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第七章第七章 分子生物学研究方法分子生物学研究方法第一节第一节重组重组DNA技术回顾技术回顾第二节第二节DNA基本操作技术基本操作技术第三节第三节RNA基本操作技术基本操作技术第四节第四节SNP的理论与应用的理论与应用第五节第五节基因克隆技术基因克隆技术第六节第六节蛋白质组与蛋白质组学技术蛋白质组与蛋白质组学技术12/7/20221第一节第一节重组重组DNA技术回顾技术回顾一、重组一、重组DNA技术发展史上的重大事件技术发展史上的重大事件第一第一，在，在20世纪世纪40年代确定了遗传信息的携带年代确定了遗传信息的携带者：即基因的分子载体是者：即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，而不是蛋白质，解决了解决了遗传的物质基础遗传的物质基础问题；问题；12/7/20222第二第二，50年代提出了年代提出了DNA分子的分子的双螺旋结构模双螺旋结构模型型和和半保留复制半保留复制机制，解决了基因的自我复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题；和世代交替问题；第三第三，50年代末至年代末至60年代，相继提出了年代，相继提出了“中心中心法则法则”和和操纵子学说操纵子学说，成功地破译了遗传密码，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。阐明了遗传信息的流动与表达机制。12/7/20223l但是但是：l当时由于缺乏有效的分离和富集单一当时由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子分子的技术，科学家无法对这类物质进行直接的生化的技术，科学家无法对这类物质进行直接的生化分析。随着分析。随着DNA分子分子体外切割体外切割与与连接技术连接技术及及核核苷酸序列分析技术苷酸序列分析技术的进步直接推动了的进步直接推动了重组重组DNA技术技术的产生与发展。的产生与发展。12/7/20224重组重组DNA技术（技术（recombination）：是应用酶学方法，在体外将不同来源的是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。分子的过程。12/7/20225工具酶：工具酶：限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）DNA连接酶连接酶（DNAligase）工具酶的发现和应用是现代生物工程技工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。术史上最重要的事件。12/7/20226（一）限制性内切酶（一）限制性内切酶(RE)1、概念：一类能、概念：一类能识别识别和和切割切割双链双链DNA分子中分子中特特异核苷酸序列异核苷酸序列的的DNA水解酶。水解酶。2、分类：、分类：I I型型 、IIII型型 、型型12/7/20227 类型类型IIII：识别位点和酶切位点一致，具特异识别位点和酶切位点一致，具特异性。单体酶，性质稳定，性。单体酶，性质稳定，Mg2+为辅助因子。目前为辅助因子。目前已分离了数百种。已分离了数百种。类型类型I：识别的：识别的DNA序列长约十几个序列长约十几个bp；酶；酶切位点在距识别位点切位点在距识别位点1kb左右处随机切割，非特左右处随机切割，非特异性；复合酶，无使用价值。异性；复合酶，无使用价值。类型类型：酶切位点在识别位点下游：酶切位点在识别位点下游24-26bp处，处，非特异性。非特异性。单体酶，如单体酶，如HgaI:GACGCnnnnn12/7/202283、II型限制性内切酶的基本特性型限制性内切酶的基本特性ll5 5 GCTGCTGAATTCGAATTCGAG3GAG3ll3 3 CGACGACTTAAGCTTAAGCTC5CTC5llEcoEcoRIRI的识别序列的识别序列的识别序列的识别序列llEcoEcoEcoEcoR IR IR IR I的切割位点的切割位点的切割位点的切割位点(1)识别识别dsDNA分子中分子中48bp的特定序列的特定序列(2)大部分酶的切割位点大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧在识别序列内部或两侧(3)识别切割序列呈典型的旋转对称型识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构回文结构12/7/20229EcoEcoRIRI等产生的等产生的55粘性末端粘性末端 5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C5EcoRI375G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C5退火退火4-75G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C5POH12/7/202210（二）（二）DNA连接酶连接酶(ligase)将两段将两段DNA片段连接起来的酶称为片段连接起来的酶称为DNA连接酶连接酶。1、E.coliDNAligase:连接连接粘端粘端,催化需要催化需要NAD+参与参与2、T4DNAligase:连接连接粘端和平端粘端和平端，催化需要，催化需要ATP参与参与都不连接单链都不连接单链12/7/202211DNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质l修复双链修复双链DNA上上缺口处的磷酸二酯键缺口处的磷酸二酯键lnickOHPl5G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G3l3C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C5lPOHlDNA连接酶连接酶l5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G3l3C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C512/7/202212二、基因克隆的载体二、基因克隆的载体克隆用载体克隆用载体：是指具备自我复制能力的：是指具备自我复制能力的DNA分子。分子。常见的分子克隆载体有：病毒、噬菌体、质粒。常见的分子克隆载体有：病毒、噬菌体、质粒。克隆用载体的选择克隆用载体的选择具备复制原点，能够自我复制具备复制原点，能够自我复制具备适合的酶切位点，且不在原点具备适合的酶切位点，且不在原点具有筛选指标具有筛选指标对抗菌素的抗性对抗菌素的抗性基因产物的显色反应基因产物的显色反应12/7/202213载体的功能载体的功能l运送外源基因运送外源基因高效转入受体细胞高效转入受体细胞l为外源基因提供为外源基因提供复制能力复制能力或或整合能力整合能力l为外源基因的为外源基因的扩增或表达扩增或表达提供必要的条件提供必要的条件12/7/202214三、基因克隆的操作三、基因克隆的操作1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或消化或PCR扩增等步骤，扩增等步骤，分离分离出带有目的基出带有目的基因的因的DNA片段；片段；2 2、在体外，将带有目的基因的外源、在体外，将带有目的基因的外源DNADNA片段片段连连接接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组子上，形成重组DNADNA分子；分子；12/7/2022153 3、感受态细胞的制备感受态细胞的制备氯化钙法氯化钙法第一次摇菌第一次摇菌第一次摇菌第一次摇菌第二次摇菌第二次摇菌第二次摇菌第二次摇菌离心收集细菌离心收集细菌离心收集细菌离心收集细菌0.1M0.1MCaCl2重悬细胞重悬细胞,冰浴冰浴30min离心、重悬重复一次离心、重悬重复一次12/7/2022164、转化（、转化（transformation）感受态细胞与连接产物轻轻混匀感受态细胞与连接产物轻轻混匀,冰浴冰浴30min，42水浴水浴热激热激6090s，快速，快速冰浴冰浴2min加加液体液体LB振荡培养，使振荡培养，使细胞复苏。细胞复苏。12/7/2022175、筛选（、筛选（screening）根据重组载体的表型根据重组载体的表型抗药性（抗药性（Ampr、Tetr）其他其他mark（-互补筛选）互补筛选）根据根据DNA限制酶的酶谱分析限制酶的酶谱分析PCR反应反应12/7/202218基基因因克克隆隆流流程程示示意意图图12/7/202219 带有负电荷的带有负电荷的DNA或或RNA核苷酸链，依靠无核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的反应活性的稳定的介质介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸移向正极。根据核酸分子大小分子大小不同、不同、构型构型的差异，的差异，以及所带以及所带电荷电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。的不同成分彼此分开。一、核酸的凝胶电泳一、核酸的凝胶电泳一、核酸的凝胶电泳一、核酸的凝胶电泳（一）（一）基本原理基本原理：第二节第二节DNA基本操作技术基本操作技术12/7/202220电泳迁移率电泳迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度。：电泳分子在电场作用下的迁移速度。与电场强度和电泳分子所带的净电荷成正比。与电场强度和电泳分子所带的净电荷成正比。与分子的摩擦系数成反比，摩擦系数是分子大小、与分子的摩擦系数成反比，摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。极性及介质粘度的函数。支持介质支持介质：稳定，无反应活性；：稳定，无反应活性；12/7/202221（二）种类（二）种类 1)1)按凝胶材料分按凝胶材料分:聚丙烯酰胺凝胶和琼聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳脂糖凝胶电泳 2)2)按电泳装置分按电泳装置分:水平式水平式/琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶;竖式竖式/聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 3)3)两种方法比较：分离效果和分离范围两种方法比较：分离效果和分离范围;操作难易操作难易 12/7/202222琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是从红色海藻产物琼脂中提取的一种琼脂糖是从红色海藻产物琼脂中提取的一种线线性多糖聚合物性多糖聚合物。将琼脂糖粉未加热到溶点后凝固，。将琼脂糖粉未加热到溶点后凝固，便会形成良好的介质，其密度由琼脂糖的浓度所便会形成良好的介质，其密度由琼脂糖的浓度所决定。决定。特点：特点：分辨能力低，但应用范围广，适用于较大分辨能力低，但应用范围广，适用于较大分子的分析。适于分离分子的分析。适于分离200bp50kb的的DNA片段。操作简便。片段。操作简便。12/7/20222312/7/202224聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，由聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体丙烯酰胺单体和和交联剂甲叉双丙烯酰胺交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂在催化剂过硫酸铵过硫酸铵和加速剂和加速剂TEMED(四甲基乙二胺）四甲基乙二胺）的的作用下聚合而成。作用下聚合而成。聚合时，由单体丙烯酰胺聚合成链状物，由聚合时，由单体丙烯酰胺聚合成链状物，由交联剂甲叉双丙烯酰胺将链与链交联成网状，形交联剂甲叉双丙烯酰胺将链与链交联成网状，形成立体的不溶于水的凝胶。成立体的不溶于水的凝胶。12/7/202225特点：特点：分辨能力高，但应用范围小，适用于较小分辨能力高，但应用范围小，适用于较小分子的分析。适于分离分子的分析。适于分离5bp500bp的的DNA片段。操作复杂。片段。操作复杂。核酸分子的染料核酸分子的染料溴化乙锭（溴化乙锭（EB），因具有，因具有扁平分子扁平分子的空间结构，的空间结构，能插入到能插入到DNA分子或分子或RNA分子的相邻碱基之间，分子的相邻碱基之间，并在并在300nm波长的紫外光照射下发出波长的紫外光照射下发出荧光荧光。12/7/202226（三）（三）（三）（三）用途用途用途用途琼脂糖凝胶用于琼脂糖凝胶用于DNA和和RNA的常规分析；聚的常规分析；聚丙烯酰胺凝胶常用于小分子核酸分析。丙烯酰胺凝胶常用于小分子核酸分析。（四）（四）（四）（四）凝胶电泳的一般程序凝胶电泳的一般程序凝胶电泳的一般程序凝胶电泳的一般程序制胶制胶点样点样电泳电泳染色染色观察观察12/7/20222712/7/20222812/7/202229二、细菌转化二、细菌转化l细菌转化（细菌转化（transformation）是指一种细菌菌是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株株由于捕获了来自另一种细菌菌株DNA而导致而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化的的DNA菌株叫菌株叫供体菌株供体菌株，接受转化的，接受转化的DNA菌株菌株叫叫受体菌株受体菌株。l目前常用的转化方法有目前常用的转化方法有CaCl2法法(化学转化法化学转化法)和和电转化法电转化法。12/7/202230感受态细胞的制备感受态细胞的制备氯化钙法氯化钙法第一次摇菌第二次摇菌离心收集细菌0.1MCaCl2重悬细胞,冰浴30 min离心、重悬重复一次12/7/202231转化（transformation）感受态细胞与连接产物轻轻混匀感受态细胞与连接产物轻轻混匀,冰冰浴浴30分钟，分钟，42水浴水浴热激热激60906090秒秒，快，快速速冰浴冰浴2分钟加液体分钟加液体LB振荡培养，使振荡培养，使细胞细胞复苏。复苏。12/7/202232三、三、PCR基因扩增基因扩增聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)，即，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因技术，是一种在体外快速扩增特定基因或或DNA序列的方法。序列的方法。1985年年，美美国国PE-Cetus公公司司的的Mullis等等人人发发明明了了聚聚合合酶酶链链反反应应（PCR）,随随后后PE-Cetus公公司司推推出出了了第第一一台台PCR自动化热循环仪自动化热循环仪1993年年，Mullis等等因因此此项项技技术术获获诺诺贝贝尔化学奖。尔化学奖。12/7/202233PCR特异性特异性，即所扩增片段是由两个人，即所扩增片段是由两个人工合成的引物序列决定的。工合成的引物序列决定的。12/7/202234PCR反应原理反应原理变性变性退火退火延伸延伸12/7/202235反应体系的成分反应体系的成分耐热的耐热的DNA聚合酶聚合酶PCR反应的缓冲液反应的缓冲液Mg2+Tris Cl引物引物dNTP模板模板DNA12/7/202236温度循环参数温度循环参数q变性变性：双链：双链DNA分子加热分离成两条单链分子加热分离成两条单链DNA分子的过程。分子的过程。变性温度变性温度：是指双链：是指双链DNA分子分子50发生变性时的发生变性时的温度，一般为温度，一般为949512/7/202237q 退火退火：两引物分别与两条：两引物分别与两条DNA的两侧序列的两侧序列特异性互补，形成双链的过程称为退火。特异性互补，形成双链的过程称为退火。退火温度退火温度一般在一般在5065之间，具体温度与引之间，具体温度与引物长度、碱基组成以及浓度有关。物长度、碱基组成以及浓度有关。12/7/202238q延伸延伸：在适宜条件下，：在适宜条件下，DNA聚合酶以单链聚合酶以单链DNA为模板，以为模板，以4种脱氧核苷三磷酸（种脱氧核苷三磷酸（dNTP)为为底物底物,在引物的诱导下，按在引物的诱导下，按53方向复制互补方向复制互补DNA的过程。的过程。延伸温度延伸温度一般为一般为7075，此时，此时DNA聚合酶活聚合酶活性最高。性最高。12/7/202239时间参数时间参数q变性时间：决定于：决定于DNA的复杂性，一般选取的复杂性，一般选取941min,因过长的高温时间，会降低因过长的高温时间，会降低DNA聚合酶的活性；聚合酶的活性；q退火时间：一般情况下取一般情况下取30s1min，因为引，因为引物比较短；物比较短；q延伸时间：根据扩增片段的长度而定，一般根据扩增片段的长度而定，一般在在1kb以内的片段需延伸以内的片段需延伸1min,更长的片段需更长的片段需相应延长时间。相应延长时间。12/7/202240引引物物1、引物长度在、引物长度在1530 bp 30 bp 之间，之间，引物的退火温度引物的退火温度 Tm=4(G+C)+2(A+T)Tm=4(G+C)+2(A+T)2、碱基随机分布、碱基随机分布避免一连串相同碱基，引物本身不应存在互补避免一连串相同碱基，引物本身不应存在互补序列，两条引物间也不应有互补性，尤其是序列，两条引物间也不应有互补性，尤其是33端；端；12/7/2022413、G+C含量含量G+C含量一般为含量一般为4060604、引物、引物33端碱基的特异性。端碱基的特异性。12/7/202242PCR技术的特点：技术的特点：第一，特异性强第一，特异性强第二，效率高第二，效率高第三，灵敏度高第三，灵敏度高1.皮克皮克(pg=10-12)量级扩增到微克量级扩增到微克(ug=10-6)水水平平2.能从能从100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞第四，对标本的纯度要求低第四，对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提织等组织的粗提DNA12/7/20224312/7/202244四、实时定量四、实时定量PCR实时定量实时定量PCR技术：指利用带荧光检技术：指利用带荧光检测的测的PCR仪对整个仪对整个PCR过程中扩增过程中扩增DNA的的累积速率绘制动态变化图，利用荧光信号累积速率绘制动态变化图，利用荧光信号积累实时监测整个积累实时监测整个PCR进程，从而测定终进程，从而测定终端产物的丰度。端产物的丰度。12/7/202245 荧光探针事先混合在荧光探针事先混合在反应管中，只有与反应管中，只有与DNA结合后才能被激发出荧光。结合后才能被激发出荧光。12/7/20224653535353535355TaqTaq353TaqTaq55Repeat非序列特异性的非序列特异性的非序列特异性的非序列特异性的DNADNA结合的荧光探针结合的荧光探针结合的荧光探针结合的荧光探针BDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllll与双链与双链DNADNA结合；结合；与与DNADNA结合后才发结合后才发出荧光。出荧光。12/7/202247特异性的荧光探针特异性的荧光探针特异性的荧光探针是把荧光化合物标特异性的荧光探针是把荧光化合物标记到特异性的寡核苷酸上形成荧光标记的记到特异性的寡核苷酸上形成荧光标记的DNA探针。通过探针与探针。通过探针与PCR产物特异性的产物特异性的结合，在结合，在PCR过程中可对产物实现实时、过程中可对产物实现实时、定量检测。定量检测。12/7/202248TaqMan探针是一小段被设计成可以与探针是一小段被设计成可以与靶靶DNA序列中间部位结合的单链序列中间部位结合的单链DNA（一般（一般为为550bp），并且该单链），并且该单链DNA的的5和和3端带端带有短波长和长波长两个不同荧光基团。有短波长和长波长两个不同荧光基团。12/7/202249当探针单独存在时，由于荧光共振能量转移的当探针单独存在时，由于荧光共振能量转移的作用而发生荧光猝灭。在作用而发生荧光猝灭。在PCR过程中，由于过程中，由于TaqDNA酶的酶的5-3外切酶活性的作用，使探针的外切酶活性的作用，使探针的5端的基团被切断，加大了荧光基团间的的距离，被端的基团被切断，加大了荧光基团间的的距离，被切下来的荧光基团恢复荧光。切下来的荧光基团恢复荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此，基团不断积累。因此，Taqman探针检测的是积累探针检测的是积累荧光。荧光。12/7/2022505533d.NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and SampleDenaturation535353535353AnnealingReaction TubeTaql53RQProbe53RQ应用应用TaqMan探针的实时定量探针的实时定量PCR技术技术12/7/202251535353RQ53Taq3QR5533QTaqR553QTaqR35533QTaqR5lR12/7/202252实时定量实时定量PCR的绝对定量的绝对定量CtCt值值值值：指指指指PCR扩增过程中，扩增过程中，扩增产物荧光强度扩增产物荧光强度首次超过设定阈值首次超过设定阈值时，时，PCR反应所需反应所需的循环数。的循环数。12/7/202253模板起始浓度越高，Ct值越小Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系Ct值与模板起始浓度的关系值与模板起始浓度的关系 如果模板浓度增加如果模板浓度增加1倍，倍，Ct值就提前值就提前1个循环到达个循环到达如果模板浓度减少如果模板浓度减少1倍，倍，Ct值就滞后值就滞后1个循环到达个循环到达12/7/202254绝对定量绝对定量可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度。可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度。（图（图5-11）相对定量相对定量相对定量相对定量（两个样本中的基因表达水平进行比较（两个样本中的基因表达水平进行比较（两个样本中的基因表达水平进行比较（两个样本中的基因表达水平进行比较）（图（图（图（图5-125-12）五、基因组五、基因组DNA文库构建文库构建是指将某种生物体的全部基因组是指将某种生物体的全部基因组DNA用用限制性内切酶限制性内切酶或或机械力量机械力量切割成一定长度范切割成一定长度范围的围的DNA片段，再与合适的载体在体外片段，再与合适的载体在体外重组重组并并转化转化相应的宿主细胞获得的相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落所有阳性菌落，这个群体就称为该生物这个群体就称为该生物基因组文库基因组文库。12/7/202256基因组基因组DNA文库的类型文库的类型根据所选用的载体可以分为：质粒文库、根据所选用的载体可以分为：质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。文库）。12/7/202257基因组基因组DNA文库的质量标准文库的质量标准一个理想的基因组一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：文库应具备下列条件：p重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力;p载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆隔克隆;p克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序利克隆排序;p克隆片段易于从载体分子上完整卸下克隆片段易于从载体分子上完整卸下;p重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。12/7/202258基因组基因组DNA文库构建的程序文库构建的程序 载体载体DNA的制备；的制备；基因组基因组DNA的提取；的提取；基因组基因组DNA的部分酶切、分离与回收；的部分酶切、分离与回收；载载体体与与外外源源片片段段的的连连接接与与转转化化或或侵侵染染宿宿主主细胞；细胞；重组克隆的挑选和保存。重组克隆的挑选和保存。12/7/20225912/7/202260第三节第三节RNA基本操作技术基本操作技术一、总一、总RNA的提取的提取液氮研磨组织、匀浆液氮研磨组织、匀浆加入加入Trizol试剂（异硫氰酸胍试剂（异硫氰酸胍-苯酚）溶解细胞苯酚）溶解细胞氯仿氯仿抽提抽提异丙醇异丙醇沉淀沉淀溶溶解解在变性条件下采用电泳方法对其进行检测在变性条件下采用电泳方法对其进行检测12/7/202261二、二、mRNA的纯化的纯化 大部分真核生物的大部分真核生物的mRNA有有3poly（A）尾巴尾巴 oligo(dT)能与能与poly(A)尾巴互补，由此尾巴互补，由此来获得来获得mRNA。AAAAAAAAAAn5 cap5 cap12/7/20226212/7/202263分离分离分离分离mRNAmRNA的试剂盒的试剂盒的试剂盒的试剂盒l可应用可应用PromegaPolyATtractmRNA分离系统分离系统分离分离poly(A)mRNA。将用。将用生物生物素标识素标识的寡聚的寡聚(dT)引物与引物与细胞总细胞总RNA共温育，加入共温育，加入与微磁球相连的与微磁球相连的抗生物素抗生物素蛋白蛋白，用磁场吸附通过寡，用磁场吸附通过寡聚聚(dT)引物与抗生物素蛋引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的白及强力微磁球相连的mRNA。12/7/202264三、三、cDNA的合成的合成可同时在反转录系统中加入可同时在反转录系统中加入Oligo（dT）12-18-mer及及随机引物随机引物R6，以保证得到全长，以保证得到全长cDNA；应选用活性较高的应选用活性较高的反转录酶（反转录酶（Reversetranscriptase）；应选用应选用甲基化甲基化dCTP(防止被限制性内切酶切割防止被限制性内切酶切割)；应保证所获得双链应保证所获得双链cDNA的的方向性方向性(cDNA两端加上不同两端加上不同内切酶所识别的接头序列内切酶所识别的接头序列);因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5-methylC的外源的外源DNA，所以，应选用，所以，应选用mcrA-,mcrB-菌株。菌株。12/7/20226512/7/202266定向定向cDNA的合成及分子修饰的合成及分子修饰12/7/202267四、四、cDNA文库文库将某种细胞的全部将某种细胞的全部mRNA通过逆转录合通过逆转录合成成cDNA，与载体连接，然后转化宿主细胞，与载体连接，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为得到含全部表达基因的种群，称为cDNA文文库。库。cDNA文库具有组织细胞特异性。文库具有组织细胞特异性。l构建构建cDNA文库，材料来自文库，材料来自mRNAlcDNA文库只含有文库只含有mRNA的分子结构的分子结构,不含真核基不含真核基因的间隔序列和调控区。因的间隔序列和调控区。12/7/202268cDNA文库的特点：文库的特点：l出出发发材材料料是是一一定定时时空空条条件件下下的的细细胞胞总总mRNA,在在转转录录水水平平上上反反映映生生物物在在特特定定发发育育时时期期、特特定定组组织织(或或器器官官)在一定环境条件下的基因表达情况。在一定环境条件下的基因表达情况。l不不同同组组织织、细细胞胞在在不不同同时时段段的的mRNA种种类类不不同同(即即基基因因的的表表达达谱谱不不同同)，同同种种生生物物的的cDNA文文库库有有组组织织细胞的界定，如肝组织或胚胎组织。细胞的界定，如肝组织或胚胎组织。12/7/202269分离纯化目的基因分离纯化目的基因分离纯化目的基因分离纯化目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因+vector=+vector=重组重组重组重组DNADNA分子分子分子分子12/7/202270噬菌粒的包装噬菌粒的包装 含有含有cDNA插入插入片段的重组噬菌粒只片段的重组噬菌粒只有经过体外蛋白外壳有经过体外蛋白外壳包装反应，才能成为包装反应，才能成为具有侵染和复制能力具有侵染和复制能力的成熟噬菌体。的成熟噬菌体。12/7/202271与载体连接成重组与载体连接成重组DNA侵染大肠杆菌进行克隆侵染大肠杆菌进行克隆合成双链合成双链DNA逆转录生成逆转录生成cDNA从细胞中分离出从细胞中分离出mRNA逆转录酶逆转录酶DNA聚合酶聚合酶噬菌粒的包装噬菌粒的包装12/7/202272五、基因文库的筛选五、基因文库的筛选1、核酸杂交法、核酸杂交法平板上的菌落平板上的菌落转移转移硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜温育温育碱变性碱变性用蛋白酶用蛋白酶K去除蛋白质去除蛋白质形成菌落形成菌落DNA印迹印迹80烘烤滤膜烘烤滤膜DNA固定固定与探针杂交与探针杂交检测杂交结果检测杂交结果12/7/2022732、PCR筛选法筛选法1）、设计特异性引物；）、设计特异性引物；2）、将文库保存在多孔培养板上，对每个）、将文库保存在多孔培养板上，对每个孔进行孔进行PCR扩增；扩增；3）、对阳性孔进行稀释至次级孔，再对每）、对阳性孔进行稀释至次级孔，再对每个孔进行个孔进行PCR扩增，直至鉴定出与目的扩增，直至鉴定出与目的基因对应的单克隆。基因对应的单克隆。12/7/2022743、免疫筛选法、免疫筛选法适用范围：表达文库适用范围：表达文库用某个基因产物的特异性抗体对重组克隆进行筛选。用某个基因产物的特异性抗体对重组克隆进行筛选。文库铺于平板文库铺于平板转移至转移至NCNC保存原板保存原板,噬菌噬菌体表达体表达加入一抗加入一抗洗去一抗洗去一抗,加入二抗加入二抗加底物显色加底物显色从保存板中挑出阳性菌落从保存板中挑出阳性菌落12/7/20227512/7/202276第四节第四节SNP理论及应用理论及应用SNP，中文翻译为单核苷酸多态性，指基因组，中文翻译为单核苷酸多态性，指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。SNP转换转换（2/3）：CT，AG颠换颠换（1/3）：CA，GT，CG，AT位置位置基因编码区基因编码区（cSNP)基因周边区基因周边区（pSNP)基因间基因间（iSNP)同义同义cSNP非同义非同义cSNP12/7/202277l单倍型：单倍型：位于染色体上某一区域的一组相关联的位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单倍型等位位点被称作单倍型(haplotype)。12/7/202278SNP的检测技术的检测技术1、基因芯片技术、基因芯片技术概念：概念：就是将大量探针分子固定于支持物就是将大量探针分子固定于支持物上，根据碱基互补配对原理，与标记的样上，根据碱基互补配对原理，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。序列信息。12/7/202279基因芯片的工作原理：基因芯片的工作原理：应用已知核酸序列作为靶基因与互补的探针核苷应用已知核酸序列作为靶基因与互补的探针核苷酸序列酸序列杂交杂交，通过随后的，通过随后的信号检测信号检测进行定性与定量进行定性与定量分析。分析。具体操作具体操作:将许多特定的寡核苷酸片段或将许多特定的寡核苷酸片段或cDNAcDNA基因片段作为靶基因片段作为靶基因，有规律地排列固定于支持物上；基因，有规律地排列固定于支持物上；样品样品DNA/RNADNA/RNA通过通过PCRPCR扩增、体外转录等技术掺入荧扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子或放射性同位素作为探针；光标记分子或放射性同位素作为探针；12/7/202280然后按碱基配对原理将两者进行杂交然后按碱基配对原理将两者进行杂交;再通过荧光或同位素检测系统对芯片进行扫再通过荧光或同位素检测系统对芯片进行扫描，由计算机系统对每一探针上的信号作出描，由计算机系统对每一探针上的信号作出比较和检测，从而得出所需要的信息。比较和检测，从而得出所需要的信息。12/7/2022812、Taqman技术技术在反应体系中加入在反应体系中加入2种种不同荧光标记的探针，这不同荧光标记的探针，这两个探针分别与两个等位基因完全配对。两个探针分别与两个等位基因完全配对。探针设计运用了荧光共振能量转移；探针设计运用了荧光共振能量转移；Taq酶酶53外切酶的活性；外切酶的活性；通过不同荧光值的变化，对基因型进行分型。通过不同荧光值的变化，对基因型进行分型。12/7/2022823、分子信标（、分子信标（MolecularBeaconProbe）是一种呈环状结构的荧光标记的寡核苷是一种呈环状结构的荧光标记的寡核苷酸，环状区与靶序列特异性结合，茎干区由酸，环状区与靶序列特异性结合，茎干区由58个碱基对组成，个碱基对组成，5端带有荧光发生基团，端带有荧光发生基团，3端端带带有有荧荧光猝光猝灭灭基基团团。12/7/202283RQQRExcitation分子信标分子信标（MolecularBeaconProbe）12/7/2022844、焦磷酸测序法、焦磷酸测序法是一种短片段焦磷酸测序技术，在测序引物的是一种短片段焦磷酸测序技术，在测序引物的引导下，完成短片段（含引导下，完成短片段（含SNP）的测序，从而实）的测序，从而实现基因分型。现基因分型。缺点：不能检测长片段，对于重复序列没有办缺点：不能检测长片段，对于重复序列没有办法。法。12/7/202285原理原理:生成1分子dNTP加入1分子PPi与APS反应ATP硫酸化酶的硫酸化酶的作用下作用下生成ATP使萤光素萤光素氧化萤光素氧化萤光素生成双磷酸酶降解12/7/202286原理原理1、测序引物与测序引物与PCR扩增的单链扩增的单链DNA模板相结合模板相结合。然。然后将其与后将其与DNA聚合酶、聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶，以及底物双磷酸酶，以及底物APS和荧光素一起孵育。和荧光素一起孵育。2、4种种dNTP之一被加入反应体系，如与模板配对，之一被加入反应体系，如与模板配对，此此dNTP与引物的末端形成共价键，与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸的焦磷酸基团（基团（PPi）释放出来）释放出来。而且释放出来的。而且释放出来的PPi的量与的量与和模板结合的和模板结合的dNTP的量成正比。的量成正比。12/7/2022873、ATP硫酸化酶在硫酸化酶在5-磷酰硫酸腺苷磷酰硫酸腺苷(adenosine5phosphosulfate,APS）存在的情况下催化存在的情况下催化PPi形成形成ATP，ATP驱动萤光素酶介导的驱动萤光素酶介导的萤光萤光素素向向氧化萤光素氧化萤光素的转化，氧化萤光素发出与的转化，氧化萤光素发出与ATP量成正比的量成正比的可见光信号可见光信号。光信号由。光信号由CCD摄像机检测并由相应的软件反应为峰。每个摄像机检测并由相应的软件反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。正比。12/7/2022884、ATP和未掺入的和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。淬灭光信号，并再生反应体系。5、然后加入下一种、然后加入下一种dNTP。最终待测序列的。最终待测序列的顺序，即可从反应光强的信号峰中读出。顺序，即可从反应光强的信号峰中读出。在体系中使用的是在体系中使用的是dATPS而非而非dATP，因为，因为dATPS不是荧光素酶的底物，而且不是荧光素酶的底物，而且DNA聚合酶对聚合酶对dATPS的催化效率更高。的催化效率更高。12/7/202289SNP的应用的应用1、人类基因单倍型图的绘制；、人类基因单倍型图的绘制；2、SNP与人类疾病易感基因的相关性分析；与人类疾病易感基因的相关性分析；3、指导用药与药物设计。、指导用药与药物设计。12/7/202290第五节第五节基因克隆技术基因克隆技术克隆克隆个体水平个体水平细胞水平细胞水平基因水平基因水平12/7/202291一、RACE(RapidamplificationofcDNAendsRapidamplificationofcDNAends)主要通过主要通过PCR技术由已知的部分技术由已知的部分cDNA序列来得到完整的序列来得到完整的cDNA的的5和和3端，又被称端，又被称为单边为单边PCR(onesidedPCR)和锚定和锚定PCR(anchoredPCR)。12/7/202292主要步骤：1、获得高质量、获得高质量RNA;2、去磷酸化作用去磷酸化作用；（带帽子结构的；（带帽子结构的mRNA不受影响）不受影响）3、去掉去掉mRNA的帽子结构，加的帽子结构，加特异性特异性RNA接头接头并并用用RNA连接酶连接；连接酶连接；4、以、以特异性寡聚特异性寡聚dT为引物，在反转录酶的作用下为引物，在反转录酶的作用下合成第一条合成第一条cDNA链链，其包括寡聚接头的互补序列；，其包括寡聚接头的互补序列；5、分别以第一条、分别以第一条cDNA链为模板进行链为模板进行RACE反应。反应。