穿心莲不同倍性染色体制片技术优化.docx

广州中医药大学中药学院2019届本科毕业论文 中药学院本科毕业论文（设计）题目：穿心莲不同倍性染色体制片技术优化 年级专业 2015级 中药资源与开发专业学 号 2015032001姓 名 王欢指导教师 杜勤学历职称 博士/教授教师单位 广州中医药大学中药学院填表日期 2019年4月2日广州中医药大学学位论文诚 信 声 明本人郑重声明：所呈交的学术论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人或集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名： 年 月 日目录摘要1前言3概述31穿心莲的研究进展31.1 穿心莲的种植栽培31.2 穿心莲的化学成分41.3 穿心莲的药理活性42染色体制片技术4研究部分51材料和仪器51.1 实验材料51.2 实验试剂51.3 实验仪器52实验方法62.1 穿心莲花药愈伤组织的染色体制片优化62.2 穿心莲二倍体的染色体制片优化72.3穿心莲同源四倍体的染色体制片优化83实验结果93.1穿心莲花药愈伤组织的染色体观察93.2 穿心莲二倍体的染色体观察113.3 穿心莲同源四倍体的染色体观察143.4 取材时间比较154讨论15【参考文献】16致谢18广州中医药大学中药学院2019届本科毕业论文穿心莲不同倍性染色体制片技术优化作者：王欢（2015级中药资源与开发专业 2015032001）指导教师：杜勤（广州中医药大学中药学院药用植物学教研室）【摘要】目的：为不同倍性穿心莲染色体标本制片优化的研究提供方法，改良三种不同倍性的穿心莲染色体制片技术。方法:采用常规的压片方法进行穿心莲染色体的制片技术的优化，并对穿心莲染色体的数量进行研究。考察不同试剂、预处理时间以及解离方式对穿心莲染色体制片的影响。结果：取材最佳时间为08:00-10:00；用0.10%秋水仙素溶液预处理穿心莲花药愈伤组织2.5 h，1.0 mol·L-1盐酸溶液恒温条件下解离8 min效果最佳，染色体数目为n=x=24；穿心莲二倍体根尖用0.10%秋水仙素溶液预处理2 h，盐酸溶液恒温解离12 min，低渗处理15 min效果最佳，染色体数目2n=2x=48；穿心莲同源四倍体离体材料用0.20%秋水仙素溶液预处理4 h，低渗处理处理40-60 min，盐酸溶液恒温解离15 min效果较好，染色体数目2n=4x=96。结论：本实验优化了穿心莲不同倍性染色体制片技术，为后期穿心莲染色体鉴定提供参考依据。【关键词】穿心莲；染色体；制片技术Optimization of production technology for different ploidy chromosomes in Andrographis paniculate英文摘要和关键词部分插入分页符，另起一页，作第二节Graduate: Wang HuanSupervisor: Du Qin【Abstract】OBJECTIVE: To provide a method for the optimization of the preparation of different ploidy Andrographis paniculata chromosomes, and to improve the technique of three different ploidy Andrographis paniculai chromosomes. METHODS: The conventional tabletting method was used to optimize the production technology of Andrographis paniculata chromosomes, and the number of Andrographis paniculata chromosomes was studied. The effects of different reagents, pretreatment time and dissociation methods on the chromosome preparation of Andrographis paniculata were investigated. RESULTS: The best time for taking the material was 08:00-10:00; the callus of the penguin was pretreated with 0.10% colchicine solution for 2.5 h, and the best solution was obtained by dissociating the 1.0 mol·L-1 hydrochloric acid solution for 8 min under constant temperature. The number of chromosomes was n=x=24; the tip of the diploid of Andrographis paniculata was pretreated with 0.10% colchicine solution for 2 h, the solution of hydrochloric acid solution was dissociated for 12 min at a constant temperature, and the effect of hypotonic treatment for 15 min was the best. The number of chromosomes was 2n=2x. =48; Andrographis autotetraploid ex vivo material was pretreated with 0.20% colchicine solution for 4 h, hypotonic treatment for 40-60 min, and hydrochloric acid solution was dissociated for 15 min at a constant temperature. The chromosome number was 2n=4x= 96. CONCLUSIONS This experiment optimizes the different ploidy chromosome production techniques of Andrographis paniculata, and provides a reference for the later identification of Andrographis paniculata.【Keywords】Andrographis paniculata; Chromosome; Production technology前言穿心莲来源于爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata（Burm. f.）Nees，秋季茎叶茂盛时采收，具有清热凉血、解毒消肿的功效，常被用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、口舌生疮、泄泻痢疾、痈肿疮疡、蛇虫咬伤等1。穿心莲是一年生草本植物，具有抗病毒、抑制血小板聚集等药理作用，在国内外应用广泛2。穿心莲的种植主要以田间栽培为主，我国野生资源较少，而在长期人工栽培生产过程中存在品种退化、产量降低和品质下降等问题3。染色体制片技术是指通过对制片材料的合理选择、试剂的预处理，促使制片材料中的染色体解旋，进一步缩短，以去除纺锤丝的束缚，中期分裂相越多越容易观察到清晰的染色体相，最终使染色体能够随机分散，进而展平、着色，附着在载玻片上，在显微镜下可以直接观察和摄像的技术4。染色体制片技术的优点在于能使中期染色体变直、形态更清晰，经处理后随机分散，便于数目统计。穿心莲染色体属于小染色体类型，且数目多，染色体制片难度较大，给穿心莲染色体鉴定、核型分析等研究造成了很大困难5。本实验拟采用常规的压片方法去改良穿心莲染色体标本制片技术，进行穿心莲染色体制片方法优化及其染色体数量的研究。分别考察不同试剂、预处理方法以及解离时间对穿心莲染色体制片效果的影响，优化制片的关键技术。对穿心莲花药愈伤组织、二倍体、同源四倍体等材料进行制片，旨在优化穿心莲染色体制片技术。为穿心莲染色体制片优化技术提供参考依据。概述穿心莲广泛分布于热带及亚热带地区，20世纪中后期传入我国，中医学理论认为具有清热凉血、清化湿热、解毒消肿的功效6。穿心莲的价格低廉，资源丰富，药理作用显著，为民间常用药，近年来对穿心莲的研究日益广泛，相关报道也越来越多。 1 穿心莲的研究进展1.1 穿心莲的种植栽培邵艳华等7对我国穿心莲的种植情况进行了调查，发现目前穿心莲的栽培主要集中在广西、广东、福建、四川四省，其中以两广地区的栽培面积最多。穿心莲是以种子繁殖为主，但由于穿心莲种子皮厚且硬，对萌发条件要求较高，发芽受到极大的影响8，黄辰昊等9结合目前穿心莲药材研究现状，对穿心莲无公害栽培技术体系进行了研究探讨，总结了穿心莲无公害栽培技术的关键在于减少重金属、农药残留及有害元素含量。1.2 穿心莲的化学成分迄今为止，已报道的穿心莲中的化学成分有120余个，内酯型二萜类化合物近50个，其中，2015年版中国药典规定穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯为穿心莲药材的定量成分10。王国才等11从穿心莲叶中分离得到6个化合物，首次分离鉴定出-谷甾醇等；靳鑫等12从穿心莲药材中，首次分离鉴定了芹菜素-7-O-D-葡萄糖醛酸丁酯等8种化合物；徐冲等13从穿心莲根中，分离了新化合物5，5'-二羟基-7，8，2'-三甲氧基黄酮。1.3 穿心莲的药理活性穿心莲资源分布较多，价格经济，药理活性显著，受到广泛关注, 在我国被开发成多种复方和中成药，穿心莲主要的药理作用有抗炎作用14、抗菌活性15- 16、心血管活性 17-19、抗肿瘤活性20-21、抗癌作用22、抑制血小板聚集20- 24、抗病毒25-27等，药理活性报道大多围绕二萜内酯类展开，徐俊等28实验表明，穿心莲内酯可以增加小鼠皮肤或腹腔毛细血管的通透性，证明穿心莲内酯具有抗炎活性。除穿心莲内酯外，异穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯，新穿心莲内脂，脱水穿心莲内酯都有关于药理活性的报道，对比发现，异穿心莲内酯活性最强29。 2 染色体制片技术染色体制片是基因定位、原位杂交等分子遗传学研究技术的基础，也是染色体变异分析、植物核型分析等细胞学研究技术的基础，近年来，有关染色体制片技术的研究越来越多，染色体分带技术自1968年以后逐渐开始发展，使染色体研究增加了新的识别标志，这种技术使不同染色体呈现出不同的带状结构，能更加准确的识别染色体的结构及其变化30。目前，国内外对于染色体制片技术的报道主要集中于制片优化和染色体核型分析等方面的研究。尹丽莎31、林秀琴32、王芳33、孙勃34等分别对滇杨、甘蔗、高山榕、木耳菜等植物进行了染色体制片优化，进行核型分析。将植物根尖作为实验材料，不同梯度浓度的秋水仙素或8-羟基喹啉进行预处理，经过处理，染色，制片观察，最终找到最清晰的染色体像。经过多年的研究发展，染色体制片手段现在已经趋于成熟，不同倍性的植物体也大多才用与正常倍性相似的实验方法进行染色体制片。闫斌等35对穿心莲进行同源四倍体诱导，对本实验的同源四倍体材料的诱导提供了方法；李桂芬等36对多倍体西瓜染色体制片技术改良，对穿心莲的多倍体制片具有借鉴意义。华虎等37研究了植物单倍体，王立平等38对单倍体桔梗的染色体进行核型分析，对单倍体的研究有较大的价值。穿心莲的染色体小、数目众多，并伴有基因渗入现象，导致其遗传学研究滞后39，国外对穿心莲制片技术尚未有研究，陈爱葵等40报道了穿心莲染色体数量，马婷玉等41对染色体制片技术优化和核型分析进行了报道。综上所述，关于穿心莲不同倍性的染色体制片方法未见报道，故本实验研究穿心莲的制片优化方法具有一定意义，并对不同倍性有所区分。研究部分1 材料和仪器1.1 实验材料穿心莲种子购买于广东省湛江市遂溪县，经广州中医药大学杜勤教授鉴定为爵床科植物穿心莲的种子。穿心莲花药愈伤组织来自实验室组培材料，穿心莲多倍体来自实验室种植，经广州中医药大学药用植物教研室杜勤教授鉴定为爵床科植物穿心莲。1.2 实验试剂蒸馏水、改良石炭酸品红溶液（广州化学试剂厂 20161009）、秋水仙素（上海源叶生物科技有限公司）、8-羟基喹啉（Macklin）、盐酸（广州化学试剂厂）、醋酸（广州化学试剂厂 20161003-2）、无水乙醇（天津市致远化学试剂有限公司 2016121010）、卡诺氏固定液无水乙醇：醋酸（3:1）、氯化钾（国药集团化学试剂有限公司 20170526）。1.3 实验仪器XS125A电子分析天平（瑞士Sartorius公司）、光学显微镜（NIKON YS100）、镊子、载玻片、盖玻片、恒温水浴锅、温度计。2 实验方法2.1 穿心莲花药愈伤组织的染色体制片优化2.1.1 取材选取幼嫩部分（颜色黄白色或浅绿色、质地疏松）的穿心莲花药愈伤组织。2.1.2 预处理将选取的穿心莲花药愈伤组织，切取大小约0.3×0.3 cm的小块，置于5种预处理液中进行预处理（见表2），分别在冰箱4暗处理1.5、2、2.5 h，每个操作步骤之间用蒸馏水漂洗5次，每次3min。表1：穿心莲花药愈伤组织预处理溶剂组别预处理溶液10.05%秋水仙素溶液20.10%秋水仙素溶液30.001 molL-18-羟基喹啉溶液40.002 molL-18-羟基喹啉溶液50.10%秋水仙素溶液、0.002 molL-18-羟基喹啉11混合液2.1.3 材料的固定将预处理好的根尖材料转入配置好的卡诺固定液中，冰箱4 暗处理24 h以上。卡诺氏固定液的作用在于可以迅速杀死细胞，使材料中的蛋白质变性以及沉淀，细胞经固定后，能保持在有丝分裂相，同时保持其染色体本身的形态和结构；另外，卡诺氏固定液还有增加细胞膜的通透性的作用，染色剂进入细胞易着色。2.1.4 解离取固定好的根尖，用50%无水乙醇处理10 min，转入1 mol·L-1盐酸溶液中，60 恒温水浴解离，分别解离8、10、12 min。盐酸解离能使植物细胞的细胞壁软化，促使细胞间的中胶层物质溶解，在压片过程中使分生区细胞更加分散。2.1.5 染色取解离好的材料放在载玻片上，用改良石炭酸品红染色液染色，漂洗压片，显微镜镜检，拍照记录。2.1.6 取材时间比较根据以上实验选取最优实验条件，分别处理选材时间为8：00-10：00、12：00-14：00、16：00-18：00，3个时间段的花药愈伤组织。显微镜镜检。2.2 穿心莲二倍体的染色体制片优化2.2.1 种子萌发挑选穿心莲成熟饱满的种子，2%次氯酸钠溶液灭菌5 min，蒸馏水冲洗20 min后放在恒温培养箱中28 恒温培养，待其萌发出根尖，长至0.8 cm-1.2 cm时可选为供试材料。2.2.2 预处理将穿心莲成熟种子萌发出的根尖（新生长部分），取切长约0.8 cm-1.2cm，用蒸馏水洗干净后，置于6种预处理液中进行预处理（见表2），分别在冰箱4暗处理1、2、3 h。表2：穿心莲二倍体预处理溶液组别预处理溶液10.10%秋水仙素溶液20.20%秋水仙素溶液30.001 molL-18-羟基喹啉溶液40.002 molL-18-羟基喹啉溶液50.10%秋水仙素溶液、0.002 molL-18-羟基喹啉11混合液6饱和对二氟苯溶液2.2.3 材料的固定 将预处理好的根尖材料转入卡诺氏固定液中固定24 h以上，冰箱4暗处理。2.2.4 解离取固定好的根尖，转入1 mol·L-1盐酸溶液中60 恒温水浴解离，分别解离8、12、15 min。2.2.5 低渗处理 将解离后的根尖转入0.075 mol·L-1 KCL溶液低渗处理15 min，低渗处理的作用是使细胞膨大，染色体更加分散。85%无水乙醇室温处理5 min。2.2.6 染色蒸馏水冲洗干净后，取低渗处理好的材料0.1 cm-0.2 cm的分生区染色压片，显微镜镜检，拍照记录。2.2.7 取材时间比较根据以上实验选取最优实验条件，分别处理选材时间为8：00-10：00、12：00-14：00、16：00-18：00，3个时间段的新萌发根尖。显微镜镜检。2.3穿心莲同源四倍体的染色体制片优化2.3.1 种子萌发挑选穿心莲成熟饱满的种子，待萌发出根尖长至0.1 cm-0.3 cm长度时，每隔24 h滴加0.20%秋水仙素溶液进行诱导加倍。2.3.2 预处理将穿心莲同源四倍体诱导出的根尖，取切长约0.4 cm-0.8 cm，用蒸馏水洗干净后，置于4种预处理液中进行预处理（见表3），分别在冰箱4 暗处理2、3、4 h。表3：穿心莲同源四倍体预处理溶液组别预处理溶液10.20%秋水仙素溶液20.003 molL-18羟基喹啉30.20%秋水仙素溶液、0.002 molL-18-羟基喹啉11混合液40.002 molL-18-羟基喹啉溶液、饱和对二氟苯溶液1：1混合液2.3.3 低渗处理室温下，用0.075 mol·L-1氯化钾溶液低渗处理40-60 min，再经85%无水乙醇处理2-3 min，此处为前低渗处理。2.3.4 材料的固定 用卡诺氏固定液将预处理过的根尖材料固定24 h以上，冰箱4 暗处理。2.3.5 解离取固定好的根尖，于60 恒温水浴中进行酸解，分别处理10、12、15 min。2.3.6 染色取解离好的材料放在载玻片上，放在低倍显微镜下观察，只留取0.1-0.2 cm的分生组织，染色后制片，显微镜观察，拍照记录。2.3.7 取材时间比较根据以上实验选取最优实验条件，分别处理选材时间为8：00-10：00、12：00-14：00、16：00-18：00，3个时间段的加倍根尖。显微镜镜检。3 实验结果3.1 穿心莲花药愈伤组织的染色体观察3.1.1 预处理液比较将穿心莲花药愈伤组织用下面5种预处理液中进行预处理： 0.05%、0.10%的秋水仙素溶液；0.001 mol·L-1、0.002 mol·L-1的8-羟基喹啉溶液；0.10%秋水仙素溶液、0.002 mol·L-18-羟基喹啉11混合液。BCADE图1：不同预处理液处理后的穿心莲花药愈伤组织染色体（1000×）A.0.05%秋水仙素溶液（2.5 h）；B.0.10%秋水仙素溶液（2.5 h）；C.0.001 molL-18-羟基喹啉溶液(2.5 h)；D.0.002 molL-18-羟基喹啉溶液处理（2.5 h）；E.0.1%秋水仙素溶液、0.002 molL-18-羟基喹啉11混合液处理（2.5 h）对不同预处理液处理后的穿心莲花药愈伤组织染色体进行比较，由图1可知，用0.05%秋水仙素溶液处理2.5 h，染色体还未分散，分离不明显，不利于穿心莲花药愈伤组织染色体的计数；用0.10%秋水仙素溶液处理2.5 h，染色体较为清晰，较为均匀的分布在细胞中，但有拖尾现象，是较为适合染色体计数的预处理条件；0.001 mol·L-18-羟基喹啉溶液处理2.5 h后，染色体有明显堆叠，呈核状，未完全分散；用0.002 mol·L-18-羟基喹啉溶液处理2.5 h后，染色体仍有堆叠，部分散落聚缩呈点状；0.10%秋水仙素溶液、0.002 mol·L-18-羟基喹啉11混合液处理后，染色体分离明显，但聚集严重，容易产生堆叠拖尾的现象。综上所述，穿心莲花药愈伤组织染色体以0.10%秋水仙素溶液处理2.5 h效果最佳。3.1.2 预处理时间比较将穿心莲花药愈伤组织幼嫩部分，分别在冰箱4以0.10%秋水仙素溶液暗处理1.5、2、2.5 h。CBA图2：不同预处理时间处理后的穿心莲花药愈伤组织染色体（1000×）A.1.5 h B. 2 h C. 2.5 h对不同预处理时间处理后的穿心莲花药愈伤组织染色体进行对比分析，由图2可知，经0.10%秋水仙素溶液预处理过后，处理1.5 h，染色体明显仍聚集呈核为未解旋状态，处理2 h，染色体刚刚开始分散，稍有模糊，容易出现堆叠拖尾的现象，处理2.5 h观察效果为最佳，可清晰观察到染色头的数目和形态。3.1.3 解离条件的比较将固定好的根尖转入1 mol·L-1盐酸溶液中，60 恒温水浴解离，分别解离8、10、12 min。CBA图3：不同解离时间处理后的穿心莲染色体（×1000）A.8 min B. 10min C.12 min由图3可知，比较视野中中期分裂相细胞的平均数量和染色体的聚缩程度发现，解离8 min，此时，细胞壁完全脱落，细胞分散性最好；解离10 min的花药愈伤组织细胞明显膨大，周围可见破碎的细胞，不易染色；解离12 min的花药愈伤组织细胞有明显破裂，可见细胞外有明显的细胞内含物，解离时间长使材料过度软化不易染色，细胞易破裂。3.2 穿心莲二倍体的染色体观察3.2.1 预处理液和预处理时间比较将穿心莲二倍体根尖下面6种预处理液中进行预处理：0.10%、0.20%的秋水仙素溶液； 0.001 mol·L-1、0.002 mol·L-1的8-羟基喹啉溶液；0.10%秋水仙素溶液、0.002 mol·L-18-羟基喹啉11混合溶液；饱和对二氟苯溶液，分别在冰箱4暗处理1、2、3 h。CBA FEDIHGLKJ图4：不同处理溶液处理后的穿心莲二倍体染色体（1000×）A.0.10%秋水仙素溶液（1.5 h)；B.0.10%秋水仙素溶液（2 h）； C.0.10%秋水仙素溶液(2.5 h)；D.0.20%秋水仙素溶液(1.5 h)；E.0.20%秋水仙素溶液(2 h)；F.0.001 molL-18-羟基喹啉溶液(2 h)；G.0.001 molL-18-羟基喹啉溶液(3 h)； H.0.002 molL-18-羟基喹啉溶液(2 h)； I. 0.002 molL-18-羟基喹啉溶液(2.5 h)； J. 0.002 molL-18-羟基喹啉溶液(3 h)；K. 0.1%秋水仙素溶液、0.002 molL-18-羟基喹啉11混合液(2 h)；L.饱和对二氟苯溶液(2 h)表4：不同处理溶液处理后的穿心莲二倍体染色体聚缩程度1 h2 h3 h0.1%秋水仙素溶液伸长伸长伸长0.2%秋水仙素溶液伸长较伸长伸长0.001 molL-18-羟基喹啉溶液伸长伸长适中0.002 molL-18-羟基喹啉溶液伸长聚缩聚缩0.10%秋水仙素溶液、0.002 molL-18-羟基喹啉11混合液伸长较伸长伸长饱和对二氟苯溶液严重聚缩严重聚缩严重聚缩由图4和表4可知，染色体中期分裂相的数量随处理时间先增加后减少，染色体长度会变得更加聚缩，染色体的长度会随预处理时间的延长而变短。有图4的染色体情况可知，0.10%秋水仙素溶液处理1.5 h，染色体不够分离，容易产生堆叠拖尾的现象，不利于穿心莲染色体的计数；处理2 h，染色体较为清晰，可以看到明显的分布在细胞中，是较为理想的处理条件；处理2.5 h，染色体分散较为明显，但细胞有变形现象，染色体拖尾严重；0.20%秋水仙素溶液处理1.5 h，可观察到染色体有分离但分离不明显，而且有拖尾现象；处理2 h，染色体明显分离，但有明显的拖尾现象；0.001 mol·L-18-羟基喹啉溶液处理2h，可观察到染色体有分离，但是处理时间或者浓度还不够；处理3 h，染色体有明显分离，但是有聚缩现象，观察较困难；0.002 mol·L-18-羟基喹啉溶液处理2 h，可观察到染色体有分离，但聚缩明显；处理2.5 h，染色体仍有聚缩现象；处理3 h，染色体出现重叠，拖尾现象；0.10%秋水仙素溶液、0.002 mol·L-18-羟基喹啉11混合液处理2 h，制片效果较好，染色体容易观察，但重叠现象严重；饱和对二氟苯溶液处理2 h，效果较差，细胞核明显，另用饱和对二氟苯溶液以其他时间段处理，仍难以观察到解旋后的染色体，处理效果不明显。6种预处理液的处理效果从优到劣依次为0.10% 秋水仙素溶液 0.20% 秋水仙素溶液 0.10% 秋水仙素、0.002 mol·L-18-羟基喹啉11混合液0.002 mol·L-1 8-羟基喹啉溶液0.001 mol·L-1 8-羟基喹啉溶液饱和对二氟苯溶液。3.2.2 解离时间比较取固定好的根尖，转入1 mol·L-1盐酸溶液中60 恒温水浴解离，分别解离8、12、15 min。CBA图5：不同解离时间处理后的穿心莲二倍体染色体（1000×）A.8 min B.12 min C.15 min由图5可知，盐酸解离8 min，解离时间稍短，胚根根尖软化程度不够，分生区细胞呈条状排列紧密，染色体呈团状，压片时难以使其分散；解离12 min，压片时细胞分散性最好，染色体随机分散在细胞中，较容易观察；解离15 min，可观察到因解离时间过长，细胞过度软化，里面的染色体呈条状，染色不均匀，可观察有细胞破裂，染色体分散过度，不利于统计。3.3 穿心莲同源四倍体的染色体观察3.3.1 预处理液和预处理时间比较将穿心莲同源四倍体根尖置于4种预处理液中进行预处理：0.20%秋水仙素溶液、0.003 mol·L-18羟基喹啉、0.20%秋水仙素溶液、0.002 mol·L-18-羟基喹啉11混合液、0.002 mol·L-18-羟基喹啉溶液、饱和对二氟苯溶液1：1混合液，分别在冰箱4 暗处理2、3、4 h。DCBA图6：不同预处理液处理后的同源四倍体染色体（1000×）A.0.20%秋水仙素溶液（4 h）；B.0.003molL-18羟基喹啉(4 h)C. 0.20%秋水仙素溶液+0.002 molL-18-羟基喹啉(4 h)D. 0.002 molL-18-羟基喹啉溶液、饱和对二氟苯1：1混合液（4 h）穿心莲同源四倍体，由于是用萌发的根尖再滴加0.20%秋水仙素进行加倍，根尖中出现大量的后含物，又因染色体数量多，容易相互重叠，难分布在一个平面上，得到可以计数的细胞并不多。从图6中可以观察到，在同一视野中，穿心莲同源四倍体的细胞偏大，细胞核较小。0.20%秋水仙素溶液处理4 h，重复性高，可观察到有染色体分散，呈点状，形态较模糊；0.003 mol·L-18羟基喹啉处理4 h，可观察到未分散的细胞核；0.20%秋水仙素溶液、0.002 mol·L-18-羟基喹啉1：1混合液处理4 h，可见分散的染色体，但细胞后含物较为丰富，遮挡在染色体上方，影响染色体的观察；同样浓度的8-羟基喹啉溶液和饱和对二氟苯1：1混合处理穿心莲同源四倍体4 h，染色体重叠严重，细胞后含物明显。3.3.2 解离时间比较穿心莲同源四倍体的在前期进行处理的时候，可采用前低渗的方法，使细胞膨大，但解离时间较难把握，解离15 min的效果相对较好，但染色体着色困难。3.4 取材时间比较根据上述实验结果得出的最优处理方法，分别处理选材时间为8：00-10：00、12：00-14：00、16：00-18：00，3个时间段的萌发根尖。实验结果表明，三个时间段都可以观察到中期分裂相细胞，皆可作为穿心莲染色体制片观察的取材时间，但8：00-10：00时间段的中期分裂相细胞较多，染色体的数量和形态更容易观察，为较佳的取材时间。4 讨论实验结果表明，穿心莲花药愈伤组织、二倍体、同源四倍体在08:00-10:00取材较佳，花药愈伤组织以0.10%秋水仙素溶液作为预处理液，预处理2.5 h，在1.0 mol·L-1盐酸溶液中于60 恒温解离8 min效果最佳；穿心莲二倍体中，用0.10%秋水仙素溶液预处理2 h，盐酸解离10 min，0.075 mol·L-1的KCL溶液低渗15 min处理效果最佳；穿心莲同源四倍体以0.20%秋水仙素溶液作为预处理液，预处理4 h，氯化钾溶液室温处理40-60 min，在盐酸60 恒温解离15 min效果较好。 穿心莲染色体的数目为花药愈伤组织n=x=24、二倍体2n=2x=48、同源四倍体2n=4x=96，穿心莲花药愈伤组织染色体为穿心莲二倍体植株的1/2，即为穿心莲单倍体；穿心莲同源四倍体经诱导加倍后的根尖染色体数目为二倍体根尖的2倍。穿心莲作为一种小核、染色体数目多的植物，优化后得到的穿心莲染色体制片条件适用于正常的穿心莲二倍体，但穿心莲花药愈伤组织细胞核减半后更小，细胞也相对变小，在油镜下更难以观察，组织培养后得到的穿心莲花药愈伤组织，细胞壁更薄，细胞更容易破裂；花药愈伤组织里仍有发育积累的细胞内含物，有条件的话最好选择愈伤组织分化出的根尖作为材料；穿心莲同源四倍体，由于植株已经成熟，根尖加倍后容易积累有大量的后含物，这在穿心莲二倍体根尖细胞中是很少出现的，多倍体诱导的时间最好不超过72小时，同时，穿心莲染色体加倍后染色体更多，容易相互重叠，得到可以计数的细胞并不多。在之后的研究中，同源四倍体穿心莲的根尖可以通过后低渗处理再进行染色，除去后含物的干扰，在预处理的试剂上更多尝试，更利于染色体的计数和观察。在实验过程中，对预处理试剂、时间的试验还不丰富；大量出现影响染色体制片效果的细胞后含物的问题未完全解决，只能选取幼嫩的实验材料来尽量避免；染色剂只采用了改良石炭酸品红溶液，还可以尝试用席夫试剂染色，染色效果会更加立体；压片技术尚不成熟，当酸解和软化程度不够时，利用压片技术使细胞分散就很重要了，要尽量使分生区细胞呈单个细胞状态。穿心莲单倍体、同源四倍体的染色体制片技术有待进一步研究。【参考文献】1国家药典委员会.中国人民共和国药典.一部M.北京:中国医药科技出版社,2015:268.2贺红,李郁茹,黄昌杰,刘昌辉,徐鸿华.穿心莲离体培养与快速繁殖的研究J.中医药学刊,2004(03):415-416.3黄辰昊,薛建平,王振,何瑞,孙伟,李志勇.南药大品种穿心莲无公害栽培技术体系探讨J.世界科学技术中医药现代化,2018,20(11):2095-2100.4杨起简,周禾,孙彦等.豌豆染色体制片技术的比较研究J.北京农学院学报,2003,18(3):172173.5朱澂.植物染色体及染色体技术M.北京：科学出版社,1982.6谢璇,任莹璐,张惠敏.穿心莲内酯的药理作用和应用研究进展J.中西医结合心脑血管病杂志2018,16(19)2810-2812.7邵艳华,王建刚,吴向维,丁平,赖小平.穿心莲种质资源调查研究J.中国现代中药,2013,15(02):112-117.8陈荣珠.药用植物穿心莲无菌外植体建立及无性繁殖J.福建热作科技,2017,42(02):23-26.9黄辰昊,薛建平,王振,何瑞,孙伟,李志勇.南药大品种穿心莲无公害栽培技术体系探讨J.世界科学技术-中医药现代化,2018,20(11):2095-2100.10张晓,唐力英,吴宏伟.穿心莲现代研究进展J.中国实验方剂学杂志,2018,24(18):222-234.11王国才,胡永美,张晓琦等.穿心莲的化学成分J.中国药科大学学报,2005,36(5) 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