质粒琼脂糖凝胶电泳精.ppt
质粒琼脂糖凝胶电泳质粒琼脂糖凝胶电泳第1页，本讲稿共22页实验目的实验目的掌掌握握琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳检检测测DNA的的原原理和方法。理和方法。第2页，本讲稿共22页实验原理实验原理DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为分分子筛效应。子筛效应。在在 pH 值为值为 8.08.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带核酸分子带负电，负电，在电泳时在电泳时向正极移动。向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛分子筛的作用下，使的作用下，使分分子大小和构象不同的核酸分子子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入核酸分子中嵌入荧光染料（如荧光染料（如 EB）后，在紫外灯下可观察到核后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。酸片段所在的位置。第3页，本讲稿共22页实验器材和试剂实验器材和试剂实验器材实验器材：制胶模具，水平式电泳槽，电泳仪，微量移液器制胶模具，水平式电泳槽，电泳仪，微量移液器,微波炉微波炉,紫外透射仪或凝胶成像系统。紫外透射仪或凝胶成像系统。样品样品：DNA分子量标准品，质粒分子量标准品，质粒试剂试剂 琼脂糖琼脂糖1电泳缓冲液（电泳缓冲液（TBE）6上样缓冲液上样缓冲液溴化乙锭溴化乙锭(EB)：10mg/ml 第4页，本讲稿共22页琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定分离鉴定和和纯化纯化DNA片片段段的标准方法。的标准方法。该技术操作该技术操作简便快速简便快速，可以分辨用其它方法，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。片段。当用低浓度的荧光嵌入染料当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶溴化乙啶(Ethidium bromide,EB)染色染色,在紫外光下至在紫外光下至少可以检出少可以检出1-10ng的的DNA条带条带,从而可以确从而可以确定定DNA片段在凝胶中的位置。片段在凝胶中的位置。此外此外,还可以从电泳后的凝胶还可以从电泳后的凝胶中中回收特定的回收特定的DNA条带条带,用于以后的克隆操作。用于以后的克隆操作。第5页，本讲稿共22页琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶天然琼脂（天然琼脂（agaragar）:又名琼胶、菜燕、冻粉又名琼胶、菜燕、冻粉 从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。状高聚物。琼脂糖（琼脂糖（agaroseagarose）琼脂胶（琼脂胶（agaropectinagaropectin）:含硫酸根和羧基的强酸性多含硫酸根和羧基的强酸性多糖，糖，在电场作用下能产生较强的电渗现象。在电场作用下能产生较强的电渗现象。琼琼脂脂第6页，本讲稿共22页琼脂糖凝胶的优点琼脂糖凝胶的优点(1)操作简单操作简单，电泳速度快，样品不需事先处电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。理就可进行电泳。(2)琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶结构均匀结构均匀，对样品吸附极微，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。(3)琼脂糖琼脂糖透明无紫外吸收透明无紫外吸收，电泳过程和结果，电泳过程和结果可直接用紫外监测及定量分析。可直接用紫外监测及定量分析。(4)电泳后区带电泳后区带易染色易染色，样品易洗脱，便于定，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存量测定。制成干膜可长期保存。第7页，本讲稿共22页缺点缺点：1.1.机械强度差，机械强度差，易破易破碎，浓度不能太低。碎，浓度不能太低。2.2.易被细菌污染易被细菌污染，不易保存，临用前配制。，不易保存，临用前配制。3.3.琼琼脂脂糖糖支支持持层层上上的的区区带带易易于于扩扩散散，电电泳泳后后必须立即固定染色。必须立即固定染色。4.4.与与PAGEPAGE相比，相比，分子筛作用小，分子筛作用小，区带少。区带少。第8页，本讲稿共22页影响琼脂糖凝胶电泳的因素影响琼脂糖凝胶电泳的因素DNA分子的大小分子的大小：实验证明，实验证明，DNA片段迁移距离与其分子量片段迁移距离与其分子量的对数成反比；的对数成反比；琼脂糖的浓度：琼脂糖的浓度：一定大小的一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂凝片段在不同浓度的琼脂凝胶中，电泳迁移率不相同；胶中，电泳迁移率不相同；DNA分子的构型：分子的构型：不同构型的不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大。度差别较大。第9页，本讲稿共22页上样缓冲液 0.25溴酚兰；溴酚兰；0.25二甲苯青；二甲苯青；30甘油甘油水溶液水溶液作用：作用：增加样品密度，使其比重增加，以确增加样品密度，使其比重增加，以确保保DNA均匀沉入加样孔内均匀沉入加样孔内在电泳中形成肉眼可见的指在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置示带，可预测核酸电泳的速度和位置使样品呈色，使加样操作更方便使样品呈色，使加样操作更方便第10页，本讲稿共22页胶浓度（%）溴酚蓝二甲苯青0.61kb10.6kb2kb1.40.2kb1.6kb20.15kb电泳指示剂：电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种核酸电泳常用的指示剂有两种 溴酚蓝（溴酚蓝（bromophenol blue,Bb）；）；二二甲甲苯苯青青（xylene cyanol,Xc），它它携携带带的的电电荷荷量量比比溴溴酚酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。第11页，本讲稿共22页核酸电泳的染色剂最常用的染色剂最常用的染色剂溴化乙锭溴化乙锭银染色银染色第12页，本讲稿共22页溴化乙锭（溴化乙锭（ethidium bromide，EB）是一种荧光染料，是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的分子可嵌入核酸双链的碱基对碱基对之间，之间，在在紫外线紫外线激发下，发出激发下，发出桔红色桔红色荧光荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的的EB，有时亦，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1015minEB染料有许多优点，如染料有许多优点，如染色操作简便、快速，灵敏度染色操作简便、快速，灵敏度高，高，10ng或更少的或更少的DNA即可检出即可检出。注意：注意：EBEB被认为是一种强致癌物质被认为是一种强致癌物质，操作时应尽量小心，配操作时应尽量小心，配置和使用置和使用EBEB时都应带上手套，且注意不要把时都应带上手套，且注意不要把EBEB洒到桌面或地洒到桌面或地板上。板上。第13页，本讲稿共22页银染色银染色银染色液中的银离子银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸还原成银颗粒，可把核酸电泳带染成黑褐色。电泳带染成黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色。染色。灵敏度比灵敏度比EB高高200倍，但银染色后，倍，但银染色后，DNA不宜回收不宜回收第14页，本讲稿共22页实验操作实验操作第15页，本讲稿共22页操作步骤1.准备准备用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子并架好梳子第16页，本讲稿共22页2.配制配制1%琼脂糖凝胶及倒胶琼脂糖凝胶及倒胶具体步骤：具体步骤：三角瓶内：三角瓶内：1g琼脂糖琼脂糖+100ml(1TBE)煮胶溶解煮胶溶解 冷却至冷却至60(不烫手不烫手)加加EB 倒板倒板 室温下充分凝固室温下充分凝固 垂直向上拔出梳子垂直向上拔出梳子 将胶板放入电泳槽将胶板放入电泳槽 向电泳槽中加入向电泳槽中加入1xTBE缓冲液缓冲液至刚没过凝胶表面。至刚没过凝胶表面。第17页，本讲稿共22页3.加样加样将将DNA样品（样品（5ul）与）与6 上样缓冲液（上样缓冲液（1ul）混匀后，用混匀后，用微量加样枪小心加入样品孔内。微量加样枪小心加入样品孔内。注意加样枪的枪头注意加样枪的枪头不可插入过深不可插入过深，以免刺穿凝胶，导致样品外溢。，以免刺穿凝胶，导致样品外溢。每加完一个样品要每加完一个样品要更换枪头更换枪头，以防止，以防止EB污染。污染。第18页，本讲稿共22页4.电泳电泳接通电源，一般接通电源，一般红色为正极红色为正极，黑色为负极黑色为负极，切记，切记DNA样样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为5 V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）（长度以两个电极之间的距离计算）根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳第19页，本讲稿共22页5.结果观察结果观察电泳结束后，将凝胶板取出。在紫外仪上观电泳结束后，将凝胶板取出。在紫外仪上观察电泳带及其位置，记录实验结果。察电泳带及其位置，记录实验结果。第20页，本讲稿共22页注意事项注意事项1、倒胶时把握好胶的温度，不要高于倒胶时把握好胶的温度，不要高于60，否则温，否则温度太高会使制板变形；度太高会使制板变形；2、胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔；不要弄坏点样孔；3、点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，不、点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，不要刺穿凝胶；要刺穿凝胶；4、EB有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔；胶勿乱扔；5、紫外线照射不要太久。、紫外线照射不要太久。第21页，本讲稿共22页THE EDD谢谢谢谢第22页，本讲稿共22页
