动物繁殖新技术讲座.ppt

动物胚胎移植技术动物胚胎移植技术郑州牧业工程高等专科学校郑州牧业工程高等专科学校 主讲人：张长兴主讲人：张长兴 动物繁殖新技术系列讲座目录目录l第一节第一节 胚胎工程概述胚胎工程概述l第二节第二节 胚胎移植的原理胚胎移植的原理l第三节第三节 胚胎移植的技术程序胚胎移植的技术程序l第四节第四节 牛的胚胎移植牛的胚胎移植动物繁殖新技术系列讲座第一节 胚胎移植概述1.胚胎移植的历史胚胎移植的历史2.胚胎移植技术的应用胚胎移植技术的应用3.胚胎移植的成本胚胎移植的成本4.胚胎移植的经济效益胚胎移植的经济效益动物胚胎移植技术动物胚胎移植技术1.胚胎移植的历史胚胎移植的历史胚胎移植概述胚胎移植概述l1.1初始阶段：初始阶段：1890-1900 W.Heape将安将安哥拉兔和荷兰兔的受精卵分别移植到比哥拉兔和荷兰兔的受精卵分别移植到比利时兔的输卵管内，分别获得仔兔利时兔的输卵管内，分别获得仔兔2只。只。胚胎移植的历史胚胎移植的历史l1.2初级阶段：初级阶段：1900-1950 主要由英美科学主要由英美科学家在家兔、绵羊、山羊小家畜方面研究，家在家兔、绵羊、山羊小家畜方面研究，成功率成功率35%左右。左右。胚胎移植的历史胚胎移植的历史l1.3发展阶段：发展阶段：1950-1970 日本首次在牛日本首次在牛胚胎移植上成功，之后日、美采用非手胚胎移植上成功，之后日、美采用非手术法移植成功。胚胎移植成功率达术法移植成功。胚胎移植成功率达70-80%胚胎移植的历史胚胎移植的历史l1.4实用化初始阶段：实用化初始阶段：1970-1980 加美开加美开始成立牛胚胎移植公司，始成立牛胚胎移植公司，1973年牛冻胚年牛冻胚移植成功（英）移植成功（英）胚胎移植的历史胚胎移植的历史l1.5实用化研究阶段：实用化研究阶段：1982-大规模胚胎移植、大规模胚胎移植、核移植、嵌合体、胚胎分割、性别鉴定、体外核移植、嵌合体、胚胎分割、性别鉴定、体外受精在英美日德广泛开展。克隆羊诞生。受精在英美日德广泛开展。克隆羊诞生。胚胎移植的历史胚胎移植的历史2.胚胎移植的应用范围胚胎移植的应用范围l在家畜改良方面的应用在家畜改良方面的应用l在特定品种扩繁上的应用在特定品种扩繁上的应用l在动物生物多样性上的应用在动物生物多样性上的应用l其它方面应用：转基因动物、性别控制、体外其它方面应用：转基因动物、性别控制、体外受精受精胚胎移植概述胚胎移植概述2.1在家畜改良方面的应用在家畜改良方面的应用l人工授精技术可成几十到几百倍地提高了优秀人工授精技术可成几十到几百倍地提高了优秀种公畜的配种效能。但对优秀母畜来说，受其种公畜的配种效能。但对优秀母畜来说，受其产仔数和世代间隔的限制，尤其是牛羊等繁殖产仔数和世代间隔的限制，尤其是牛羊等繁殖力较低的畜种更是如此。力较低的畜种更是如此。l通过超数排卵和胚胎移植技术（通过超数排卵和胚胎移植技术（multiple ovulation and embryo transfer:MOET)牛羊牛羊的生长性状年遗传进展可比正常繁殖提高的生长性状年遗传进展可比正常繁殖提高80%和和70%；产奶性状提高；产奶性状提高33%。胚胎移植的应用范围胚胎移植的应用范围2.2在特定品种扩繁上的应用在特定品种扩繁上的应用l牛羊等低繁殖力家畜，从引进到形成一个纯种牛羊等低繁殖力家畜，从引进到形成一个纯种群体需要群体需要7-8个世代，个世代，15-20年。而采用年。而采用MEOT法，一次就可获得一个纯种群体法，一次就可获得一个纯种群体l80年代初，美、澳、新从欧洲引进的大型肉牛年代初，美、澳、新从欧洲引进的大型肉牛品种均采用胚胎移植技术扩繁品种均采用胚胎移植技术扩繁l2000年前后，我国的波尔山羊也是采用胚胎移年前后，我国的波尔山羊也是采用胚胎移植进行扩繁的植进行扩繁的胚胎移植的应用范围胚胎移植的应用范围2.3在动物生物多样性上的应用在动物生物多样性上的应用l在保护动物遗传资源，提高家畜生产性能，挽在保护动物遗传资源，提高家畜生产性能，挽救濒临灭绝的野生动物方面，胚胎移植技术越救濒临灭绝的野生动物方面，胚胎移植技术越越来发挥出重要作用。越来发挥出重要作用。l冷冻能够很好地保存濒临灭绝动物的胚胎或生冷冻能够很好地保存濒临灭绝动物的胚胎或生殖细胞，但该种动物雌性个体的减少，也是这殖细胞，但该种动物雌性个体的减少，也是这种动物的胚胎或生殖细胞无法得到移植，科学种动物的胚胎或生殖细胞无法得到移植，科学家开始研究在该种动物的亚种或亲缘种中试验，家开始研究在该种动物的亚种或亲缘种中试验，并取得一些成功。如斑马胚胎移植给马，蒙古并取得一些成功。如斑马胚胎移植给马，蒙古马胚胎移植给驴，白肢野牛移植给荷斯坦牛。马胚胎移植给驴，白肢野牛移植给荷斯坦牛。胚胎移植的应用范围胚胎移植的应用范围2.4其它方面应用其它方面应用l胚胎移植是克隆技术的必须过程胚胎移植是克隆技术的必须过程l体外受精必须借助胚胎移植实现体外受精必须借助胚胎移植实现“试管婴儿的试管婴儿的继续发育继续发育l转基因及动物生物反应器的研究也必须借助胚转基因及动物生物反应器的研究也必须借助胚胎移植胎移植胚胎移植的应用范围胚胎移植的应用范围3.胚胎移植的成本l种母畜购入或培育成本及饲养费，胚胎成本种母畜购入或培育成本及饲养费，胚胎成本分摊分摊l配种费配种费l激素：激素：FSH、LH、PGl手术费：手术药品及耗材、手术辅助人员报手术费：手术药品及耗材、手术辅助人员报酬等酬等l技术费：技术人员约定报酬技术费：技术人员约定报酬l其它：实验室配置、差旅费、招待费其它：实验室配置、差旅费、招待费胚胎移植概述胚胎移植概述4.胚胎移植的经济效益 胚胎移植是一个技术过程复杂，各个环节环环胚胎移植是一个技术过程复杂，各个环节环环相扣，任何一个不能出现失误的系统工程。相扣，任何一个不能出现失误的系统工程。影响胚胎移植成功率的因素很多，同时，其运影响胚胎移植成功率的因素很多，同时，其运作成本较高。这使其应用中存在经济效益上的高风作成本较高。这使其应用中存在经济效益上的高风险性。险性。如果不是基于急需扩群、供体高经济价值、育如果不是基于急需扩群、供体高经济价值、育种目的，一般尽量采用自然繁殖。在特殊情况下，种目的，一般尽量采用自然繁殖。在特殊情况下，如供种初始阶段，少量优秀个体的扩增，胚胎移植如供种初始阶段，少量优秀个体的扩增，胚胎移植可创造较好的经济效益。可创造较好的经济效益。胚胎移植概述胚胎移植概述第二节第二节 胚胎移植的生理基础及原则胚胎移植的生理基础及原则l1.胚胎移植的生理学基础胚胎移植的生理学基础l2.胚胎移植的基本原则胚胎移植的基本原则动物胚胎移植技术动物胚胎移植技术1.胚胎移植的生理学基础l成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在外源激素作用下，每个发情期的卵泡发育和外源激素作用下，每个发情期的卵泡发育和排卵数可达十数个排卵数可达十数个l每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育l早期胚胎处于游离状态早期胚胎处于游离状态l胚胎发育不存在免疫问题胚胎发育不存在免疫问题l胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组联系联系l胚胎的遗传性不受受体的影响胚胎的遗传性不受受体的影响 胚胎移植的生理基础及原则胚胎移植的生理基础及原则2.胚胎移植的基本原则l胚胎移植前后所处的环境的同一性胚胎移植前后所处的环境的同一性供体和受体在分类学上的相同属性供体和受体在分类学上的相同属性动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间上的同期性上的同期性动物解剖位置上的一致性：空间环境的一致性动物解剖位置上的一致性：空间环境的一致性l胚胎的发育期限：必须处于周期黄体期内胚胎的发育期限：必须处于周期黄体期内l胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程中不受不良因素的影响中不受不良因素的影响至目录 胚胎移植的生理基础及原则胚胎移植的生理基础及原则第三节第三节 胚胎移植的技术程序胚胎移植的技术程序l1.供体和受体的选择供体和受体的选择l2.超数排卵处理超数排卵处理l3.供体母畜的配种供体母畜的配种l4.胚胎的收集胚胎的收集l5.胚胎的检查胚胎的检查l6.胚胎的保存与培养胚胎的保存与培养l7.胚胎的移植胚胎的移植l8.供体和受体的术后观察供体和受体的术后观察动物胚胎移植技术动物胚胎移植技术1.供体和受体的选择供体和受体的选择l供体应具有相当高的育种价值供体应具有相当高的育种价值l供体生殖机能应处于较高的状态：产后供体生殖机能应处于较高的状态：产后60天以上，天以上，无生殖系统疾病，体质强健无生殖系统疾病，体质强健l受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适应性强，受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适应性强，体型中上等，非优良品种体型中上等，非优良品种l受体健康状况良好，已进入发情季节受体健康状况良好，已进入发情季节l供受体发情时间应接近或一致供受体发情时间应接近或一致胚胎移植的技术程序胚胎移植的技术程序2.超数排卵处理超数排卵处理l意义：让每个供体提供更多的胚胎意义：让每个供体提供更多的胚胎l处理时间：处理时间：牛：预计自然发情时间的前牛：预计自然发情时间的前4天，或发情天，或发情周期的第周期的第16-17天天羊：发情周期的第羊：发情周期的第12-15天，促性腺激素天，促性腺激素处理的第二天或第三天，注射处理的第二天或第三天，注射PG胚胎移植的技术程序胚胎移植的技术程序3.供体母畜的配种供体母畜的配种l必须用优秀的种公畜进行多次配种，一般隔必须用优秀的种公畜进行多次配种，一般隔8-12小时进行一次配种，直到发情结束小时进行一次配种，直到发情结束l配种前应对种公畜的精液进行质量检查配种前应对种公畜的精液进行质量检查l可优秀种公畜不足时，可考虑首次采用本交，可优秀种公畜不足时，可考虑首次采用本交，以后采用人工授精，也可以全部采用人工授以后采用人工授精，也可以全部采用人工授精精胚胎移植的技术程序胚胎移植的技术程序4.胚胎的收集胚胎的收集l胚胎冲洗液的配制：杜氏磷酸缓冲液胚胎冲洗液的配制：杜氏磷酸缓冲液PBS，布布林斯特液林斯特液SOF合成输卵管液合成输卵管液l手术法收集胚胎手术法收集胚胎输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚子宫角冲胚子宫角冲胚l非手术法收集胚胎非手术法收集胚胎二路法二路法三路法三路法胚胎移植的技术程序胚胎移植的技术程序l收集到的冲洗液静置，冲洗液分离收集到的冲洗液静置，冲洗液分离l拣胚：将胚胎移至培养液或保存液中拣胚：将胚胎移至培养液或保存液中l胚胎鉴定：根据透明带、胚胎细胞、发胚胎鉴定：根据透明带、胚胎细胞、发育阶段及细胞在透明带中的比例确定胚育阶段及细胞在透明带中的比例确定胚胎级别胎级别胚胎移植的技术程序胚胎移植的技术程序5.胚胎的检查胚胎的检查l胚胎的降温：使胚胎停止发育，延长其胚胎的降温：使胚胎停止发育，延长其体外生存时间体外生存时间l体外培养：将胚胎置于体温条件下，在体外培养：将胚胎置于体温条件下，在培养液中，使其继续发育培养液中，使其继续发育l胚胎冷冻：通过一定的处理程序，将胚胚胎冷冻：通过一定的处理程序，将胚胎降温冷冻后，保存于液氮中胎降温冷冻后，保存于液氮中胚胎移植的技术程序胚胎移植的技术程序6.胚胎的保存胚胎的保存l手术法移植手术法移植l非手术法移植非手术法移植胚胎移植的技术程序胚胎移植的技术程序7.胚胎移植胚胎移植l供体和受体的抗炎处理供体和受体的抗炎处理l健康状况检查健康状况检查l返情状况检查返情状况检查l妊娠检查及妊娠确定妊娠检查及妊娠确定胚胎移植的技术程序胚胎移植的技术程序8.供体和受体的术后观察及处理供体和受体的术后观察及处理动物胚胎移植技术动物胚胎移植技术第四节第四节 牛的胚胎移植牛的胚胎移植一、供体牛的选择一、供体牛的选择一、供体牛的选择一、供体牛的选择二、供体牛的饲养二、供体牛的饲养二、供体牛的饲养二、供体牛的饲养三、超数排卵处理三、超数排卵处理三、超数排卵处理三、超数排卵处理四、采卵四、采卵四、采卵四、采卵五、检卵五、检卵五、检卵五、检卵六、胚胎的鉴定和分级六、胚胎的鉴定和分级六、胚胎的鉴定和分级六、胚胎的鉴定和分级七、胚胎的移植七、胚胎的移植七、胚胎的移植七、胚胎的移植八、妊娠诊断八、妊娠诊断八、妊娠诊断八、妊娠诊断l1.1.应符合本品种标准，具有较高的生产性能。应符合本品种标准，具有较高的生产性能。l2.1.52.1.5 8 8岁，体格健壮，无遗传性疾病，繁殖机能正常。岁，体格健壮，无遗传性疾病，繁殖机能正常。l3.3.产犊记录清楚，无流产史，产后有两次正常发情记录。产犊记录清楚，无流产史，产后有两次正常发情记录。l4.4.生殖器官正常，无繁殖疾病。生殖器官正常，无繁殖疾病。l5.5.重重复复超超数数排排卵卵间间隔隔6060d d左左右右。最最多多连连续续处处理理4 4次次后后，自自然然繁繁殖殖后后再再使使用用。凡凡2 2次次超超数数排排卵卵反反应应差差的的母母牛牛不不再再用用作作供供体。体。l6.6.供供体体牛牛的的超超数数排排卵卵处处理理应应在在情情期期的的第第9 91313d d进进行行。凡凡黄黄体发育不良，卵巢静止的母牛不宜用。体发育不良，卵巢静止的母牛不宜用。l7.7.应选择性情温顺的母牛作供体，以便于操作。应选择性情温顺的母牛作供体，以便于操作。牛的胚胎移植牛的胚胎移植一、供体牛的选择一、供体牛的选择一、供体牛的选择一、供体牛的选择牛的胚胎移植牛的胚胎移植二、二、供体牛的饲养管理供体牛的饲养管理1.1.良良好好的的营营养养状状况况:要要保保证证给给供供体体牛牛足足够够的的优优质质干干草草、青青贮贮或或多多汁汁饲饲料料、精精料料以以及及维维生生素素和和矿矿物物质质，并并供供给给清清洁洁的的饮饮水水和和盐盐，做做到到合合理理饲饲养养，精心管理。精心管理。l2 2供体牛在采卵前后要特别注意保持良好的供体牛在采卵前后要特别注意保持良好的饲管环境，不得任意变换饲草；饲料和管理程饲管环境，不得任意变换饲草；饲料和管理程序，避免因过强的应激所造成的神经紧张状态。序，避免因过强的应激所造成的神经紧张状态。三、三、超数排卵处理超数排卵处理牛的胚胎移植牛的胚胎移植1.FSH1.FSH法法 促促卵卵泡泡素素(FSH)FSH)减减量量注注射射法法：供供体体牛牛在在发发情情后后的的9 9 1313d d肌肌注注FSHFSH，早早晚晚各各一一次次，间间隔隔1212h h，分分4 4d d减减量量注注射射。在在第第3 3d d时时同同时时宫宫注注PGFPGF222.02.02.4mg2.4mg或或氯氯前前列列烯烯醇醇0.60.6mgmg。如如使使用用国国产产FSHFSH总总剂剂量量为为325325单单位位时时，处处理理方方法法如如附附图图所所示示。超超排排剂剂量量根根据据不不同同厂厂家家激激素素确确定定适适宜宜剂剂量量，国国产产激激素素320320360360单单位位，进进口口激素激素28283636mgmg。超数排卵处理超数排卵处理超数排卵处理超数排卵处理 （三）采卵 激素的选择与鉴定激素的选择与鉴定牛超数排卵示意图牛超数排卵示意图超数排卵处理超数排卵处理超数排卵处理超数排卵处理2.PMSGPMSG法法孕马血清促性腺激素孕马血清促性腺激素(PMSG)PMSG)处理法处理法在在情情期期的的11111212d d，一一次次肌肌注注PMSG2500PMSG250030001U30001U，48h48h后后宫宫注注PGFPGF222.4mg2.4mg。发发情情后后约约1818h h肌肌注注等等量的抗量的抗PMSGPMSG。超数排卵处理超数排卵处理超数排卵处理超数排卵处理3.3.发情观察和配种发情观察和配种 PGFPGF22处处理理后后40404848h h，大大部部分分处处理理牛牛发发情情。通通常常要要求求从从注注PGPG第第2 2d d傍傍晚晚开开始始观观察察发发情情，至至少少早早晚晚各各观观察察一一次次。在在观观察察到到接接受受爬爬跨跨后后4 46 6h h进进行行第第一一次次输输精精，间间隔隔1212h h后后第第二二次次输输精精。每每次次有有效效精精子子数数不不得得少少于于501050106 6，输输入入两两侧侧子子宫宫角角或或子子宫体。注意输精时不得触摸卵巢。宫体。注意输精时不得触摸卵巢。超数排卵处理超数排卵处理超数排卵处理超数排卵处理四、四、采卵采卵 牛的胚胎移植牛的胚胎移植牛的胚胎移植牛的胚胎移植1 1采卵时间采卵时间 以以发发情情日日为为第第0 0d d，在在第第5 56 6d d检检查查卵卵巢巢确确定定黄黄体体数数，以以便便于于安安排排受受体体头头数数。第第7 7d d(或第或第6 68 8d)d)非手非手术术回收卵。回收卵。采卵采卵采卵采卵2 2器械和冲卵液的准备器械和冲卵液的准备 灭灭菌菌处处理理过过的的冲冲卵卵管管用用PBSPBS液液冲冲洗洗2 23 3次次，插插入入钢钢芯芯，检检查查气气球球。在在无无菌菌间间用用导导管管连连接接吊吊瓶瓶和和集集卵卵杯杯灌灌流流装装置置。装装入入PBSPBS液液的的吊吊瓶瓶在在3737水水浴浴中中预预温温待待用用。准准备备好好必必要要的的麻麻醉醉剂剂、注注射射器器、酒精棉球和冲洗消毒酒精棉球和冲洗消毒剂剂等。等。采卵采卵采卵采卵3 3供体牛的保定和麻醉供体牛的保定和麻醉 供供体体牛牛保保定定完完毕毕后后，在在第第一一、二二尾尾椎椎骨骨间间酒酒精精消消毒毒，用用2%2%普普鲁鲁卡卡因因3 35 5mlml作作硬硬膜膜外麻醉，或肌注外麻醉，或肌注2%2%静松灵静松灵l mll ml。（三）采卵 采卵采卵采卵采卵4 4外阴清洗、消毒外阴清洗、消毒麻麻醉醉后后将将牛牛尾尾竖竖直直绑绑在在保保定定架架上上，清清除除粪粪便便，用用清清水水冲冲洗洗会会阴阴部部及及外外阴阴，再再用用高高锰锰酸酸钾钾液液冲冲洗洗消消毒毒，用灭菌卫生纸擦干，最后用酒精棉球消毒外阴部。用灭菌卫生纸擦干，最后用酒精棉球消毒外阴部。采卵采卵采卵采卵5 5冲卵管的插入和冲卵部位冲卵管的插入和冲卵部位助助手手将将准准备备好好的的冲冲卵卵管管交交给给术术者者的的右右手手，术术者者左左手手食食指指和和拇拇指指压压开开阴阴门门插插入入冲冲卵卵管管，再再将将左左手手伸伸入入直直肠肠，仔仔细细小小心心地地诱诱导导冲冲卵卵管管经经子子宫宫颈颈进进入入一一侧侧子子宫宫角角至至大大弯弯处处，抽抽出出少少许许钢钢芯芯，再再将将冲冲卵卵管管向向前前推推，使使其其尖尖端端靠靠近近子子宫宫角角深深部部。由由助助手手持持3030mlml注注射射器器一一次次推推入入1010mlml空空气气，然然后后按按术术者者要要求求，以以1 1mlml计计数数充充气气。根根据据子子宫宫大大小小及及冲冲卵卵管管在在子子宫宫的的位位置置确确定定充充气气量量，一一般般青青年年牛牛充充气气14141616mlml，经经产产牛牛为为18182525mlml。冲冲卵卵管管固固定定后后抽抽出出钢钢芯芯，开开始始灌流。灌流。（三）采卵 采卵采卵采卵采卵6 6灌流方法灌流方法将将吊吊瓶瓶挂挂在在距距外外阴阴部部1.01.0m m高高处处，接接通通三三通通管管(Y Y型型)和和冲冲卵卵管管。术术者者用用右右手手控控制制进进流流和和出出流流开开关关，每每次次灌灌注注30305050mlml，由由少少到到多多，每每侧侧总总量量为为300300500500mlml。左左手手通通过过直直肠肠辅辅助助按按摩摩子子宫宫角角。每每侧侧子子宫宫角角冲冲8 81010次次。或或者者用用5050mlml注注射射器器，每每次次注注入入30305050mlml的的PBSPBS冲冲卵卵液液，分分次次冲冲洗洗子子宫宫角角，回回收收后后注注入入加加盖盖量量筒筒。另另一一侧侧子子宫宫角角的的冲冲洗洗是是由由术术者者右右手手拉拉直直冲冲卵卵管管，助助手手小小心心插插入入钢钢芯芯。术术者者的的左左手手在在直直肠肠内内诱诱导导钢钢芯芯插插稳稳后后，给给气气球球放放气气。术术者者再再将将冲冲卵卵管管插插入入另另一一侧侧子子宫宫角角，用用同同样样的的方方法法冲冲洗。全洗。全过过程需在室温程需在室温(20(20左右左右)操作。操作。（三）采卵 采卵采卵采卵采卵（三）采卵 采卵采卵采卵采卵7 7术后处理术后处理两两侧侧子子宫宫角角冲冲卵卵完完成成后后，从从气气球球放放出出一一部部分分空空气气，将将冲冲卵卵管管抽抽至至子子宫宫体体灌灌注注土土霉霉素素溶溶液液(3(3g g土土霉霉素素粉粉溶溶于于100100mlml灭灭菌菌双双蒸蒸水水或或生生理理盐盐水水)或或1010mlml青青霉霉素素(80(80万万u)u)和和链链霉霉素素(100(100万万u)u)，拔出冲卵管。拔出冲卵管。（三）采卵 采卵采卵采卵采卵五、检卵五、检卵 （三）采卵 1 1过滤集卵杯过滤集卵杯(日本产日本产)法法回回收收结结束束后后，用用带带4 4G G针针头头的的注注射射器器冲冲洗洗滤滤网网2 23 3次次，吸吸去去杯杯中中的的泡泡沫沫，置置实实体体显显微微镜镜下检查。下检查。（三）采卵 检卵检卵检卵检卵2 2过滤杯过滤杯(美国产美国产)法法滤滤去去冲冲卵卵液液，将将过过滤滤杯杯中中留留下下的的30305050mlml倒倒入入平平皿皿，用用冲冲卵卵液液冲冲洗洗过过滤滤杯杯2 23 3次次，一一并倒入平皿，置镜下检查。并倒入平皿，置镜下检查。（三）采卵 检卵检卵检卵检卵3 3沉淀法沉淀法(或滤网吸液法或滤网吸液法)将将回回收收的的冲冲卵卵液液注注入入10001000mlml量量筒筒，在在20202525下下静静置置20203030min(min)min(min)，用用导导管管吸吸去去上上层层液液体体。或或者者按按好好滤滤网网，用用导导管管在在滤滤网网上上吸吸去去上上部部冲冲卵卵液液，将将残残留留的的8080100100mlml倒倒入平皿内检卵。入平皿内检卵。（三）采卵 检卵检卵检卵检卵4 4检卵前的准备检卵前的准备在在酒酒精精灯灯上上拉拉好好内内径径为为200200300300umum的的玻玻璃璃吸吸管管和和玻玻璃璃棒棒，在在吸吸管管上上连连接接乳乳胶胶管管(也也可可用用1 1mlml一一次次性性注注射射器器与与一一支支采采血血管管接接一一起起)。在在小小培培养养皿皿内内做做好好含含10%10%或或20%20%牛牛血血清清的的PBSPBS保保存存液液液液滴滴3 35 5个个，覆覆盖盖上上液液体体石石蜡蜡油油，作好编号，放入培养箱待用。作好编号，放入培养箱待用。（三）采卵 检卵检卵检卵检卵5 5检卵检卵用用玻玻璃璃棒棒清清除除卵卵外外围围的的粘粘液液、杂杂质质。用用吸吸管管将将卵卵移移至至培培养养皿皿的的液液滴滴内内，同同一一供供体体牛牛的的卵卵放放于于同同一一液液滴滴内内。然然后后用用吸吸管管先先吸吸入入少少量量第第二二液液滴滴的的PBSPBS保保存存液液至至第第一一液液滴滴，吸吸入入全全部部卵卵，防防止止吸吸入入黏黏液液、杂杂质质，移移至至第第二二液液滴滴，依依次次冲冲洗洗卵卵3 35 5次次。室室温温20202525，需，需2 2人进行检卵及胚胎鉴定。人进行检卵及胚胎鉴定。（三）采卵 检卵检卵检卵检卵六、胚胎的鉴定和分级六、胚胎的鉴定和分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级1 1胚胎的鉴定胚胎的鉴定（三）采卵 胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级 在在100100200200倍倍实实体体解解剖剖镜镜下下观观察察受受精精卵卵的的形形态态、色色调调、分分裂裂球球的的大大小小、均均匀匀度度、细细胞胞的的密密度度、与与透透明明带带的的间间隙隙以以及及变变性性情情况等。况等。凡凡卵卵子子的的卵卵黄黄未未形形成成分分裂裂球球及及细细胞胞团团的的，均列为未受精卵。均列为未受精卵。（三）采卵 胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级二细胞至四细胞胚胎 （三）采卵 胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的早期发育过程胚胎的早期发育过程胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级 （三）采卵 胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级 通通常常受受精精后后6 68 8d d非非手手术术回回收收的的正正常常受受精精卵卵发发育情况如下：育情况如下：桑桑椹椹胚胚一一发发情情后后第第5 56 6d d回回收收的的卵卵，只只能能观观察察到到球球状状的的细细胞胞团团，分分不不清清分分裂裂球球，占占据据透透明明带带内内腔腔的大部分。的大部分。致致密密桑桑椹椹胚胚：发发情情后后第第6 67 7d d回回收收的的卵卵，细细胞胞团团变小，占透明带内腔变小，占透明带内腔60%60%70%70%。（三）采卵 胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级 （三）采卵 早期囊胚：发情后第早期囊胚：发情后第7 78 8d d回收的卵，细胞的一回收的卵，细胞的一部分出现发亮的胚泡腔。细胞团占透明带内腔部分出现发亮的胚泡腔。细胞团占透明带内腔70%70%80%80%，难以分清内细胞团和滋养层。，难以分清内细胞团和滋养层。囊胚：发情后第囊胚：发情后第7 78 8d d回收，内细胞团和滋养层回收，内细胞团和滋养层界线清晰，胚泡腔明显，细胞充满透明带内腔。界线清晰，胚泡腔明显，细胞充满透明带内腔。扩大囊胚：发情后第扩大囊胚：发情后第8 89 9d d回收，胚泡腔明显扩回收，胚泡腔明显扩大，体积增大到原来的大，体积增大到原来的1.21.21.51.5倍，与透明带之倍，与透明带之间无空隙，透明带变薄，相当于正常厚度的间无空隙，透明带变薄，相当于正常厚度的1/31/3。胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级 孵孵育育胚胚：一一般般在在发发情情后后9 91111d d，由由于于胚胚泡泡腔腔继继续扩张，致使透明带破裂，卵细胞脱出。续扩张，致使透明带破裂，卵细胞脱出。凡凡在在发发情情后后第第6 68 8d d回回收收的的1616细细胞胞以以下下的的受受精精卵卵均均应应列列为为非非正正常常发发育育卵卵，不不能能用用于于移移植植或或冷冷冻冻保保存存（三）采卵 胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级2 2胚胎的分级：胚胎的分级：（三）采卵 胚胎的等级划分还应考虑到受精卵的发育程度。胚胎的等级划分还应考虑到受精卵的发育程度。如：发情后第如：发情后第7 7d d回收的受精卵在正常发育时应处回收的受精卵在正常发育时应处于致密桑椹胚至囊胚阶段。凡在于致密桑椹胚至囊胚阶段。凡在1616细胞以下的受细胞以下的受精卵及变性细胞超过一半的胚胎均属等外。精卵及变性细胞超过一半的胚胎均属等外。胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级A A级级胚胚胎胎形形态态完完整整，轮轮廓廓清清晰晰，呈呈球球形形，分分裂裂球球大大小小均均匀匀，结结构构紧紧凑凑，色色调调和和透透明明度度适适中中，无附着的细胞和液泡。无附着的细胞和液泡。（三）采卵 胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级 B B级级 一一轮轮廓廓清清晰晰，色色调调及及细细胞胞密密度度良良好好，可可见见到到一一些些附附着着的的细细胞胞和和液液泡泡，变变性性细细胞胞约约占占10%10%30%30%（三）采卵 胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级C C级级 轮轮廓廓不不清清晰晰，色色调调发发暗暗，结结构构较较松松散散，游游离离的的细细胞胞或或液液泡泡较较多多，变变性性细细胞胞达达30%30%50%50%。（三）采卵 胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级（三）采卵 胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级胚胎的鉴定及分级 塑塑料料细细管管的的编编号号：剪剪一一段段(2(2cm)0.5mlcm)0.5ml的的塑塑料料细细管管作作为为标标记记外外套套，内内装装色色纸纸，写写上上供供体体品品种种、牛牛号号、胚胚胎胎发发育育阶阶段段及及等等级级、制制作作日日期期(年年、月月、日日)，并并在在外外套套管管上上写写明序号备查。明序号备查。（三）采卵 3.胚胎的标记胚胎的标记七、胚胎的移植七、胚胎的移植（三）采卵 牛的胚胎移植牛的胚胎移植牛的胚胎移植牛的胚胎移植1 1受体牛的选择标准受体牛的选择标准 年年龄龄在在3 38 8岁岁，健健康康，无无疾疾病病，体体格格较较大大，膘膘度好。度好。繁繁殖殖性性能能正正常常，产产后后6060d d以以上上，并并有有两两次次以以上上的的正常自然发情记录。正常自然发情记录。泌泌乳乳性性能能好好，无无难难产产史史。不不使使用用两两次次人人工工授授精精未孕的牛。未孕的牛。（三）采卵 胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植2 2受体牛的饲养管理受体牛的饲养管理 做做到到精精心心管管理理，合合理理饲饲养养，环环境境清清洁洁，饲饲草草、饲料、饮水要新鲜，补充食盐和必要的添加剂。饲料、饮水要新鲜，补充食盐和必要的添加剂。组组成成一一定定数数量量的的牛牛群群。圈圈舍舍内内防防止止过过挤挤，以以便便于于发情观察。发情观察。农户长期舍饲的母牛要注意加强运动。农户长期舍饲的母牛要注意加强运动。防防止止在在移移植植前前后后因因饲饲料料及及环环境境改改变变造造成成的的应应激激反反应应。（三）采卵 胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植3 3供体牛、受体牛的同期发情供体牛、受体牛的同期发情 自然发情自然发情根根据据受受体体牛牛的的发发情情观观察察，与与供供体体牛牛发发情情前前后后相差一天内的牛，可作为受体。相差一天内的牛，可作为受体。（三）采卵 胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植 使用使用PGFPGF22。(一次宫注一次宫注)诱发发情诱发发情一一般般在在供供体体牛牛注注射射PGFPGF22前前一一天天，给给处处于于情情期期8 81515d d且且直直检检黄黄体体好好的的受受体体牛牛一一次次宫宫注注PGFPGF222mg2mg诱诱发发情。发发情。两次两次PGFPGF22处理处理在在不不考考虑虑发发情情周周期期的的情情况况下下，可可间间隔隔1111d d，前前后后两两次次宫宫注注PGFPGF22受受体体牛牛的的处处理理日日程程安安排排应应与与供供体体牛牛超排处理相吻合。超排处理相吻合。（三）采卵 胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植4.4.发情观察发情观察原原则则上上根根据据母母牛牛接接受受爬爬跨跨确确认认发发情情，早早、晚晚各各观观察察3030minmin发发情情情情况况。对对发发情情牛牛需需做做直直检检以以确确认认卵卵泡泡，次日上午或晚上确定是否排卵。次日上午或晚上确定是否排卵。若在发情后若在发情后3636h h以后排卵的牛不能用作受体。以后排卵的牛不能用作受体。（三）采卵 胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植 供体牛、受体牛的发情日差供体牛、受体牛的发情日差移移植植胚胚胎胎时时，如如果果供供体体和和受受体体牛牛的的发发情情周周期期不不一一致致，则则难难以以受受胎胎。要要求求两两者者的的子子宫宫环环境境相相一一致致。受受体体牛牛的的发发情情日日比比供供体体牛牛早早一一天天为为+1+1，晚晚一一天天为为-1-1，同日发情为同日发情为0 0。超过。超过2 2d d不能用于移植。不能用于移植。按胚胎发育情况选受体牛的发情日差按胚胎发育情况选受体牛的发情日差可可将将致致密密桑桑椹椹胚胚移移植植给给发发情情6 6d d的的受受体体牛牛，将将早早期期囊囊胚胚移移植植给给发发情情7 7d d的的受受体体牛牛，将将囊囊胚胚和和扩扩大大囊囊胚胚移移植给发情植给发情8 8d d的受体牛。的受体牛。（三）采卵 胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植 5.5.器械准备器械准备仿仿西西德德式式金金属属移移植植器器，先先将将移移植植枪枪、枪枪头头及及金金属属保保护护外外套套分分别别用用纸纸包包扎扎好好，高高压压消消毒毒。塑塑料料卡卡苏苏式式移移植植枪枪需需经经气气体体灭灭菌菌。移移植植时时，先先用用70%70%酒酒精精棉棉球球消消毒毒装装有有胚胚胎胎的的塑塑料料细细管管，然然后后剪剪掉掉封封口口一一端端，装入移植枪内，套上保护外套。装入移植枪内，套上保护外套。（三）采卵 胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植6.6.移植前胚胎装管移植前胚胎装管 胚胚胎胎移移植植时时可可用用0.250.25mlml细细管管分分三三段段吸吸入入PBSPBS保保存存液液，中中间间由由两两个个气气泡泡隔隔开开，中中段段含含有有胚胚胎胎。也也可可用用小小气气泡泡分分成成多多段段装装管管，胚胚胎胎在在中中段段。一一步步细细管管法法解解冻冻脱脱甘甘油油后后，用用酒酒精精棉棉球球多多次次消消毒毒细细管管，剪剪去去封封口口即即可可用用于移植。于移植。（三）采卵 胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植 （三）采卵 胚胎装管示意图胚胎装管示意图胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植7.7.受体牛的准备受体牛的准备 将将受受体体牛牛保保定定，清清除除粪粪便便，肌肌注注2%2%静静松松灵灵l l mlml或或用用2%2%的的普普鲁鲁卡卡因因3 3mlml在在1 1、2 2尾尾椎椎间间硬硬膜膜外外麻麻醉醉。清清洗洗外外阴阴，用用高高锰锰酸酸钾钾水水冲冲洗洗消消毒毒，用用灭灭菌菌纸纸擦擦干干，最最后后经经酒酒精精棉棉球球消毒。消毒。（三）采卵 胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植 8.8.移植移植 术术者者用用左左手手压压开开外外阴阴，右右手手持持移移植植器器插插入入阴阴道道。然然后后左左手手伸伸进进直直肠肠，移移植植器器到到达达子子宫宫颈颈口口时时，右右手手用用力力将将移移植植枪枪捅捅破破外外套套填填片片，插插入入子子宫宫颈颈。左左手手在在直直肠肠内内诱诱导导使使枪枪头头轻轻轻轻稳稳妥妥地地插插入入黄黄体体侧侧子子宫宫角角至至大大弯弯处处，持持移移植植器器的的右右手手推推出出胚胚胎胎，缓缓慢旋慢旋转转地抽出移植地抽出移植枪枪。（三）采卵 胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植移胚移胚 （三）采卵 胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植胚胎的移植八、妊娠诊断八、妊娠诊断 （三）采卵 牛的胚胎移植牛的胚胎移植牛的胚胎移植牛的胚胎移植 1 1直肠检查法直肠检查法 通通常常在在移移植植后后三三个个月月开开始始检检查查。妊妊娠娠9090d d时时，子子宫宫继继续续增增大大，落落入入腹腹腔腔，可可感感觉觉到到胎胎儿儿的的浮浮动动，孕孕角角出出现现孕孕脉脉，子子宫宫壁壁可可触到子叶。触到子叶。（三）采卵 妊娠诊断妊娠诊断妊娠诊断妊娠诊断2 2超声波诊断超声波诊断(B B超超)对对妊妊娠娠2525d d以以上上的的受受体体牛牛可可用用B B超超检检查查。利利用用探探头头通通过过直直肠肠轻轻轻轻地地在在子子宫宫角角滑滑动动，在在荧荧光光屏屏上上便便可可观观察察到到周周围围黑黑色色中中间间有有一一个个长长1 12 2cmcm灰灰白白色色图图像像，即即是是胎胎儿儿。胎胎儿儿6060日日龄龄时时为为6 67 7cmcm长长，9090日日龄龄时时为为14141717cmcm长。长。使使用用B B超超探探头头检检查查时时要要特特别别注注意意，防防止止动动作作过过重重，检查过度，以免引起流产。检查过度，以免引起流产。（三）采卵 妊娠诊断妊娠诊断妊娠诊断妊娠诊断（三）采卵 胚胎移植产出的犊牛谢谢！谢谢！The End