化妆品中11种二苯酮类紫外线吸收剂的检测方法.doc

附件2：化妆品中11种二苯酮类紫外线吸收剂的检测方法(征求意见稿)1 适用范围本方法规定了化妆品中11 种二苯酮类紫外线吸收剂测定的高效液相色谱法。本方法适用于膏霜类、乳液类、水剂类、唇膏等蜡基类、指甲油类、粉类等化妆品中11 种二苯酮类紫外线吸收剂的含量测定。本方法对11 种二苯酮类紫外线吸收剂的检出限和定量限及称取0.1 g样品，定容体积为10 mL时的检出浓度及最低定量浓度见表1：表1 11种二苯酮类紫外线吸收剂的检出限、检出浓度、定量下限、最低定量浓度序号化合物名称检出限(g /mL)检出浓度(g/g)定量下限(g /mL)最低定量浓度(g/g)1二苯酮-10.0454.50.15152二苯酮-20.0454.50.15153二苯酮-30.0606.00.20204二苯酮-4/50.020200.70705二苯酮-60.0606.00.20206二苯酮-70.30301.01007二苯酮-80.0454.50.15158二苯酮-90.0454.50.15159二苯酮-100.0606.00.202010二苯酮-120.0808.00.27272方法提要采用四氢呋喃-甲醇-水体系，以适当比例的3种溶剂为提取溶剂，提取化妆品中二苯酮类紫外线吸收剂，用高效液相色谱法进行测定。以目标物的色谱保留时间和紫外光谱图与标准物质一致进行定性，以色谱峰的峰面积用标准曲线外标法进行定量计算。必要时，采用高效液相色谱-质谱方法（HPLC-MS/MS）进行确证。3 试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为超纯水。3.1 标准物质英文名称、CAS号、分子式、分子结构式、分子量、纯度见附录A3.2甲醇，色谱纯。3.3甲酸，色谱纯。3.4 醋酸铵，色谱纯。 3.5标准储备溶液：分别准确称取各标准物质100 mg（以上质量均精确至0.1 mg）于棕色容量瓶中，用四氢呋喃溶解后定容至10 mL（二苯酮-9除外），配置成浓度为10 mg/mL的标准储备液于冷藏条件下保存。二苯酮-9用40%甲醇水定容至10 mL，配置成浓度为10 mg/mL的标准储备液于冷藏条件下保存。所有储备液的保存期为3个月。4仪器和设备4.1 高效液相色谱仪，具有二极管阵列检测器。4.2 高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪 配置ESI离子源（确证时使用）。4.3 超声波清洗器.4.4 蜗旋混合器。4.5 离心机。4.6 分析天平：感量分别为0.1 mg和0.01 mg。5分析步骤5.1 样品预处理5.1.1 二苯酮-9测试的样品前处理称取样品约0.1 g（精确至0.001g）于25 mL离心管中，对水易分散的化妆品，首先向离心管中准确加入10 mL水，涡旋或超声使其均匀分散后，再向离心管中加入4 mL二氯甲烷，涡旋12 min混匀，然后于5000 转/分离心5 min，取上层溶液2 mL，经微孔滤膜过滤后，待测。对水不易分散的化妆品，首先向离心管中加入4 mL二氯甲烷，涡旋或超声使其均匀分散后，再向离心管中准确加入10 mL水，涡旋12 min，混匀提取，然后于5000 转/分离心5 min，其他步骤与上面相同。5.1.2 除二苯酮-9外其他二苯酮类防晒剂测试的样品前处理称取样品约0.1 g（精确至0.001g）于25 mL具塞刻度试管中，向试管中加入2 mL四氢呋喃，涡旋混匀提取，再向试管中加入75%甲醇水溶液定容至10 mL，涡旋12 min，然后于5000 转/分离心5 min，取2 mL混合溶液，经聚丙烯微孔滤膜过滤后，待测。对唇膏等蜡基化妆品，首先向试管中加入2 mL四氢呋喃，涡旋或超声使样品完全分散。若不能分散一般适当超声可解决问题，对超声15 min仍无法分散的样品，需用60 水浴，振荡加热约12 分钟即可溶解分散。继续向试管中加入75%甲醇水溶液定容至10 mL，涡旋混合，然后于5000 转/分离心5 min，其他步骤与上面相同。5.2 分析步骤5.2.1 色谱参考条件色谱柱： C18柱（4.6 mm×150 mm ，5 m）；流动相：A：水溶液 (含0.1% 甲酸及10 mM乙酸铵), B：甲醇(含0.1%甲酸)；流量：1.0 mL/min；检测波长：311 nm；柱温：25；进样量：10 L。梯度洗脱条件：表2二苯酮类紫外线吸收剂的液相色谱分离条件时间，minA，%B，% 0946360404406011010013010019946209465.2.2 校准曲线的制备分别准确移取各标准储备液（二苯酮-9除外）200 L于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配置成200 g/mL的混合标准溶液，取适量混合标准溶液，再用甲醇逐级稀释成100 g/mL，50 g/mL，10 g/mL，5 g/mL， 1 g/mL的系列，构成6个浓度的混合标准系列，标准系列应于使用前配制。二苯酮-9采用上述方法以水为溶剂进行系列浓度配制。移取10 L系列标准溶液进行数据采集，以系列标准溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立校准曲线。5.2.3 样品测定在设定色谱条件下，移取10 L待测溶液进行高效液相色谱分析。在相同的液相色谱条件下获得的样品溶液的液相色谱分离谱图与标准物质的液相色谱分离谱图进行比较，若样品谱图中存在保留时间与某标准物质的保留时间一致的色谱峰，并且其扣除背景后的紫外吸收图谱与该标准物质的紫外吸收图谱一致，则可确认样品中存在该物质。确证后，样品溶液中目标物的含量，用标准曲线外标法确定。若待测溶液中目标物的质量浓度超过校准曲线线性范围的上限，须对待测液进行适当稀释后重新测定。化妆品样品中目标物的含量则按“7”项下计算公式计算。6 平行实验 按以上步骤，完成两份样品的平行测定。在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两次测定值的算术平均值的10%。7 结果计算式中：从标准曲线中计算出的样品溶液中目标物的质量浓度，g/mL； V样品定容积，mL； m称取样品的质量，g。 稀释倍数（不稀释则取1）计算结果保留三位有效数字。8 回收率和精密度经多家实验室验证，加标水平在0.520 g/g范围内，11种二苯酮类紫外吸收剂的方法回收率在85%110% 之间，相对标准偏差在0.1%5%（n=6）之间。9色谱图图1二苯酮类紫外吸收剂混合标准溶液液相色谱谱图对应峰号： 、二苯酮-9；、二苯酮-2；、二苯酮-4/5；、二苯酮-1；、二苯酮-8； 、二苯酮-6；、二苯酮-3；、二苯酮-7；、二苯酮-10；10、二苯酮-1210 质谱确证在相同的实验条件下，如果检出的色谱峰的保留时间和紫外光谱图与对照品一致，且保留时间与试样添加对照品的色谱峰保留时间比较，相对误差在±2%内，则可认为试样中含有二苯酮类紫外线吸收剂成分。必要时，可采用液相色谱串联质谱法进行确证。质谱参考条件：离子源：电喷雾离子源（ESI源）。离子化模式：正离子监测模式（ESI+）和负离子检测模式（ESI-）。扫描方式：多反应监测（MRM）。其他参考质谱条件见附录B和C资料性附录二苯酮类紫外吸收剂成分信息表名称CAS结构式分子式分子量纯度二苯酮-1131-56-6C13H10O3214.2295%二苯酮-2131-55-5C13H10O5246.22二苯酮-3131-57-7C14H12O3228.25二苯酮-4/54065-45-6C14H12O6S.xH2O308.31二苯酮-6131-54-4C15H14O5274.26二苯酮-785-19-8C13H9ClO2232.66二苯酮-8131-53-3C14H12O4244.24二苯酮-976656-36-5C15H14O11S2.2Na480.37二苯酮-101641-17-4C15H14O3242.28二苯酮-121843-05-6C21H26O3326.436资料性附录B参考质谱条件a) 去溶剂温度（TEM）：600b) 离子源电压（IS）：4500V。c) 碰撞气（CAD）：mediumd) 气帘气（CUR）：20psie) 雾化气（GS1）：50psif) 辅助气（GS2）：50psig) 其他质谱参数见表B表B 11种二苯酮类紫外线吸收剂成分的主要参考质谱参数化合物母离子(m/z)子离子(m/z)碰撞电压(eV)驻留时间(ms)离子化模式去簇电压DP(V)二苯酮-1213.0134.828150ESI-100169.026150100二苯酮-2244.9134.922150ESI-80109.02815080二苯酮-3229.0151.032150ESI+100105.024150100二苯酮-4/5307.0211.047150ESI-100182.039150100二苯酮-6273.0123.022150ESI-100108.049150100二苯酮-7231.0121.030150ESI-10077.036150100二苯酮-8243.0123.023150ESI-10093.027150100二苯酮-9216.1203.118150ESI-60188.02615060二苯酮-10243.0151.025150ESI+100119.028150100二苯酮-12327.2215.028150ESI+100137.037150100对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前将质谱参数优化到最佳。注：所列参考质谱条件是在AB Sciex QTRAP 5500型质谱仪器上完成，此处列出实验仪器型号仅为提供参考，并不涉及商业目的。资料性附录C多反应监测（MRM）色谱图二苯酮-10二苯酮-3二苯酮-1二苯酮-12二苯酮-9二苯酮-8二苯酮-7二苯酮-6二苯酮-4/5二苯酮-2色谱条件同文本方法色谱柱：C18（4.6×50mm，1.8µm）8化妆品中11种二苯酮类紫外线吸收剂的检测方法起草说明为加强化妆品中限用物质的监督管理，国家食品药品监督管理局委托辽宁省食品药品监督管理局所开展化妆品中二苯酮类紫外吸收剂的检测方法建立和验证工作，现就起草工作有关情况说明如下：1 起草的必要性二苯酮类紫外线吸收剂是一类具有紫外吸收功能的高分子材料，由于其最大吸收波长在330 nm，同时具有防长波(UVA )、中波紫外线(UVB)的功能，在国内外均为常用防晒剂。然而二苯酮类紫外线吸收剂在使用中会存在诸多问题，首先就是二苯酮类是芳香酮类，产生的副产物无法在体内新陈代谢；其次，二苯酮类在化妆品的添加中比较难以处理和增溶；第三，虽然二苯酮类具有UVA的吸收能力，但是较弱，特别是在不同的溶剂中表现出不同的吸收能力，在产品配伍方面要求较高。在我国2007 年出版的化妆品卫生规范规定的26 种紫外吸收剂中二苯酮3和二苯酮4/5的限用量为10%和5%。目前，在化妆品卫生规范（2007）中除二苯酮-3及二苯酮4和5是作为限用防晒剂出现的，卫生规范中并未涉及其他几种二苯酮类紫外线吸收剂，但在化妆品实际生产中二苯酮-1，二苯酮-2，二苯酮-9等多种二苯酮类紫外线吸收剂均有较广泛的应用。而目前的标准检测方法中尚未涉及这些防晒剂的检测，为加强对这类防晒剂的监管，国家食药局出台了化妆品中二苯酮-2的检测方法，方法仅涉及二苯酮-2的检测，并未涉及其他二苯酮类防晒剂。为保证化妆品的安全性，保障消费者的人身安全，同时考虑到方法使用的便利性，二苯酮类紫外线吸收剂作为一大类有明确功效的化妆品成分，开展多组分同时测定的定性定量检测方法研究十分必要。2 起草原则该方法起草遵循了以下4项原则：（1）检测方法应具备先进性与可操作性强的特点（2）检测方法应尽量覆盖所有防晒类化妆品（3）应尽量优化样品前处理及分析测试条件，使方法对色谱柱及色谱仪的损害降到最低，方法具有可行性。（4）检测方法应兼顾日常检测和方法确证的需要。3 起草过程国家食品药品监督管理局于2011年12月委托辽宁省食品药品监督管理局开展化妆品中二苯酮类紫外吸收剂的检测方法建立和验证工作。我们通过查阅国内外相关文献资料，进行了大量的方法实验研究和样品前处理研究，建立起了化妆品中11种二苯酮类紫外线吸收剂的检测方法。通过大量的样品检测和多家检验机构验证，最终形成了化妆品中11种二苯酮类紫外线吸收剂的检测方法研究报告。4 重点说明的问题 （1）关于体例。本检测方法的体例主要参照化妆品卫生规范（2007年版）的卫生化学检验方法的体例，便于化妆品检验领域相关人员的阅读和实际操作。 （2）关于检测方法的建立和验证。通过对色谱分离条件的优化研究，以及样品前处理方法的研究，建立了化妆品中的11种二苯酮类紫外线吸收剂的检测方法。方法简单、实用性较强，有利于方法的推广应用。项目中11种二苯酮类紫外线吸收剂成分方法回收率在85%110% 之间，相对标准偏差在0.1%5.0%（n=7）之间，在0.1 mg/g20 mg/g 的浓度范围内线性关系良好（r0.99），基本满足分析检测要求。三家实验室验证结果表明，校准曲线、检出限、精密度、回收率等指标符合检测要求。 化妆品中11种二苯酮类紫外线吸收剂的检测方法编制说明 1 任务来源为加强化妆品中限用物质的监督管理，国家食品药品监督管理局委托辽宁省食品药品监督管理局开展化妆品中二苯酮和甲氧基肉桂酸乙基己酯的检测方法建立和验证工作。在中期汇报中，在与会专家和领导的指导下，建议开展二苯酮类紫外吸收剂的检测方法建立和验证工作，以此为出发点，我们开展了化妆品中11种二苯酮类紫外吸收剂的检测方法研究，建立了化妆品中11种二苯酮类紫外吸收剂成分的快速、准确、灵敏的色谱检测方法。2 研究背景二苯酮类紫外线吸收剂是一类具有紫外吸收功能的高分子材料，由于其最大吸收波长在330 nm，同时具有防长波(UVA )、中波紫外线(UVB)的功能，在国内外均为常用防晒剂。然而二苯酮类紫外线吸收剂在使用中会存在诸多问题，首先就是二苯酮类是芳香酮类，产生的副产物无法在体内新陈代谢；其次，二苯酮类在化妆品的添加中比较难以处理和增溶；第三，虽然二苯酮类具有UVA的吸收能力，但是较弱，特别是在不同的溶剂中表现出不同的吸收能力，在产品配伍方面要求较高。在我国2007 年出版的化妆品卫生规范规定的26 种紫外吸收剂中二苯酮3和二苯酮4/5的限用量为10%和5%。目前，在化妆品卫生规范（2007）中除二苯酮-3及二苯酮4和5是作为限用防晒剂出现的，卫生规范中并未涉及其他几种二苯酮类紫外线吸收剂，但在化妆品实际生产中二苯酮-1，二苯酮-2，二苯酮-9等多种二苯酮类紫外线吸收剂均有较广泛的应用。而目前的标准检测方法中尚未涉及这些防晒剂的检测，为加强对这类防晒剂的监管，国家食药局出台了化妆品中二苯酮-2的检测方法，方法仅涉及二苯酮-2的检测，并未涉及其他二苯酮类防晒剂。为保证化妆品的安全性，保障消费者的人身安全，同时考虑到方法使用的便利性，二苯酮类紫外线吸收剂作为一大类有明确功效的化妆品成分，开展多组分同时测定的定性定量检测方法研究十分必要。3 研究现状目前在化妆品卫生规范( 2007 )给出化学防晒剂的检测方法中，只推荐了3种二苯酮类紫外线吸收剂的定量检测方法，尚存在诸多其它二苯酮类紫外线吸收剂的检测空白，急需建立相应的方法。根据二苯酮类化合物的结构和性质，液相色谱是比较合适的检测手段，而针对化妆品卫生规范( 2007 ) 中所涉及的二苯酮3和二苯酮4/5三种紫外线吸收剂的液相色谱检测方法尚存在的一些不足，该方法中高氯酸和四氢呋喃通常作为流动相组成成分。高氯酸为强酸，对色谱柱的伤害很大。四氢呋喃具有明显的化学不稳定性，容易造成色谱系统的不稳定，导致峰拖尾、裂分和新峰的产生，这些影响了该方法的适用性。因此根据二苯酮类化合物的结构和性质特征，发展一种适合多种二苯酮类化合物的检测方法非常有必要。本项目拟采用高效液相色谱法，开展化妆品中11种二苯酮类紫外线吸收剂成分的检测方法研究，建立多种二苯酮类紫外吸收剂的快速、准确、灵敏的色谱检测方法，为化妆品监管提供良好的技术支持。4 项目完成情况 （1）发展了膏霜类、乳液类、水剂类、唇膏等蜡基类、指甲油类、粉类等化妆品中11种二苯酮类紫外线吸收剂的高效液相色谱检测方法。本项目中11种二苯酮类紫外线吸收剂成分方法回收率在85%110% 之间，相对标准偏差在0.1%5.0%（n=7）之间，在0.1 mg/g20 mg/g 的浓度范围内线性关系良好（r0.99），基本满足分析检测要求。（2）本方法负责起草单位为大连市产品质量监督检验所，参与验证单位分别是中国检验检疫科学研究院，北京市产品质量监督检验所，大连市疾病预防控制中心。本方法主要起草人为毛希琴、曲宝成、边海涛。验证结果满足化妆品及其原料中禁限用物质检测方法验证技术规范5 方法概述5.1 仪器Agilent 公司Agilent1260高效液相色谱仪。超声波清洗器。蜗旋混合器。离心机。5.2 试剂二苯酮类标准品：二苯酮-2、二苯酮-7 (International Laboratory USA )二苯酮-1、二苯酮-8、二苯酮-12(Aladin Chemistry Co. Ltd)二苯酮-4及其盐、二苯酮-6 (Acros Organics Europe) 二苯酮-3 (TCI 上海)二苯酮-9 (恒桥产业股份有限公司 南京)二苯酮-10 (Alfa Aesar UK) 上述试剂纯度都大于95%。5.3 方法5.3.1 色谱条件色谱柱：Diamonsil - C18柱，5m，4.6mm×150mm。流动相A：水（含0.1%甲酸和10mM醋酸铵）；流动相B：甲醇（含0.1%甲酸）。流量：1.0 mL/min。检测器：二极管阵列检测器，检测波长为311 nm。柱温：25 。5.3.2 标准溶液的配制 标准储备溶液：分别准确称取各标准物质100 mg（以上质量均精确至0.1 mg）于棕色容量瓶中，用四氢呋喃溶解后定容至10 mL（二苯酮-9除外），配置成浓度为10 mg/mL的标准储备液于冷藏条件下保存。实验中选取40%甲醇水作为溶剂将100 mg二苯酮-9定容至10 mL，配置成浓度为10 mg/mL的标准储备液于冷藏条件下保存。准确移取标准储备液（二苯酮-9除外）于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配置成200 g/mL的混合标准溶液，取适量混合标准溶液，再用甲醇逐级稀释成100 g/mL，50 g/mL，10 g/mL，5 g/mL，1 g/mL的系列，构成6个浓度的混合标准系列，标准系列应于使用前配制。各标准系列按10 L进样量进行数据采集，用于高效液相色谱法的标准曲线的绘制。二苯酮-9采用上述方法以水为溶剂进行系列浓度配制。5.3.3样品预处理5.3.3.1 二苯酮-9测试的样品前处理称取样品约0.1g（精确至1mg）于25mL离心管中，对水易分散化妆品，首先向离心管管中加入10 mL水，涡旋或超声使其均匀分散后，再向离心管管中加入4 mL二氯甲烷，涡旋12 min混匀，然后于5000 转/分离心5 min，取上层溶液2 mL，经0.2 m 聚丙烯微孔滤膜过滤后，待测。或取2 mL混合溶液于12000转/分离心5 min，移取1 mL上层清液于2 mL进样瓶中待测。对水不易分散化妆品，首先向试管中加入4mL二氯甲烷，涡旋或超声使其均匀分散后，再向试管中准确加入10mL水，涡旋12 min，混匀提取，然后于5000 转/分离心5 min，其他步骤与上面相同。5.3.3.2 除二苯酮-9外其他二苯酮类防晒剂测试的样品前处理称取样品约0.1 g（精确至1 mg）于25 mL具塞试管中，向试管中加入2 mL四氢呋喃，涡旋混匀提取，再向试管中加入75%甲醇水溶液定容至10mL，涡旋12 min，然后于5000 转/分离心5 min，取2 mL混合溶液，经0.2 m 聚丙烯微孔滤膜过滤后，待测。或取2 mL混合溶液于12000转/分离心5 min，移取1 mL于2 mL进样瓶中待测。对唇膏等蜡基化妆品，首先向试管中准确加入2 mL四氢呋喃，涡旋或超声使样品完全分散。若不能分散一般适当超声可解决问题，对超声15 min仍无法分散的样品，需用60 水浴，振荡加热约12 分钟即可溶解分散。继续向试管中加入75%甲醇水溶液定容至10mL，涡旋混合，然后于5000 转/分离心5 min，其他步骤与上面相同。6 方法研究6.1 样品前处理条件的优化乳液、唇膏、指甲油、粉类化妆品的结构组成差异很大，考虑到这些化妆品样品的分散性以及目标物的溶解性，参考文献，我们尝试不同比例甲醇/水、四氢呋喃/甲醇/水作为初级提取溶液提取空白加标样品中的目标物，结果显示除唇膏外，在2 mL四氢呋喃及8 mL75%甲醇水溶液的提取条件下目标物在20 mg/g较高浓度下时仍有较高的回收率。而对于唇膏基质，考虑到其较难分散，我们采取首先用四氢呋喃溶解分散样品，若仍无法分散需热水浴辅助超声分散，然后加入75%甲醇水的方法。试验证明，加入75%甲醇水后唇膏中的蜡基及指甲油中大分子的赋形剂等基质（这些物质由于极强的非极性很难从反相色谱柱上洗脱下来，严重影响色谱柱的使用寿命）均可以析出，从而避免了这些物质对反相色谱柱的伤害。对于二苯酮-9而言（因其水溶性故一般仅在乳液或水剂类化妆品中使用），由于带有两个磺酸取代基，水溶性极强，为此我们采用水/二氯甲烷双液相萃取体系，一方面脱除化妆品样品中的脂溶性杂质（富集在二氯甲烷层）及表面活性剂类杂质（富集在水与二氯甲烷两相界面处），同时保证目标物（富集在水相）的收率。但考虑到化妆品样品的分散性的差异，对水易分散的体系先用水分散并提取目标化合物，然后再加入二氯甲烷脱除杂质，而对水不易分散的体系需先用二氯甲烷分散，然后加入水提取目标化合物。结果表明在0.5 mg/g20 mg/g范围内，目标物都有较好的回收率。6.2 色谱柱的选择选择合适的色谱柱是分析方法的关键。C18色谱柱是实验室最常使用的色谱柱，因此分析方法也优先选择C18色谱柱。但是即使同样是C18色谱填料，因为键合技术，硅羟基封尾基团的不同，色谱柱的选择性也会有较大的差别。为此我们首先比较11种二苯酮类紫外吸收剂在XDB-C18、Agilent Porosell 120 EC-C18、Agilent eclipse plus C18 、ODS-C18和Diamonsil-C18 5种色谱柱上的分离效果。结果见图1图1 二苯酮类紫外吸收剂在不同类型C18柱上的色谱保留行为结果表明，二苯酮类紫外吸收剂在五种C18柱都有较好的分离度和峰响应值。鉴于5 m C18色谱柱的普适性及二苯酮-9的峰响应变化，选取Diamonsil-C18柱作为试验使用色谱柱。但需要注意的是在Diamonsil-C18色谱柱上二苯酮-2和二苯酮-4/5的出峰顺序与其他类型的C18柱不同，二苯酮-2先出峰。6.3 检测波长的选择根据不同二苯酮类化合物的紫外-可见光谱谱图，分析了11种二苯酮类化合物在不同检测波长下的特征吸收峰分布情况。试验结果表明，11种化合物在240 nm-330 nm紫外波长范围内均有特征吸收，根据11种化合物的紫外线吸收波长谱图确定311 nm作为通用检测波长，谱图见图2。图2：11种二苯酮类紫外线吸收剂在311nm下下的色谱峰谱图6.4 流动相的选择A:甲醇与乙腈为强洗脱溶剂的色谱分离比较我们比较了甲醇和乙腈作为强洗脱溶剂时对色谱分离行为的影响，发现两种溶剂在优化条件下均可获得较好的分离谱图。考虑到乙腈的价格和毒性，我们最终选用甲醇为色谱有机相。B:流动相中酸性改性剂的比较我们比较了无酸以及甲酸和乙酸分别作为酸性改性剂，不同酸的添加量对色谱分离的影响。结果显示0.1%甲酸条件下，除二苯酮-9外，其他二苯酮类紫外吸收剂在色谱柱上可获得很好的分离，增加酸的浓度对分离没有改善，但流动相酸性越强对色谱柱的伤害也越大，因此确定0.1%甲酸做为流动相条件。对于二苯酮-9，流动相中添加甲酸能够增加其响应值，但存在峰拖尾，因此在酸性改性剂的基础上，比较了不同浓度醋酸铵对色谱峰峰型的影响，最终确定0.1%甲酸和10 mM醋酸铵作为流动相条件。C:梯度洗脱条件的优化通过不断优化梯度洗脱条件，以达到在最短时间内获得所有化合物基线分离的目的。我们最终确定的色谱梯度条件为：色谱柱： C18柱（5 m，4.6 mm×150 mm）；流动相：A：水 (含0.1% 甲酸及10 mM乙酸铵), B：甲醇(含0.1%甲酸)；流量：1.0 mL/min；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：311 nm；柱温：25 ；进样量：10 L。梯度洗脱条件：表1 11种二苯酮类紫外线吸收剂的液相色谱分离条件时间，minA，%B，% 0946360404406011010013010019946209466.5 线性范围及检出限 结合样品中二苯酮类紫外线吸收剂的实际添加量、样品称样量及线性范围，本研究确定最高配制浓度为200 g/mL，最低配制浓度为1 g/mL，浓度范围完全满足实验要求。 分别配制共6个系列浓度的混合标准系列，进行检测分析，记录相应的面积响应值，以被测物质标准溶液的质量浓度为横坐标（x），面积响应值为纵坐标（y）建立标准曲线，进行相关分析得到线性方程和相关系数（r）。同时，对含混和标准系列的基质标准溶液进行检测分析，记录相应的峰面积响应值，以被测物质基质标准溶液的质量浓度为横坐标（x），面积响应值为纵坐标（y）建立基质，标准曲线，进行相关分析得到线性方程和相关系数（r）结果见表2表2 11种二苯酮类紫外线吸收剂的标准曲线及相关系数序号物质名称标准曲线相关系数基质标准曲线相关系数1二苯酮-1y=44.36313x-1.626520.99995y=44.14395x-4.676751.000002二苯酮-2y=36.58289x+0.41970.99997y=35.92602x-1.042261.000003二苯酮-3y=40.63627x-2.25650.99997y=40.31907x-3.219901.000004二苯酮-4/5y=21.07432x-2.285920.99997y=21.04827x-2.430930.999995二苯酮-6y=29.97015x+12.0900.99927y=29.58270x-2.264901.000006二苯酮-7y=6.55577x+1.383760.99985y=6.76154x-1.216350.999997二苯酮-8y=35.53993x-0.908140.99997y=35.24768x-1.959401.000008二苯酮-9y=4.14278x-0.2211410.99983y=5.21867x+1.678180.999999二苯酮-10y=40.50182x-1.757050.99998y=39.91817x-2.387531.0000010二苯酮-12y=29.00651x-3.983970.99998y=28.70398x-2.887441.00000 检出限是指检测器恰能产生3倍噪声时的色谱进样量。对工作曲线逐级往下稀释，计算信噪比（S/N）。以S/N=3为检出限，以S/N=10为定量下限。当样品 称样量为0.1 g，定容体积为10 mL时，计算检出浓度和最低定量浓度。二苯酮类紫外线吸收剂的检出限、定量下限极检出浓度和最低定量浓度见表3表3 11种二苯酮类紫外线吸收剂的检出限、检出浓度、定量下限、最低定量浓度 序号化合物名称检出限/g检出浓度/(g/g)定量下限/g最低定量浓度/(g/g)1二苯酮-10.4×10-34.01.5×10-3152二苯酮-20.5×10-34.51.5×10-3153二苯酮-30.6×10-36.02.0×10-3204二苯酮-4/52.0×10-3206.7×10-3705二苯酮-60.6×10-36.02.0×10-3206二苯酮-73.3×10-3301.0×10-21007二苯酮-80.5×10-34.51.7×10-3158二苯酮-90.5×10-34.51.7×10-3159二苯酮-100.6×10-36.02.0×10-32010二苯酮-120.6×10-38.02.7×10-3276.6 精密度将5.0 g/mL、100.0 g/mL和200.0 g/mL三种浓度的混合标准溶液同一日内平行测定7次，计算精密度，并用相对标准偏差（RSD）表示，结果见表4。将5.0 g/mL、100.0 g/mL和200.0 g/mL三种浓度的混合标准溶液于室温密封避光条件下存放，在设定的色谱条件下每隔24 h进样测定一次，连续测定4天，以色谱峰峰面积的重复性作为指标，进行液相色谱法日间精密度实验。计算精密度，并用相对标准偏差（RSD）表示，结果见表5。由表4可见，11种二苯酮类紫外吸收剂的日内精密度RSD值在0.10.3%之间。由表5可见，11种二苯酮类紫外吸收剂的日间精密度RSD值在1.63.6%之间。日内精密度和日间精密度结果均满足方法要求。表4 11种二苯酮类紫外线吸收剂的日内精密度序号物质名称相对标准偏差（RSD）%5.0 g/mL100.0 g/mL200.0 g/mL1二苯酮-10.10.10.12二苯酮-20.10.10.13二苯酮-30.20.10.14二苯酮-4/50.10.10.15二苯酮-60.20.10.16二苯酮-70.20.20.17二苯酮-80.20.10.18二苯酮-90.10.10.19二苯酮-100.20.10.310二苯酮-120.20.10.1表5 11种二苯酮类紫外线吸收剂的日间精密度序号物质名称相对标准偏差（RSD）%5.0g/mL100.0 g/mL200.0 g/mL1二苯酮-11.11.52.02二苯酮-22.42.81.83二苯酮-33.52.92.84二苯酮-4/52.51.82.65二苯酮-61.63.33.16二苯酮-72.93.63.07二苯酮-82.32.51.68二苯酮-91.91.72.29二苯酮-103.03.32.710二苯酮-122.11.31.9 6.7 准确度按防晒剂的类别，每种类别选择2种样品作为空白，分别加入5 g/mL和200 g/mL共2种混合标准溶液，进行加标回收试验，平行测定6次，计算方法回收率，结果见表6。表6 11种二苯酮类紫外线吸收剂的方法回收率和RSD化合物基质5.0 g/mL20.0g/mL方法回收率(%)RSD(%)方法回收率(%)RSD(%)二苯酮-1乳液952.91000.2唇膏980.9960.5指甲油971.3980.1粉982.1970.9二苯酮-2乳液962.71000.4唇膏991.5961.4指甲油980.5960.8粉992.11010.7二苯酮-3乳液952.41000.1唇膏971.3950.9指甲油1004.1991.6粉961.5980.4二苯酮-4/5乳液952.21000.3唇膏991.5991.1指甲油990.9971.1粉1022.3990.1二苯酮-6乳液964.11000.3唇膏950.9991.4指甲油963.6930.5粉962.0960.8二苯酮-7乳液952.5990.4唇膏962.01001.6指甲油994.2980.2粉980.3991.2二苯酮-8乳液961.81000.1唇膏971.1981.1指甲