实验二纸层析,柱色谱.ppt

实验二纸层析，柱色谱一、纸层析一、纸层析 实验目的：实验目的：掌握纸层析的原理和基本操作。分离原理 色谱法色谱法就是利用混合物中各组分在固就是利用混合物中各组分在固定相和移动相中进行反复的吸附或分定相和移动相中进行反复的吸附或分配作用，达到各组分分开的目的。配作用，达到各组分分开的目的。色谱分析法简称色谱分析法简称色谱法色谱法或或层法层法。分 类n按照被分离物质在固定相中的作用原按照被分离物质在固定相中的作用原理不同，色谱法可分为理不同，色谱法可分为吸附色谱、分吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱配色谱、离子交换色谱等。等。n按照操作方式不同，又可分为按照操作方式不同，又可分为柱色谱、柱色谱、薄层色谱、纸色谱、气相色谱、薄层色谱、纸色谱、气相色谱、和和高高效液相色谱效液相色谱等。等。氨基酸混合物的分离氨基酸混合物的分离 利用待分离的混合物中各组分在固定相中的溶解性的不同，使各组分的迁移速度不同固定相为滤纸上的水，流动相为用水饱和的苯酚溶液当苯酚沿滤纸流动，待分离的氨基酸在固定相和流动相中不断进行分配迁移，由于各组分的迁移速率不同而获得分离纸色谱属于分配色谱。衡量物质向上移动的物理量是比移值（Rf）例例:混合氨基酸的纸色谱图混合氨基酸的纸色谱图溶剂前沿蛋氨酸丙氨酸谷氨酸点样点La实验步骤 1在滤纸条上端边缘约1厘米的中央剪一小孔。2将滤纸条平放于洁净的纸上，在距离滤纸下端1cm处用铅笔轻画一横线，并在横线的中央画一直径为2mm的小圆圈。3用毛细管吸取氨基酸混合液，在滤纸条下端的小圆圈内点样。实验步骤 4.取干燥大试管，加入被水饱和的酚溶液10ml，注意勿使溶液沾到试管壁上，将试管垂直固定。5.在距滤纸条下端0.5cm处穿大头针。从滤纸条上端小孔处穿棉线并左右分开，调节线的高度使滤纸垂直悬于试管内且下湍浸入溶液0.5cm，注意勿使点样点浸入溶液中，亦勿使滤纸条接触试管壁。实验步骤 6.此时即可看到溶剂向上移动，溶剂升到一定高度时，小心将纸条取出，以铅笔标出溶剂上升的前沿。7.将滤纸条两端，用大头针钉在小木框上，吹干后用喷雾器均匀地喷一层0.2%茚三酮乙醇溶液，然后再将滤纸条吹干，即可看到纸上显出三色点，每个色点代表一种氨基酸。实验步骤 8.分别测量并计算三种氨基酸的Rf，再根据教师供给的值确定此三个色点各为何种氨基酸。9.留在试管内的酚溶剂切勿弃去，塞紧塞子。Rf参考值n谷氨酸0.32n丙氨酸0.62n蛋氨酸0.84 二、柱层析柱层析 将固定相装于柱管内构成层析柱，将固定相装于柱管内构成层析柱，层析过程在层析柱内进行。按层析柱的层析过程在层析柱内进行。按层析柱的粗细差别，可分为填充柱层析法、毛细粗细差别，可分为填充柱层析法、毛细管柱层析法及微填充柱层析法等。管柱层析法及微填充柱层析法等。一、实验目的一、实验目的1.掌握柱层析的原理和基本操作。掌握柱层析的原理和基本操作。2.利用柱层析的方法分离和提纯有机物。利用柱层析的方法分离和提纯有机物。二、实验原理二、实验原理 柱色谱是利用混合物中各组分受吸柱色谱是利用混合物中各组分受吸附作用的不同以及各组分在溶剂中溶解附作用的不同以及各组分在溶剂中溶解度的差别，将各组分分离。可分为度的差别，将各组分分离。可分为吸附吸附柱层析柱层析和和分配柱层析分配柱层析。吸附柱层析吸附柱层析 预分离的混合物随着流动相通过色谱柱，预分离的混合物随着流动相通过色谱柱，在固定相上反复发生在固定相上反复发生吸附洗脱再吸附吸附洗脱再吸附再洗脱再洗脱。由于各组分吸附能力不同，经过一。由于各组分吸附能力不同，经过一段时间，按对吸附剂亲和力大小，形成不同段时间，按对吸附剂亲和力大小，形成不同色带而分离。色带而分离。影响吸附柱层析的因素影响吸附柱层析的因素n吸附剂吸附剂 柱色谱常用的吸附剂是氧化铝和硅胶。吸附剂应进行柱色谱常用的吸附剂是氧化铝和硅胶。吸附剂应进行纯化和活化处理，含水量越低，活性越高。纯化和活化处理，含水量越低，活性越高。n化合物的极性和吸附能力化合物的极性和吸附能力 化合物的吸附性与分子极性成正比。分子极性越强，化合物的吸附性与分子极性成正比。分子极性越强，吸附能力越大。吸附能力越大。n洗脱剂洗脱剂 先用极性小的溶剂洗脱，后改用极性强的溶剂洗脱。先用极性小的溶剂洗脱，后改用极性强的溶剂洗脱。使化合物按极性与小到大顺序出柱。使化合物按极性与小到大顺序出柱。四、实验步骤四、实验步骤 1、装柱、装柱 取清洁干燥的色谱柱，管底垫少许棉花，防止取清洁干燥的色谱柱，管底垫少许棉花，防止氧化铝漏下。倾入无水乙醇氧化铝漏下。倾入无水乙醇20ml，称取，称取15g柱用氧柱用氧化铝，经漏斗化铝，经漏斗缓慢缓慢倒入管中，同时轻轻拍打色谱柱，倒入管中，同时轻轻拍打色谱柱，用无水乙醇清洗沾在管内壁上的氧化铝。打开活塞，用无水乙醇清洗沾在管内壁上的氧化铝。打开活塞，氧化铝随着溶剂流动继续下沉，直至沉降停止。在氧化铝随着溶剂流动继续下沉，直至沉降停止。在氧化铝表面平整紧贴地覆盖一张略小于色谱柱内径氧化铝表面平整紧贴地覆盖一张略小于色谱柱内径的滤纸，打开活塞使氧化铝表面仅留一薄层约的滤纸，打开活塞使氧化铝表面仅留一薄层约1mm的溶剂。的溶剂。2、加样加样 在色谱柱表面小心加入亚甲基兰和甲在色谱柱表面小心加入亚甲基兰和甲基橙的混合溶液基橙的混合溶液5-8滴滴（注意勿使样品沾（注意勿使样品沾在色谱柱的内壁上）。在色谱柱的内壁上）。3、洗脱洗脱 打开活塞，使样品液全部进入吸附剂打开活塞，使样品液全部进入吸附剂（勿使流（勿使流干）干）。加入无水乙醇，打开活塞使蓝色谱带完全进。加入无水乙醇，打开活塞使蓝色谱带完全进入吸附剂，关闭活塞；重复二次，蓝色谱带逐渐下入吸附剂，关闭活塞；重复二次，蓝色谱带逐渐下移。继续加无水乙醇，使亚甲基蓝完全洗脱，收集移。继续加无水乙醇，使亚甲基蓝完全洗脱，收集于第于第1个三角锥瓶。改用个三角锥瓶。改用2.5%NaOH溶液作洗脱剂溶液作洗脱剂（操作步骤与以无水乙醇作洗脱剂相同），使甲基（操作步骤与以无水乙醇作洗脱剂相同），使甲基橙完全洗脱，收集于第橙完全洗脱，收集于第2个三角锥瓶。滴加盐酸溶液个三角锥瓶。滴加盐酸溶液可发现变红。可发现变红。注意事项注意事项 1.加加入入氧氧化化铝铝时时动动作作要要缓缓慢慢，使使之之均均匀匀加加入入，以以防防在在柱柱中中间间流流下下气气泡泡。若若已已有有气气泡则拍打层析柱。泡则拍打层析柱。2.氧化铝平面上要保持一定液面。氧化铝平面上要保持一定液面。3.收收集集到到亚亚甲甲基基兰兰之之前前收收集集的的乙乙醇醇可可反反复复使用。使用。