原的合成。糖酵解糖酵解主要受三个酶调节：磷酸果糖激酶、己糖激酶、丙酮主要受三个酶调节：磷酸果糖激酶、己糖激酶、丙酮酸激酶，其中酸激酶，其中磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶是限速酶，己糖激酶控制酵解的入口，是限速酶，己糖激酶控制酵解的入口，丙酮酸激酶控制出口；丙酮酸激酶控制出口；三羧酸循环三羧酸循环的调控由三个酶调控，即的调控由三个酶调控，即柠檬柠檬酸合成酶酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶和和酮戊二酸脱氢酶酮戊二酸脱氢酶。两者都与能荷。两者都与能荷的控制调节相关。的控制调节相关。你现在浏览的是第十九页，共68页 当生物体内生物合成或其它需能反应加强时，细胞内当生物体内生物合成或其它需能反应加强时，细胞内ATP分解生成分解生成ADP或或AMP，ATP减少，减少，能荷降低能荷降低，就会，就会激激活活某些催化糖类分解的酶某些催化糖类分解的酶(糖原磷酸化酶、磷酸果糖激酶、糖原磷酸化酶、磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶等柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶等)或解除或解除ATP对这些酶的对这些酶的抑制，并抑制合成糖原的酶抑制，并抑制合成糖原的酶(NN合成酶、果糖合成酶、果糖1，6二磷二磷酸酯酶等酸酯酶等)，从而加速酵解、，从而加速酵解、TCA循环产生能量，通过氧化循环产生能量，通过氧化磷酸化作用生成磷酸化作用生成ATP。你现在浏览的是第二十页，共68页(2)生物素对糖代谢速率的调节生物素对糖代谢速率的调节 生物素对糖代谢的调生物素对糖代谢的调节与能荷的调节是不同的，节与能荷的调节是不同的，能荷是对糖代谢流的调节，能荷是对糖代谢流的调节，而而生物素能够促进糖的生物素能够促进糖的EMP、HMP途径、途径、TCA循循环。环。你现在浏览的是第二十一页，共68页 谷氨酸产生菌大多为谷氨酸产生菌大多为生物素缺陷型生物素缺陷型。许多研究表明，。许多研究表明，生物素对从糖开始到丙酮酸为止的糖降解途径的比例并没生物素对从糖开始到丙酮酸为止的糖降解途径的比例并没有显著的影响，主要作用是有显著的影响，主要作用是对糖降解速率的调节。对糖降解速率的调节。原因：原因：碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢中的碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢中的许多反应都需要生物素许多反应都需要生物素。生物素的主要功能生物素的主要功能是在脱羧是在脱羧羧化反应和脱氨反应中起羧化反应和脱氨反应中起辅酶辅酶作用，作用，并和碳水化合物与蛋白质的互变、碳水化合物以及蛋白质向脂肪的转并和碳水化合物与蛋白质的互变、碳水化合物以及蛋白质向脂肪的转化有关。化有关。在碳水化合物代谢中，生物素酶能催化脱羧和羧化反应。碳水化在碳水化合物代谢中，生物素酶能催化脱羧和羧化反应。碳水化合物代谢中依赖生物素的特异反应有：丙酮酸转化生成草酰乙酸；苹合物代谢中依赖生物素的特异反应有：丙酮酸转化生成草酰乙酸；苹果酸转化为丙酮酸；琥珀酸与丙酮酸的互变；草酰琥珀酸转化为果酸转化为丙酮酸；琥珀酸与丙酮酸的互变；草酰琥珀酸转化为酮酮戊二酸。戊二酸。你现在浏览的是第二十二页，共68页2三羧酸循环三羧酸循环(TCA循环循环)的调节的调节 谷氨酸产生菌在代谢途径中，三羧酸循环的调节主要谷氨酸产生菌在代谢途径中，三羧酸循环的调节主要是通过是通过5种酶的调节进行的。这五种酶是磷酸烯醇式丙酮种酶的调节进行的。这五种酶是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酸羧化酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶和酶和酮戊二酸脱氢酶。酮戊二酸脱氢酶。谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，谷氨谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，谷氨酸抑制谷氨酸脱氢酶的活力并阻遏柠檬酸合成酶的合成，使酸抑制谷氨酸脱氢酶的活力并阻遏柠檬酸合成酶的合成，使代谢转向天冬氨酸的合成。代谢转向天冬氨酸的合成。草酰乙酸草酰乙酸+谷氨酸谷氨酸谷氨酸转氨酶谷氨酸转氨酶天冬氨酸天冬氨酸+-酮戊二酸酮戊二酸你现在浏览的是第二十三页，共68页磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反馈抑制，受天冬氨酸的反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏。受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏。柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能是三羧酸循环的关键酶，除受能荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏和乌头酸的反荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏和乌头酸的反馈抑制。馈抑制。反馈抑制：是指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该反馈抑制：是指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的酶的活性调节，所引起的途径的酶的活性调节，所引起的抑制作用抑制作用。反馈抑制与反馈抑制与反馈阻遏反馈阻遏的区别在于：的区别在于：反馈阻遏是转录水平的调节反馈阻遏是转录水平的调节，产生效应慢，反馈抑，产生效应慢，反馈抑制是酶活性水平调节，产生效应快。此外，前者的作用往往会影响催化一系反应的多个制是酶活性水平调节，产生效应快。此外，前者的作用往往会影响催化一系反应的多个酶酶，而后者往往只对是一系列反应中的第一个酶起作用。而后者往往只对是一系列反应中的第一个酶起作用。你现在浏览的是第二十四页，共68页异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶活力强，而异柠檬酸裂解酶活力不能活力强，而异柠檬酸裂解酶活力不能太强，这就有利于谷氨酸前体物太强，这就有利于谷氨酸前体物酮戊二酸的生成，满酮戊二酸的生成，满足合成谷氨酸的需要。足合成谷氨酸的需要。异柠檬酸脱氢酶催化的异柠檬酸脱氢脱羧生成异柠檬酸脱氢酶催化的异柠檬酸脱氢脱羧生成酮酮戊二酸的反应和谷氨酸脱氢酶催化的戊二酸的反应和谷氨酸脱氢酶催化的酮戊二酸还原氨酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸的反应是一对氧化还原共轭反应，细胞基化生成谷氨酸的反应是一对氧化还原共轭反应，细胞内内酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡，当酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡，当酮戊二酸过量时，对异柠檬脱氢酶发生反馈抑制作用，酮戊二酸过量时，对异柠檬脱氢酶发生反馈抑制作用，停止合成停止合成酮戊二酸。酮戊二酸。你现在浏览的是第二十五页，共68页 在谷氨酸的生物合成中，谷氨酸脱氢酶和异柠檬酸脱在谷氨酸的生物合成中，谷氨酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶在铵离子存在下，两者非常密切地偶联起来，氢酶在铵离子存在下，两者非常密切地偶联起来，形成强形成强固的氧化还原共轭体系固的氧化还原共轭体系，不与，不与NADPH2的末端氧化系相的末端氧化系相连接，使连接，使酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸。酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸。沿着由柠檬酸至沿着由柠檬酸至酮戊二酸的氧化途径，谷氨酸产生菌酮戊二酸的氧化途径，谷氨酸产生菌有两种有两种NADP专性脱氢酶，即专性脱氢酶，即异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶和和L谷氨酸谷氨酸脱氢酶脱氢酶。你现在浏览的是第二十六页，共68页 由于由于谷氨酸产生菌谷氨酸产生菌的的谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶比其它微生物强比其它微生物强大大得多，所以由三羧酸循环所得的柠檬酸的氧化中得多，所以由三羧酸循环所得的柠檬酸的氧化中间物就不再往下氧化，而以谷氨酸的形式积累起来。间物就不再往下氧化，而以谷氨酸的形式积累起来。谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏。若铵离子进一步过剩供给时，发酵液偏酸性，阻遏。若铵离子进一步过剩供给时，发酵液偏酸性，pH在在5.56.5，谷氨酸会进一步生成，谷氨酸会进一步生成谷氨酰胺谷氨酰胺。你现在浏览的是第二十七页，共68页在谷氨酸产生菌中，在谷氨酸产生菌中，酮戊二酸脱氢酶酮戊二酸脱氢酶先天性先天性缺失或微弱缺失或微弱，对导向谷氨酸形成具有重要意义，对导向谷氨酸形成具有重要意义，这是谷氨酸产生菌糖代谢的一个这是谷氨酸产生菌糖代谢的一个重要特征重要特征。谷氨酸产生菌的谷氨酸产生菌的酮戊二酸氧化力微弱，尤其在生物酮戊二酸氧化力微弱，尤其在生物素缺乏的条件下，三羧酸循环到达素缺乏的条件下，三羧酸循环到达酮戊二酸时即受酮戊二酸时即受到阻挡，这有利于到阻挡，这有利于酮戊二酸的积累，然后生成谷氨酮戊二酸的积累，然后生成谷氨酸。酸。你现在浏览的是第二十八页，共68页 3乙醛酸循环乙醛酸循环(DCA循环循环)的调节的调节 乙乙醛醛酸循酸循环环中的关中的关键键酶酶是是异异柠柠檬酸裂解檬酸裂解酶酶和和苹果酸苹果酸酶酶。通通过过乙乙醛醛酸循酸循环环异异柠柠檬酸裂解檬酸裂解酶酶的催化作用使琥珀的催化作用使琥珀酸、延胡索酸和苹果酸的量得到酸、延胡索酸和苹果酸的量得到补补足，其反足，其反应应如下：如下：葡萄糖葡萄糖和和琥珀酸琥珀酸等等对对异异柠柠檬酸裂解檬酸裂解酶酶起着阻遏作用。起着阻遏作用。你现在浏览的是第二十九页，共68页 在在生物素亚适量生物素亚适量条件下，琥珀酸氧化力降低，积条件下，琥珀酸氧化力降低，积累的琥珀酸会累的琥珀酸会反馈抑制反馈抑制异柠檬酸裂解酶活性，并阻遏该异柠檬酸裂解酶活性，并阻遏该酶的生成，酶的生成，DCA循环基本处于封闭状态，异柠檬酸高效循环基本处于封闭状态，异柠檬酸高效率地转化为率地转化为酮戊二酸，酮戊二酸，再生成谷氨酸再生成谷氨酸。在在生物素充足生物素充足的条件下，异柠檬酸裂解酶活性增大，的条件下，异柠檬酸裂解酶活性增大，通过通过DCA循环提供能量，进行蛋白质的合成，不仅异柠循环提供能量，进行蛋白质的合成，不仅异柠檬酸转化生成谷氨酸的反应减弱使得谷氨酸减少，而且檬酸转化生成谷氨酸的反应减弱使得谷氨酸减少，而且生成的谷氨酸在转氨酶的催化作用下又转成其它氨基酸，生成的谷氨酸在转氨酶的催化作用下又转成其它氨基酸，也也不利于谷氨酸积累不利于谷氨酸积累。(1)以糖质为原料的谷氨酸发酵中生物素对以糖质为原料的谷氨酸发酵中生物素对DCA循环的影响循环的影响你现在浏览的是第三十页，共68页以醋酸为原料发酵谷氨酸时，以醋酸为原料发酵谷氨酸时，醋酸浓度要低醋酸浓度要低，高浓度，高浓度的醋酸易被完全氧化。的醋酸易被完全氧化。当菌体内的有机酸浓度当菌体内的有机酸浓度低低到一定程度，到一定程度，DCA循环循环启动启动，此时异柠檬酸裂解酶催化生成的乙醛酸与细胞内的草酰此时异柠檬酸裂解酶催化生成的乙醛酸与细胞内的草酰乙酸共同乙酸共同抑制抑制异柠檬酸异柠檬酸脱氢酶脱氢酶，TCA循环转为循环转为DCA循环，循环，不利于谷氨酸生成与积累；不利于谷氨酸生成与积累；当当DCA循环运转使得循环运转使得TCA循环包含的某些有机酸过剩循环包含的某些有机酸过剩时，异柠檬酸时，异柠檬酸裂解酶被抑制裂解酶被抑制，乙醛酸浓度下降，解除，乙醛酸浓度下降，解除对异柠檬酸脱氢酶的抑制，对异柠檬酸脱氢酶的抑制，TCA循环运转。循环运转。(2)以醋酸为原料的谷氨酸发酵对以醋酸为原料的谷氨酸发酵对DCA循环的影响循环的影响你现在浏览的是第三十一页，共68页 4CO2固定反应的调节固定反应的调节 COCO2 2固定反固定反应应主要通主要通过过以下途径完成：以下途径完成：C02的固定反应的作用：的固定反应的作用：补充草酰乙酸补充草酰乙酸；在谷氨酸合成过程中，在谷氨酸合成过程中，糖的分解代谢途径与糖的分解代谢途径与C02固定的适固定的适当比例当比例是提高谷氨酸对糖收率的是提高谷氨酸对糖收率的关键关键问题。问题。你现在浏览的是第三十二页，共68页5NH4+的调节的调节 谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶也能催化谷氨酸氧化也能催化谷氨酸氧化脱氨反应脱氨反应，脱氨过，脱氨过程以程以NAD+作为辅酶，该酶催化的反应虽然作为辅酶，该酶催化的反应虽然偏向偏向氨合成氨合成谷氨酸一边，但是脱氢过程产生的谷氨酸一边，但是脱氢过程产生的NADH被氧化成被氧化成NAD+，同时产生的，同时产生的NH3很容易被除去。很容易被除去。脱氨反应被脱氨反应被NH4+和和酮戊二酸所酮戊二酸所抑制抑制，这对于谷氨，这对于谷氨酸的酸的积累积累也起到了很好的作用。也起到了很好的作用。你现在浏览的是第三十三页，共68页 在谷氨酸发酵生产中，在谷氨酸发酵生产中，生物素缺陷型菌生物素缺陷型菌在在NH4+存在时，葡萄糖消耗速率快而且谷氨酸收率高；存在时，葡萄糖消耗速率快而且谷氨酸收率高；NH4+不存在时，葡萄糖消耗速率很慢，生成物是不存在时，葡萄糖消耗速率很慢，生成物是酮戊二酸、丙酮酸等物质，不产生谷氨酸。酮戊二酸、丙酮酸等物质，不产生谷氨酸。你现在浏览的是第三十四页，共68页四、细胞膜通透性的调节四、细胞膜通透性的调节 对谷氨酸发酵的重要性对谷氨酸发酵的重要性：当细胞膜转变为有利于谷氨当细胞膜转变为有利于谷氨酸向膜外渗透的方式，谷氨酸向膜外渗透的方式，谷氨酸才能不断地酸才能不断地排出细胞外排出细胞外，这样既有利于细胞内谷氨酸这样既有利于细胞内谷氨酸合成反应的优先性、连续合成反应的优先性、连续性性，也有利于谷氨酸在，也有利于谷氨酸在胞外胞外的积累的积累。你现在浏览的是第三十五页，共68页细胞膜是在细胞壁与细胞质之间的一层柔软而富有弹细胞膜是在细胞壁与细胞质之间的一层柔软而富有弹性的性的半渗透性膜半渗透性膜，磷脂双分子层磷脂双分子层为其基本结构，在为其基本结构，在双分子层中双分子层中镶嵌蛋白质镶嵌蛋白质。你现在浏览的是第三十六页，共68页一种是通过控制脂肪酸和甘油的合成，实现对磷脂合成一种是通过控制脂肪酸和甘油的合成，实现对磷脂合成的控制，使得细胞的控制，使得细胞不能形成完整的细胞膜不能形成完整的细胞膜；一种是通过一种是通过干扰细菌细胞壁的形成干扰细菌细胞壁的形成，使得细胞不能形成完，使得细胞不能形成完整的细胞壁，丧失了对细胞膜的保护作用。在膜内外渗透整的细胞壁，丧失了对细胞膜的保护作用。在膜内外渗透压差等因素影响下，压差等因素影响下，细胞膜物理性损伤，增大膜的通透细胞膜物理性损伤，增大膜的通透性性。根据细胞膜的结构特性，根据细胞膜的结构特性，控制细胞膜通控制细胞膜通透性的方法透性的方法主要有两种：主要有两种：你现在浏览的是第三十七页，共68页1控制细胞膜的形成控制细胞膜的形成 利用利用生物素缺陷型菌株生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时，进行谷氨酸发酵时，限制限制发发酵培养基中生物素的浓度。酵培养基中生物素的浓度。生物素参与了脂肪酸的生物合成，进而影响了磷生物素参与了脂肪酸的生物合成，进而影响了磷脂的合成和细胞膜的形成。脂的合成和细胞膜的形成。生物素是催化脂肪酸合成起始反应的关键酶生物素是催化脂肪酸合成起始反应的关键酶乙酰乙酰CoA羧化酶的辅酶羧化酶的辅酶，对脂肪酸的形成起促进作用。选育，对脂肪酸的形成起促进作用。选育生物素缺陷型菌株，阻断生物素合成，亚适量控制生物素生物素缺陷型菌株，阻断生物素合成，亚适量控制生物素添加，添加，抑制不饱和脂肪酸的合成抑制不饱和脂肪酸的合成，使得，使得细胞膜不完整细胞膜不完整，提高了细胞膜对谷氨酸的通透性。提高了细胞膜对谷氨酸的通透性。你现在浏览的是第三十八页，共68页利用利用生物素过量的糖蜜原料生物素过量的糖蜜原料进行谷氨酸发酵时，进行谷氨酸发酵时，添加添加表面活性剂或饱和脂肪酸。表面活性剂或饱和脂肪酸。在生物素过量的条件下，添加表面活性剂或饱和脂肪在生物素过量的条件下，添加表面活性剂或饱和脂肪酸仍能进行谷氨酸发酵，其原因在于酸仍能进行谷氨酸发酵，其原因在于这些物质对生物素起这些物质对生物素起拮抗作用拮抗作用，抑制不饱和脂肪酸的合成，导致油酸合成，抑制不饱和脂肪酸的合成，导致油酸合成量减少，磷脂合成不足，使得量减少，磷脂合成不足，使得细胞膜不完整细胞膜不完整，提高了，提高了细胞膜对谷氨酸的通透性。常用的表面活性剂有吐温细胞膜对谷氨酸的通透性。常用的表面活性剂有吐温60、吐温、吐温40等。常用的饱和脂肪酸有十七烷酸、硬等。常用的饱和脂肪酸有十七烷酸、硬脂酸等。脂酸等。你现在浏览的是第三十九页，共68页利用利用油酸缺陷型菌株油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，进行谷氨酸发酵，限制限制发酵培养基油发酵培养基油酸的浓度。酸的浓度。油酸缺陷型菌株丧失了自身合成油酸的能力，直接影响磷油酸缺陷型菌株丧失了自身合成油酸的能力，直接影响磷脂的合成，脂的合成，不能形成完整细胞膜不能形成完整细胞膜，必须添加油酸才能生长，必须添加油酸才能生长，所以通过控制油酸的添加量，实现细胞膜对谷氨酸的通透所以通过控制油酸的添加量，实现细胞膜对谷氨酸的通透性。性。当当油酸过量油酸过量时，该菌株只长菌或产酸少；当时，该菌株只长菌或产酸少；当油酸亚适量油酸亚适量时，随着油酸的耗尽，细胞膜结构与功能发生变化，使得谷氨时，随着油酸的耗尽，细胞膜结构与功能发生变化，使得谷氨酸的通透性提高。酸的通透性提高。一种脂肪酸。一种脂肪酸。分子式分子式C18H34O2 你现在浏览的是第四十页，共68页甘油缺陷型菌株不能自身合成甘油缺陷型菌株不能自身合成磷酸甘油和磷脂，外界供给甘油才磷酸甘油和磷脂，外界供给甘油才能使其生长，因此可以通过控制甘能使其生长，因此可以通过控制甘油添加量来控制细胞膜对谷氨酸的油添加量来控制细胞膜对谷氨酸的通透性。通透性。当甘油添加量当甘油添加量过多过多时，磷脂正常时，磷脂正常合成，菌体正常生长，不产酸或产酸合成，菌体正常生长，不产酸或产酸低；低；当甘油添加量当甘油添加量过少过少时，菌体生时，菌体生长不好，产酸低，所以控制甘油亚长不好，产酸低，所以控制甘油亚适量是控制的关键。适量是控制的关键。利用利用甘油缺陷型菌株甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，进行谷氨酸发酵，限制限制发酵培养基甘油的浓度。发酵培养基甘油的浓度。你现在浏览的是第四十一页，共68页 2控制细胞壁的形成控制细胞壁的形成细胞壁的骨架结构细胞壁的骨架结构是肽聚糖。是肽聚糖。对细胞壁形成的控对细胞壁形成的控制方法：添加青霉制方法：添加青霉素、头孢霉素素、头孢霉素C等等内酰胺类抗生素。内酰胺类抗生素。双糖单位：双糖单位：N乙酰胞壁酸（乙酰胞壁酸（NAM）和）和N乙乙酰葡萄糖胺（酰葡萄糖胺（NAG）你现在浏览的是第四十二页，共68页青霉素是糖肽末端结构青霉素是糖肽末端结构(DAlaDAla)的的类似物类似物，与转，与转肽酶的活性中心结合，使转肽酶受到了不可逆的抑制，糖肽肽酶的活性中心结合，使转肽酶受到了不可逆的抑制，糖肽合成不能完成，结果形成不完整的细胞壁，使细胞膜处于无合成不能完成，结果形成不完整的细胞壁，使细胞膜处于无保护状态，易于破损，增大谷氨酸的通透性。保护状态，易于破损，增大谷氨酸的通透性。转肽酶功能：在蛋白质生物合成过程中肽键的形成具有必须的作用。转转肽酶功能：在蛋白质生物合成过程中肽键的形成具有必须的作用。转肽酶识别特异多肽肽酶识别特异多肽,催化不同的转肽反应。催化不同的转肽反应。青霉素控制细胞壁形成的原因：青霉素控制细胞壁形成的原因：你现在浏览的是第四十三页，共68页第二节第二节 谷氨酸产生菌的选育谷氨酸产生菌的选育主要是棒杆菌属、短杆菌属、小杆菌属和节杆菌属主要是棒杆菌属、短杆菌属、小杆菌属和节杆菌属中的细菌。中的细菌。目前，我国企业使用的谷氨酸产生菌主要有：目前，我国企业使用的谷氨酸产生菌主要有：北京棒杆菌北京棒杆菌AS 1299；钝齿棒杆菌钝齿棒杆菌AS 1542；天津短杆菌天津短杆菌T613；它们的各种突变株。它们的各种突变株。你现在浏览的是第四十四页，共68页你现在浏览的是第四十五页，共68页你现在浏览的是第四十六页，共68页黄色短杆菌黄色短杆菌北京棒杆菌北京棒杆菌杆状细菌你现在浏览的是第四十七页，共68页 谷氨酸菌体的选育方法主要有五种，谷氨酸菌体的选育方法主要有五种，自然选育、自然选育、诱变选育、杂交选育、代谢控制选育和基因工程选育。诱变选育、杂交选育、代谢控制选育和基因工程选育。你现在浏览的是第四十八页，共68页一、自然选育一、自然选育以以基因自发突变基因自发突变为基础。为基础。有利于谷氨酸产生菌保持纯系良种有利于谷氨酸产生菌保持纯系良种，使谷氨酸生产，使谷氨酸生产具有相对稳定性，提高发酵水平。具有相对稳定性，提高发酵水平。缺点：缺点：菌体自身存在着修复机制和某些酶的校正作用，菌体自身存在着修复机制和某些酶的校正作用，使得自发突变率极低，导致选育耗时长、工作量大、效使得自发突变率极低，导致选育耗时长、工作量大、效率低。率低。也称自然分离，是指对微生物细胞群体不经过人工也称自然分离，是指对微生物细胞群体不经过人工处理而直接进行筛选的育种方法。处理而直接进行筛选的育种方法。你现在浏览的是第四十九页，共68页二、诱变选育二、诱变选育 物理因素物理因素：紫外线、：紫外线、60Co、X射线、射线、射线、快中子、射线、快中子、射线、射线、射线、超声波、射线、超声波、HeNe激光辐照、离子束等。激光辐照、离子束等。化学因素：化学因素：氮芥、亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸氮芥、亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基甲基脲、亚硝酸、乙酯、亚硝基甲基脲、亚硝酸、5氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、5溴尿溴尿嘧啶等。嘧啶等。其它因素其它因素：生物诱导因子，如噬菌体诱发抗性突变：生物诱导因子，如噬菌体诱发抗性突变等。等。你现在浏览的是第五十页，共68页例：例：王岁楼；张一震；李志。谷氨酸高产菌王岁楼；张一震；李志。谷氨酸高产菌TZ-310TZ-310的诱变选育的诱变选育及其发酵的研究及其发酵的研究。中国调味品中国调味品，19971997年年 09 09期期。摘要：以天津短杆菌摘要：以天津短杆菌-为出发菌株，经为出发菌株，经射线射线、紫外线紫外线和和硫酸二乙酯硫酸二乙酯复合诱变并经高温驯化，复合诱变并经高温驯化，获得一株琥珀酸和生物素双营养缺陷型突变株。该菌获得一株琥珀酸和生物素双营养缺陷型突变株。该菌株具有耐高糖、耐高谷氨酸（）、不分解利用株具有耐高糖、耐高谷氨酸（）、不分解利用及耐高温（及耐高温（）的优点。）的优点。你现在浏览的是第五十一页，共68页原生质体融合原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，制得原生质体或原生质球，在高渗条件下混合，由以剥除，制得原生质体或原生质球，在高渗条件下混合，由聚乙二醇聚乙二醇(PEG)助融，促使原生质体凝集、融合，两个基因组助融，促使原生质体凝集、融合，两个基因组之间接触、交换、遗传重组，在再生细胞中获得重组体。之间接触、交换、遗传重组，在再生细胞中获得重组体。三、杂交育种三、杂交育种杂交育种杂交育种常规杂交常规杂交原生质体融合原生质体融合你现在浏览的是第五十二页，共68页谷氨酸产生菌的前处理谷氨酸产生菌的前处理因为其有着特殊的细胞壁结构，对溶菌酶一般不敏感。因为其有着特殊的细胞壁结构，对溶菌酶一般不敏感。方法：加入方法：加入EDTA（乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸）、甘氨酸、青霉素和）、甘氨酸、青霉素和D环丝氨酸等，这些物质可以使细胞壁变得疏松，环丝氨酸等，这些物质可以使细胞壁变得疏松，便于溶菌酶处理。便于溶菌酶处理。如，李蒲兴等将如，李蒲兴等将6株谷氨酸产生菌以甘氨酸株谷氨酸产生菌以甘氨酸、青霉素和溶菌酶的、青霉素和溶菌酶的不同组合处理不同组合处理，对其，对其原生质体形成进行比较，在最佳条件下，原生质体形成进行比较，在最佳条件下，原生质体原生质体形成率形成率可达可达95100。你现在浏览的是第五十三页，共68页 张蓓等以谷氨酸产生菌天津短杆菌张蓓等以谷氨酸产生菌天津短杆菌T613为出发菌株，获得了具有目的遗传为出发菌株，获得了具有目的遗传标记寡霉素抗性标记寡霉素抗性(Orm)和氟乙酸抗性和氟乙酸抗性(FEAr)的突变株的突变株TN63和和TN115。然后，分。然后，分别以别以TN63和和TN115为亲株，通过原生质为亲株，通过原生质体融合，获得了具有体融合，获得了具有Orm+FEAr标记的融标记的融合子合子FTN9108，其原生质体融合频率为，其原生质体融合频率为2.6103。OrmFEAr+OrmFEArOrmFEAr你现在浏览的是第五十四页，共68页四、代谢控制选育四、代谢控制选育 以诱变育种为基础，获得各以诱变育种为基础，获得各种解除或绕过微生物正常代种解除或绕过微生物正常代谢途径的突变株，从而人为谢途径的突变株，从而人为地使有用产物选择性地大量地使有用产物选择性地大量生成积累。生成积累。Glu产生菌产生菌诱变育种诱变育种突变株突变株代谢控制发酵代谢控制发酵大量积累大量积累Glu你现在浏览的是第五十五页，共68页你现在浏览的是第五十六页，共68页1.选育耐高糖、高谷氨酸的菌株选育耐高糖、高谷氨酸的菌株 如选育在含如选育在含2030葡萄糖的平板上生长良好的耐葡萄糖的平板上生长良好的耐高糖突变株；高糖突变株；在含在含15 20味精的平板上生长良好的耐高谷氨酸味精的平板上生长良好的耐高谷氨酸突变株；突变株；在在20的葡萄糖加的葡萄糖加15味精的平板上生长良好的耐高糖、味精的平板上生长良好的耐高糖、耐高谷氨酸的菌株。耐高谷氨酸的菌株。你现在浏览的是第五十七页，共68页2.选育能强化谷氨酸合成代谢、削弱或阻断选育能强化谷氨酸合成代谢、削弱或阻断支路代谢的菌株支路代谢的菌株（1）选育不分解利用）选育不分解利用谷氨酸的突变株谷氨酸的突变株 选育在以选育在以谷氨酸为唯谷氨酸为唯一碳源一碳源培养基上不培养基上不长或生长微弱的突长或生长微弱的突变株变株。谷氨酸谷氨酸谷氨酰胺鸟氨酸瓜氨酸精氨酸你现在浏览的是第五十八页，共68页（2）选育强化）选育强化CO2固定反应的突变株固定反应的突变株 a.选育选育以琥珀酸或苹果酸为唯一碳源，生长良好以琥珀酸或苹果酸为唯一碳源，生长良好的菌株。的菌株。因为细胞内碳代谢必须走四碳二羧酸的脱羧反应，因为细胞内碳代谢必须走四碳二羧酸的脱羧反应，该反应与该反应与C02固定反应是相同酶所催化，固定反应是相同酶所催化，C02固定反固定反应相应地加强。应相应地加强。你现在浏览的是第五十九页，共68页b.选育选育氟丙酮酸敏感氟丙酮酸敏感突变株。突变株。因为氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂，即抑制丙酮酸因为氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂，即抑制丙酮酸向乙酰向乙酰CoA转化，相应地转化，相应地CO2固定反应加强。突变株固定反应加强。突变株对氟丙酮酸越敏感，效果越理想。对氟丙酮酸越敏感，效果越理想。c.选育选育减弱乙醛酸循环减弱乙醛酸循环的突变株。的突变株。乙醛酸循环减弱不仅能使乙醛酸循环减弱不仅能使C02固定反应比例增大，而固定反应比例增大，而且异柠檬酸也能高效率地转化为且异柠檬酸也能高效率地转化为酮戊二酸，再生成酮戊二酸，再生成谷氨酸。常见的该突变株有琥珀酸敏感型突变株和不谷氨酸。常见的该突变株有琥珀酸敏感型突变株和不分解利用乙酸的突变株。分解利用乙酸的突变株。你现在浏览的是第六十页，共68页（3）选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变）选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株株 有酮基丙二酸抗性突变株、谷氨酸结构类似物抗性突有酮基丙二酸抗性突变株、谷氨酸结构类似物抗性突变株和谷氨酰胺抗性突变株。变株和谷氨酰胺抗性突变株。草酰乙酸草酰乙酸谷氨酸转氨酶谷氨酸转氨酶天冬氨酸天冬氨酸+-酮戊二酸酮戊二酸谷氨酸谷氨酸-酮戊二酸酮戊二酸NH3谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶你现在浏览的是第六十一页，共68页（4）选育强化能量代谢的突变株）选育强化能量代谢的突变株 原因：使原因：使TCA循环前一段代谢加强，谷