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第二章色谱法概论第一页，本课件共有38页1956年，荷 兰 学 者 范 第 姆 特（Van Deemter）总结了前人的经验，提出了反映载气流速和柱效关系的范第姆特方程式，建立了初步的色谱理论。我国科技工作者，早在1956年就开展了气相色谱法的研究工作，1958年，我国的第一台气相色谱仪研制成功。第二页，本课件共有38页2.色谱法分类 不管属于哪一类色谱法，其共同的基本特点是具备两个相：不不动动的的一一相相，称称一一为为固固定定相相；另另一一相相是是携携带带样样品品流流过过固固定定相相的的流流动动体体，称称为为流流动动相相。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞滞留留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。第三页，本课件共有38页一一.按两相状态分类按两相状态分类 气体为流动相的色谱称为气气相相色色谱谱（GCGC），根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（气固色谱（GSCGSC）和气液色谱（）和气液色谱（GLCGLC）液体为流动相的色谱称液液相相色色谱谱（LCLC）。同理，液相色谱亦可分为液固色谱（液固色谱（LSCLSC）和液液色谱（）和液液色谱（LLCLLC）超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱（超临界流体色谱（SFCSFC）.。通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（化学键合相色谱（CBPCCBPC）.第四页，本课件共有38页二按分离机理分类 利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法吸附色谱法。利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法分配色谱法。利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法离子交换色谱法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法排阻色谱法。最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲亲和和色色谱谱法法，常用于蛋白质的分离。第五页，本课件共有38页 固定相装于柱内的色谱法，称为固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱。固定相呈平板状的色谱。固定相呈平板状的色谱法，称为法，称为平板色谱平板色谱平板色谱平板色谱，它又可分为，它又可分为薄层色谱薄层色谱薄层色谱薄层色谱和和纸色谱纸色谱纸色谱纸色谱。根据以上所述，将色谱法的分类总结于下表中。根据以上所述，将色谱法的分类总结于下表中。三按固定相的外形分类三按固定相的外形分类第六页，本课件共有38页第七页，本课件共有38页3.色谱流出曲线及有关术语一流出曲线和色谱峰 第八页，本课件共有38页 如如果果进进样样量量很很小小，浓浓度度很很低低，在在吸吸附附等等温温线线的的线线性性范范围围内内，色色谱峰如果对称，可用谱峰如果对称，可用GaussGauss正态分布函数表示：正态分布函数表示：式中C：不同时间t时某物质的浓度，C0：进样浓度，tr：保留时间，：标准偏差。第九页，本课件共有38页二、基线(baseline)是柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值，即图中Ot线稳定的基线应该是一条水平直线一条水平直线。三、峰高(peak height)色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，如图中BA。第十页，本课件共有38页四、保留值(retention value)1死时间死时间tM(dead time)不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，如图中 OA。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相近测定流动相平均线速时，可用柱长L与tM的比值计算。第十一页，本课件共有38页 2保留时间保留时间tR（retention time)试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保留时间，如图中OB它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间。第十二页，本课件共有38页3调整保留时间调整保留时间tR（adjusted retention timeadjusted retention time)某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间，即：间，即：t tR R =t=tR R-tMM 4死体积死体积 VM(dead volume)指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和当后两项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速F0（Lmin）计算：VM=tMF0 第十三页，本课件共有38页5保留体积保留体积 VR(retention volume)指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间动相体积。保留体积与保留时间t tR R的关系如下的关系如下：VR=tRF0 6调调 整整 保保 留留 体体 积积 VR(adjusted retention volume)某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积，即:VR=VR-VM第十四页，本课件共有38页 7相对保留值相对保留值2.1(relative retention value)某组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比，称为相对保留值：由由于于相相对对保保留留值值只只与与柱柱温温及及固固定定相相的的性性质质有有关关，而而与与柱柱径径、柱柱长长、填填充充情情况况及及流流动动相相流流速速无无关关，因因此此，它它是是色色谱谱法法中中，特特别别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据是气相色谱法中，广泛使用的定性数据 必必必必须须须须注注注注意意意意，相相相相对对对对保保保保留留留留值值值值绝绝绝绝对对对对不不不不是是是是两两两两个个个个组组组组份份份份保保保保留留留留时时时时间间间间或或或或保保保保留留留留体体体体积积积积之比之比之比之比.第十五页，本课件共有38页8.选择因子(Selective factor)在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准(s),(s),然后再求其它峰然后再求其它峰(i)(i)对这个峰的相对保留值。此时，对这个峰的相对保留值。此时，r ri/si/s可能大于可能大于1 1，也可能小于，也可能小于1 1。在多元混合物。在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参数。在这种特殊情况下，可用符号数。在这种特殊情况下，可用符号 表示：表示：式中tR2为后出峰的调整保留时间，所以这时总是大于1的。第十六页，本课件共有38页五、区域宽度(peak width)色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：色谱操作条件的动力学因素度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：1.标准偏差标准偏差(standard deviation)即0607倍峰高处色谱峰宽的一半，如图中EF距离的一半。2.半峰宽半峰宽W1/2 (peak width at half-height)即峰高一半处对应的峰宽，如图中GH间的距离它与标准偏差的关系是：W1/2=2.354第十七页，本课件共有38页 3.基线宽度基线宽度W(peak width at peak base)即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距，如图中IJ的距离它与标准偏差的关系是：W=4 W 1.7 W1/2 第十八页，本课件共有38页从色谱流出曲线上可以得到许多重要信息：（l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组份的最少个数（2）根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定性分析(3)根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析（4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据（5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据第十九页，本课件共有38页 基基于于物物质质在在两两相相间间具具有有不不同同的的分分配配系系数数。当当两两相相做做相相对对运运动动时时，试试样样中中的的各各组组分分就就在在两两相相中中进进行行反反复复多多次次分分配配，使使得得原原来来的的分分配配系系数数差差异异不不大大的的各各组组分分产产生生很很大大的分离效果，从而实现各组分的分离开来。的分离效果，从而实现各组分的分离开来。色谱法分析的基本原理第二十页，本课件共有38页一、分配系数K和分配比k1 1分配系数分配系数K K 如前所述，分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附一脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数。分配系数指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值浓度之比值，即：第二十一页，本课件共有38页2.2.分配比分配比k k 分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即 第二十二页，本课件共有38页 k k值值越越大大，说说明明组组分分在在固固定定相相中中的的量量越越多多，相相当当于于柱柱的的容容量量大大，因因此此又又称称分分配配容容量量或或容容量量因因子子。它它是是衡衡量量色色谱谱柱柱对对被被分分离离组组分分保保留留能能力力的的重重要要参参数数。k k值值也也决决定定于于组组分分及及固固定定相相热热力力学学性性质质。它它不不仅仅随随柱柱温温、柱柱压压变变化化而而变变化化，而而且且还还与与流流动动相相及及固固定定相相的的体体积积有关。有关。式中CS，Cm分别为组分在固定相和流动相的浓度；Vm为柱中流动相的体积，近似等于死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。第二十三页，本课件共有38页滞留因子Rs 分配比k值可直接从色谱图测得。设流动相在柱内的线速度为u，组分在柱内线速度为us，由于固定相对组分有保留作用，所以usu此两速度之两速度之比称为滞留因子Rs。第二十四页，本课件共有38页R Rs s若用质量分数表示，即若用质量分数表示，即 对组分和流动相通过长度为L的色谱柱，其所需时间分别为:第二十五页，本课件共有38页整理可得整理可得:第二十六页，本课件共有38页3.分配系数分配系数K与分配比与分配比k的关系的关系 其中称为相相比比率率，它是反映各种色谱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其值一般为635；对毛细管柱，其值为60600。第二十七页，本课件共有38页4.分配系数分配系数K及分配比及分配比k与选择因子与选择因子的关系的关系 根据前面的推导，对A、B两组分的选择因子，用下式表示：通过选择因子把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来，对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的K或k值相等，则=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。第二十八页，本课件共有38页二、塔板理论 最早由最早由MartinMartin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引人理用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引人理论塔板数作为衡量柱效率的指标。论塔板数作为衡量柱效率的指标。第二十九页，本课件共有38页该理论假定：（i）在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平 衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。（ii）以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（Vm）。（iii）所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。（iv）分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。为简单起见，设色谱柱由5块塔板（n5，n为柱子的塔板数）组成，并以r表示塔板编号，r=1，2，nl；某组分的分配比k=1.第三十页，本课件共有38页 根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下：开始时，若有单位质量，即m=1（例1mg或1g）的该组分加到第0号塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。当一个板体积（lV）的载气以脉动形式进入0号板时，就将气相中含有nm部分组分的载气顶到1号板上，此时0号板液相（或固相）中ns部分组分及1号板气相中的nm部分组分，将各自在两相间重新分配。故0号板上所含组分总量为0.5，其中气液（或气固）两相各为0.25而1号板上所含总量同样为0.5气液（或气固）相亦各为0.25。以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时，上述过程就重复一次(见下表)。第三十一页，本课件共有38页 第三十二页，本课件共有38页 按上述分配过程，对于按上述分配过程，对于n=5n=5，k=1k=1，m=1m=1的体系，随着脉动进入的体系，随着脉动进入柱中板体积载气的增加，组分分布在柱内任一板上的总量（气液两柱中板体积载气的增加，组分分布在柱内任一板上的总量（气液两相中的总质量）见表。相中的总质量）见表。由塔板理论可建流出曲线方程：由塔板理论可建流出曲线方程：m为组分质量，Vr为保留体积，n为理论塔板数。当V=Vr 时，C值最大，即：第三十三页，本课件共有38页由流出曲线方程可推出：由流出曲线方程可推出：而理论塔板高度（H）即：第三十四页，本课件共有38页 从上两式可以看出，色谱峰W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指标。通常填充色谱柱的n103，H1mm。而毛细管柱 n=105-106，H0.5mm 由于死时tm包括在tr中,而实际的tm不参与柱内分配,所计算的n值尽大,H很小,但与实际柱效能相差甚远.所以,提出把tm扣除,采用有效理论塔板数neff和有效塔板高Heff评价柱效能。第三十五页，本课件共有38页 塔板理论用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置，还提出了计算和评价柱效的参数。但由于它的某些基本假设并不完全符合柱内实际发生的分离过程，例如，纵向扩能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素，也不能说明为什么在不同流速下可以测得不同的理论塔板数，这就限制了它的应用。第三十六页，本课件共有38页第三十七页，本课件共有38页双K与“五保”，塔板n/H。1，没有戏！R1.5,全分离。第三十八页，本课件共有38页