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医药基因工程l l 自自19721972年年DNADNA重组技术诞生以来重组技术诞生以来,基因工程技术得到了基因工程技术得到了飞速的发展飞速的发展,并作为现代生物技术的核心服务于人类并作为现代生物技术的核心服务于人类.基因基因工程技术不仅在农业发展中起到了重要作用工程技术不仅在农业发展中起到了重要作用,而且在与国计而且在与国计民生相关的医疗领域也展露出独特的优越性民生相关的医疗领域也展露出独特的优越性.l l 基因工程药物就是利用基因工程技术生产的药品基因工程药物就是利用基因工程技术生产的药品,在我在我国药品时常上国药品时常上,基因工程药品主要有基因工程乙肝疫苗基因工程药品主要有基因工程乙肝疫苗,重重组干扰素组干扰素,重组人红细胞生成素等重组人红细胞生成素等2222种自主开发的基因工种自主开发的基因工程药物程药物.第一节 基因工程药物的开发状况l l一一 、基因工程药物的分类基因工程药物的分类l l1.1.按结构著称的不同按结构著称的不同,可分为蛋白多肽类药物、可分为蛋白多肽类药物、基因工程基因工程疫苗和核酸类药物疫苗和核酸类药物;l l2.2.按作用方式可将基因工程药物分为基因水平作用药物、按作用方式可将基因工程药物分为基因水平作用药物、转录水平药物、转录水平药物、蛋白质水平药物蛋白质水平药物;l l3.3.按基因工程药物作用机理也可分为三类，其一按基因工程药物作用机理也可分为三类，其一,蛋白或蛋白或多肽药品多肽药品;其二其二,基因工程疫苗基因工程疫苗;其三其三,反义核酸、核酶和反义核酸、核酶和RNAi.RNAi.二、基因工程药物的发展l l 反应器的变迁反应器的变迁l l 早期大多数蛋白多肽类基因工程药物都是通过细菌和酵母菌等微早期大多数蛋白多肽类基因工程药物都是通过细菌和酵母菌等微生物来表达的，并且现在还在使用生物来表达的，并且现在还在使用.l l l l 后来发展了真核生物细胞表达系统后来发展了真核生物细胞表达系统,利用离体培养的昆虫细胞和利用离体培养的昆虫细胞和脊椎动物细胞表达蛋白多肽类药物脊椎动物细胞表达蛋白多肽类药物.l l l l 不论是原核生物表达系统不论是原核生物表达系统,还是真核生物表达系统还是真核生物表达系统,表达产物都表达产物都需要提取需要提取,工艺复杂、成本昂贵工艺复杂、成本昂贵;因此因此,近些年发展的动植物生物反应近些年发展的动植物生物反应器为基因工程药物的开发带来了美好前景器为基因工程药物的开发带来了美好前景.从基因工程到蛋白质工程l l 随着技术的进步随着技术的进步,人们已经不再满足自然存在的蛋白人们已经不再满足自然存在的蛋白药物产品药物产品,通过蛋白质工程可以获得修改了氨基酸序列的通过蛋白质工程可以获得修改了氨基酸序列的蛋白质或多肽蛋白质或多肽.通过定点诱变、功能域交换、分子进化等通过定点诱变、功能域交换、分子进化等手段手段,已经开发出一些活性提高、适应性改善和专一性增已经开发出一些活性提高、适应性改善和专一性增强的蛋白药物强的蛋白药物.l l 从蛋白药物到核酸药物l l在蛋白类基因工程药物的基础上发展出了核酸类基因工程在蛋白类基因工程药物的基础上发展出了核酸类基因工程药物药物,作为一类新的药物，作为一类新的药物，核酸类基因工程药物可产生蛋核酸类基因工程药物可产生蛋白的基因白的基因,通过破坏和扩大基因的功能来克服疾病通过破坏和扩大基因的功能来克服疾病,具有更具有更强的选择性和更高的效率强的选择性和更高的效率.目前核酸类药物正处于开发阶目前核酸类药物正处于开发阶段段,进入市场的还很少进入市场的还很少.三、基因工程药物的产业化状况三、基因工程药物的产业化状况 基因工程制药是一个高技术、高投入、长周期、高风险及高收益的基因工程制药是一个高技术、高投入、长周期、高风险及高收益的行业行业,一方面会吸引更多的企业进入一方面会吸引更多的企业进入,另一方面也会导致企业的重组甚至另一方面也会导致企业的重组甚至退出退出,是其成为最活跃、发展最快的行业之一是其成为最活跃、发展最快的行业之一l l 第二节 基因工程蛋白和多肽药物l l一、基因工程胰岛素一、基因工程胰岛素l l 早期用于治疗人类糖尿病的胰岛素来源于牛和猪的胰早期用于治疗人类糖尿病的胰岛素来源于牛和猪的胰腺腺,动物胰岛素和人类胰岛素很相似动物胰岛素和人类胰岛素很相似,但还是有差异但还是有差异,而且而且数量有限数量有限.通过基因工程手段可以批量生产人类胰岛素通过基因工程手段可以批量生产人类胰岛素,为为糖尿病患者带来福音糖尿病患者带来福音,尽管这类药物和动物胰岛素一样会尽管这类药物和动物胰岛素一样会引发免疫反应引发免疫反应,但仍有其应用价值但仍有其应用价值.二、基因工程人红细胞生成素 EPOEPO又成促红细胞生成素或红细胞生产刺激因子又成促红细胞生成素或红细胞生产刺激因子,是一是一类造血生长因子类造血生长因子,刺激和调节哺乳动物红细胞的生成刺激和调节哺乳动物红细胞的生成,维持外维持外周血细胞处于正常水平周血细胞处于正常水平.目前只有应用基因工程技术生产目前只有应用基因工程技术生产EPOEPO才能满足患者的需求才能满足患者的需求.三、基因工程干扰素 干扰素是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作干扰素是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白细胞因子用的可溶性糖蛋白细胞因子.早期干扰素的制备是通过诱早期干扰素的制备是通过诱导或重复诱导天然或人工培养的人体细胞或血细胞产生天导或重复诱导天然或人工培养的人体细胞或血细胞产生天然干扰素然干扰素,但价格昂贵而且产量有限但价格昂贵而且产量有限,从而限制了临床应用从而限制了临床应用.利用基因工程技术生产干扰素则完全解决了传统制备方案利用基因工程技术生产干扰素则完全解决了传统制备方案的弊端的弊端.四、基因工程疫苗l l 疫苗一般是由灭活或减毒的病原体做成的可预防相应疫苗一般是由灭活或减毒的病原体做成的可预防相应病原物引起疾病的药物病原物引起疾病的药物,通过接种人或动物在其体内建立通过接种人或动物在其体内建立抗感染免疫反应而产生保护作用抗感染免疫反应而产生保护作用.将基因工程技术应用于将基因工程技术应用于疫苗生产所得的疫苗即为基因工程疫苗疫苗生产所得的疫苗即为基因工程疫苗,其可有效的避免其可有效的避免潜在的污染物潜在的污染物.基因工程疫苗已经成为热门生物技术之一基因工程疫苗已经成为热门生物技术之一.五、基因工程抗体 在临床上在临床上,抗体可用于抗肿瘤、抗感染、抗器官移植抗体可用于抗肿瘤、抗感染、抗器官移植排斥反应、抗血栓形成和解毒排斥反应、抗血栓形成和解毒,以及构件独特型疫苗、治以及构件独特型疫苗、治疗自身免疫性疾病和变态反应疾病疗自身免疫性疾病和变态反应疾病,此外还可以用于以外此外还可以用于以外诊断和发挥体内药物导向作用诊断和发挥体内药物导向作用.基因工程抗体在临床上可基因工程抗体在临床上可发挥更多更重要的作用发挥更多更重要的作用.第三节 基因工程抗体一、抗体的结构l l 抗体分子是由抗体分子是由4 4条多肽链组成的四聚体条多肽链组成的四聚体,即由即由2 2条相同的轻链条相同的轻链(L)(L)和和2 2条相同的重链条相同的重链(H)(H)组成组成,重链之重链之间以及轻链与重链之间通过二硫键连接间以及轻链与重链之间通过二硫键连接,呈呈Y Y字型字型结构结构.重链由重链由450450个氨基酸组成个氨基酸组成(如抗体如抗体LgG),LgG),轻链由轻链由214214个氨基酸组成个氨基酸组成.抗原的识别位点位于轻链和重链抗原的识别位点位于轻链和重链的的NN端区域端区域(相当于轻链相当于轻链NN端一半的部位端一半的部位),),该区称为该区称为抗体的可变区抗体的可变区(variable region,V(variable region,V区区).).更精确的说抗原更精确的说抗原的识别和结合位点是的识别和结合位点是V V区的区的3 3个互补决区个互补决区(complementarity determining region,CDR),(complementarity determining region,CDR),也称超变也称超变区区(hypervariable region),(hypervariable region),每个每个CDRCDR长约长约516516个氨基个氨基酸酸.二、天然抗体的局限性l l 抗原往往具有多种不同抗原决定簇抗原往往具有多种不同抗原决定簇,从而刺激抗体产生从而刺激抗体产生多克隆抗体多克隆抗体.这种抗体是不均一的这种抗体是不均一的,会影响检测抗原的特异会影响检测抗原的特异性及敏感性性及敏感性,在临床上应用受到很大限制在临床上应用受到很大限制.l l 单克隆抗体是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产单克隆抗体是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一抗体生的均一抗体,可视为第二代抗体可视为第二代抗体,具高度特异性具高度特异性,均一性均一性,且且亲和力强亲和力强,效价高效价高,在临床上发挥了重要作用在临床上发挥了重要作用.然而然而,单克隆抗单克隆抗体在临床应用中也存在一些问题体在临床应用中也存在一些问题:l l1.1.单克隆抗体具有免疫原性单克隆抗体具有免疫原性.l l2.2.半衰期短半衰期短.l l3.3.吸收差吸收差.l l4.4.生产复杂生产复杂,价格较高价格较高.以上这些问题以上这些问题,基因工程抗体可很好地解决基因工程抗体可很好地解决,包括包括利用基因工程手段生产抗体利用基因工程手段生产抗体,以及将抗体基因进行切以及将抗体基因进行切割，拼接或修饰，产生新性状的抗体甚至产生新型割，拼接或修饰，产生新性状的抗体甚至产生新型抗体。抗体。l l三、基因工程抗体的种类l l1.1.1.1.单克隆抗体的人源化单克隆抗体的人源化单克隆抗体的人源化单克隆抗体的人源化 为了解决鼠源抗体的免疫原性问题，可采用两种方式改为了解决鼠源抗体的免疫原性问题，可采用两种方式改造抗体，即构建人造抗体，即构建人鼠嵌合抗体和人源化抗体。鼠嵌合抗体和人源化抗体。（1 1）人）人鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体 ：通过基因重组技术，将鼠源单：通过基因重组技术，将鼠源单克隆抗体的克隆抗体的FvFv片段替换人源抗体的相应片段所制成的。片段替换人源抗体的相应片段所制成的。（2 2）人源化抗体：是对嵌合抗体进一步改进的结果，即）人源化抗体：是对嵌合抗体进一步改进的结果，即仅用鼠源单克隆抗体的仅用鼠源单克隆抗体的CDRCDR区替换人源抗体的区替换人源抗体的CDRCDR所获得所获得的杂合抗体。的杂合抗体。l l2.2.2.2.小分子抗体小分子抗体小分子抗体小分子抗体l l 为了解决抗体的穿透性问题，可对抗体进行改造，保留为了解决抗体的穿透性问题，可对抗体进行改造，保留l l其抗原结合位点，使之成为小分子抗体。根据构建方法的其抗原结合位点，使之成为小分子抗体。根据构建方法的l l不同，可分为以下不同，可分为以下4 4种：种：l l（1 1）FabFab抗体。抗体的抗体。抗体的FabFab片段由重链的片段由重链的V V区和区和CH1CH1区与轻链区与轻链l l以硫键相连，能发挥抗体的抗原结合功能，其大小只有完整以硫键相连，能发挥抗体的抗原结合功能，其大小只有完整l l抗体的抗体的1/31/3。l l（2 2）单链抗体。将抗体的）单链抗体。将抗体的VHVH和和VLVL用连接肽连接，形成具有抗用连接肽连接，形成具有抗l l原结合能力的单链抗体多肽，即所谓的单链抗体。原结合能力的单链抗体多肽，即所谓的单链抗体。l l（3 3）单域抗体。抗体结合抗原的部位主要在）单域抗体。抗体结合抗原的部位主要在V V区，只含有区，只含有V V区区l l的小分子抗体。的小分子抗体。l l（4 4）超变区多肽。抗体与抗原的结合是通过）超变区多肽。抗体与抗原的结合是通过V V区的区的CDRCDR区来区来实实l l现的，现的，CDRCDR区是抗原抗体结合的最小识别单位。由单个区是抗原抗体结合的最小识别单位。由单个CDRCDR多多肽肽l l构成的小分子抗体称为超变区抗体。构成的小分子抗体称为超变区抗体。l l（5 5）双体抗体。将）双体抗体。将2 2种不同抗体的种不同抗体的VHVH和和VLVL区通过连接肽（区通过连接肽（55l l1010个氨基酸）连接，形成个氨基酸）连接，形成“杂交杂交”的单链抗体称作双体抗体。的单链抗体称作双体抗体。3.3.3.3.双功能抗体双功能抗体双功能抗体双功能抗体 天然的抗体分子是双价单特异性的，将小分子天然的抗体分子是双价单特异性的，将小分子抗体与其他蛋白如毒素、酶、细胞因子及受体分子抗体与其他蛋白如毒素、酶、细胞因子及受体分子连接在一起，可形成一种新型分子，这样的杂合分连接在一起，可形成一种新型分子，这样的杂合分子也称为双功能抗体，既可以与靶位点结合，又可子也称为双功能抗体，既可以与靶位点结合，又可以将特定的活化分子导向特定部位，发挥其生物学以将特定的活化分子导向特定部位，发挥其生物学功能功能。l l4.4.4.4.人源性抗体人源性抗体人源性抗体人源性抗体l l 由于鼠源抗体存在免疫原性，人们一直在努力制备完全人源化由于鼠源抗体存在免疫原性，人们一直在努力制备完全人源化l l的抗体，即人源性抗体。目前主要有的抗体，即人源性抗体。目前主要有2 2种方法用来制备人源种方法用来制备人源 蛋克蛋克l l隆抗体。隆抗体。l l （1 1）噬菌体抗体库。噬菌体抗体库技术是噬菌体表面展示技术）噬菌体抗体库。噬菌体抗体库技术是噬菌体表面展示技术l l在基因工程抗体应用上的一个成功范例，它可以模拟体内在基因工程抗体应用上的一个成功范例，它可以模拟体内B B淋巴淋巴l l细胞受到刺激后分化、成熟直至分泌抗体的过程。通过噬菌体表细胞受到刺激后分化、成熟直至分泌抗体的过程。通过噬菌体表l l面展示技术，可将目的蛋白或多肽的编码基因与编码面展示技术，可将目的蛋白或多肽的编码基因与编码M13M13噬菌体噬菌体l l颗粒末端蛋白的基因颗粒末端蛋白的基因3 3构建成融合基因。通过基因重组技术，将全构建成融合基因。通过基因重组技术，将全l l套人抗体重链和轻链的套人抗体重链和轻链的V V区基因与区基因与M13M13噬菌体基因噬菌体基因3 3构建成融合基构建成融合基l l因，在噬菌体表面以抗体因，在噬菌体表面以抗体FVFV片段片段-末端蛋白融合蛋白的形式表达，末端蛋白融合蛋白的形式表达，l l表达这些融合蛋白的噬菌体群体就构成了噬菌体抗体库。表达这些融合蛋白的噬菌体群体就构成了噬菌体抗体库。l l （2 2）人源性抗体转基因小鼠。通过构建转基因小鼠，可使小鼠）人源性抗体转基因小鼠。通过构建转基因小鼠，可使小鼠l l产生人源性单克隆抗体。用人的抗体基因转入小鼠并代替小鼠的产生人源性单克隆抗体。用人的抗体基因转入小鼠并代替小鼠的l l相应基因，产生能分泌人抗体的转基因小鼠。第一个获得的人源相应基因，产生能分泌人抗体的转基因小鼠。第一个获得的人源l l性抗体是抗破伤风类毒素的单克隆抗体。性抗体是抗破伤风类毒素的单克隆抗体。l l 在转基因小鼠基础上，建立了一种产生人抗体的小鼠模型。在转基因小鼠基础上，建立了一种产生人抗体的小鼠模型。l l5.5.5.5.基因工程抗体的产生基因工程抗体的产生基因工程抗体的产生基因工程抗体的产生l l（1 1）大肠杆菌表达系统。大肠杆菌是常用的表达系统，但）大肠杆菌表达系统。大肠杆菌是常用的表达系统，但l l由于缺乏糖基化能力，以及不利于抗体分子链间形成二硫键，由于缺乏糖基化能力，以及不利于抗体分子链间形成二硫键，l l因此主要用来表达抗体的因此主要用来表达抗体的FabFab、FvFv、ScFvScFv等小分子片段。等小分子片段。l l （2 2）酵母表达系统。酵母是真核微生物，与原核微生物相比）酵母表达系统。酵母是真核微生物，与原核微生物相比l l酵母菌能对异源蛋白进行糖基化等修饰，能有效分泌、正确折酵母菌能对异源蛋白进行糖基化等修饰，能有效分泌、正确折l l叠和加工蛋白。与哺乳动物表达系统相比，酵母能在简单培养叠和加工蛋白。与哺乳动物表达系统相比，酵母能在简单培养l l基上快速生长，是临床和工业生产上重要的蛋白表达系统。基上快速生长，是临床和工业生产上重要的蛋白表达系统。l l （3 3）哺乳动物细胞表达系统。中国仓鼠卵巢细胞（）哺乳动物细胞表达系统。中国仓鼠卵巢细胞（CHOCHO）抗）抗l l体表达系统是较成熟的哺乳动物细胞表达系统，它采用最有效体表达系统是较成熟的哺乳动物细胞表达系统，它采用最有效l l的来自人巨细胞病毒启动子，引导抗体基因在的来自人巨细胞病毒启动子，引导抗体基因在CHOCHO细胞中表达。细胞中表达。l l该表达系统能使表达的抗体正确装配、折叠和糖基化；能在无该表达系统能使表达的抗体正确装配、折叠和糖基化；能在无l l血清培养基中生长，分泌水平高；瞬时表达系统可表达足量抗血清培养基中生长，分泌水平高；瞬时表达系统可表达足量抗l l体，以便对抗体特异性和亲和力做快速鉴定。体，以便对抗体特异性和亲和力做快速鉴定。l l （4 4）植物系统表达。通过转基因技术，将抗体轻、重链基因）植物系统表达。通过转基因技术，将抗体轻、重链基因l l导入不同的烟草植物表达，再将表达轻、重链抗体的植株进行导入不同的烟草植物表达，再将表达轻、重链抗体的植株进行l l有性杂交，筛选产生全功能抗体的植株有性杂交，筛选产生全功能抗体的植株。l l（5 5）昆虫表达系统。昆虫表达系统是一类应用广泛的真）昆虫表达系统。昆虫表达系统是一类应用广泛的真l l核表达系统，它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后核表达系统，它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后l l修饰、加工以及转移外源蛋白的能力。其中利用杆状病毒修饰、加工以及转移外源蛋白的能力。其中利用杆状病毒l l在昆虫细胞表达外院蛋白是目前较为流行的表达系统。现在昆虫细胞表达外院蛋白是目前较为流行的表达系统。现l l在已经利用昆虫表达系统成功地生产了鼠源单克隆抗体、在已经利用昆虫表达系统成功地生产了鼠源单克隆抗体、l l人鼠嵌合抗体、单链抗体及人源单克隆抗体等多种抗体分人鼠嵌合抗体、单链抗体及人源单克隆抗体等多种抗体分l l子，还将抗体分子与尿激酶型纤溶酶原激活物等肿瘤相关子，还将抗体分子与尿激酶型纤溶酶原激活物等肿瘤相关l l蛋白进行了融合表达，这些抗体分子多数能正确装配，完蛋白进行了融合表达，这些抗体分子多数能正确装配，完l l成糖基化过程，具有相当的活性。成糖基化过程，具有相当的活性。第四节 核酸类药物 多种疾病在某种程度上是缺乏或多产生某种多种疾病在某种程度上是缺乏或多产生某种蛋白引起的，因此通过蛋白或多肽类药物可解决蛋白引起的，因此通过蛋白或多肽类药物可解决部分问题。利用核酸作为药物可以达到常规药物部分问题。利用核酸作为药物可以达到常规药物无法达到的效果。（第一个核酸药物无法达到的效果。（第一个核酸药物反义核酸反义核酸药物药物Formivisen)Formivisen)根据核酸药物的本质和作用方式，可将其为四大类：反义类核酸药物 核酸免疫 RNA干扰 基因治疗反义核酸药物 概念概念概念概念：反义核酸是一些人工合成的单链反义分子，可以通：反义核酸是一些人工合成的单链反义分子，可以通 过碱基互补原则与被感染细胞内部的某个靶标过碱基互补原则与被感染细胞内部的某个靶标mRNAmRNA或或 DNA DNA结合，抑制或封闭该基因的转录和表达，或切割结合，抑制或封闭该基因的转录和表达，或切割 mRNA mRNA使其丧失功能。使其丧失功能。反义核酸参与基因表达在原核生物中是一种普遍的现象。反义核酸参与基因表达在原核生物中是一种普遍的现象。意义意义意义意义：反义核酸对基因表达的有效调控给人类疾病治疗带：反义核酸对基因表达的有效调控给人类疾病治疗带来了新的希望，将反义核酸作为一种生化药物，有希望在来了新的希望，将反义核酸作为一种生化药物，有希望在征服人类的大敌如癌症、病毒类引起的疾病、艾滋病和遗征服人类的大敌如癌症、病毒类引起的疾病、艾滋病和遗传性疾病中发挥重要作用。传性疾病中发挥重要作用。分类分类分类分类：根据组成和特点可将其分为反义：根据组成和特点可将其分为反义RNARNA（antisense antisense RNA)RNA)、反义、反义DNADNA（antisense DNA antisense DNA）、肽核酸（）、肽核酸（peptide peptide nucleis acid,PNAnucleis acid,PNA）和核酶（）和核酶（ribozymeribozyme）。）。核酸疫苗核酸疫苗的工作方式核酸疫苗的工作方式核酸疫苗的工作方式核酸疫苗的工作方式：核酸疫苗（核酸疫苗（nucleic acid vaccine)nucleic acid vaccine)又称基因疫苗（又称基因疫苗（gene caccine)gene caccine)或或DNADNA疫苗疫苗（DNA vaccineDNA vaccine），是利用基因重组技术将编码抗原的基因装入载体，），是利用基因重组技术将编码抗原的基因装入载体，然后直接导入动物体内，通过机体细胞的转录系统合成蛋白，产生的然后直接导入动物体内，通过机体细胞的转录系统合成蛋白，产生的蛋白作为抗原诱导免疫系统产生免疫应答，即通过细胞和体液免疫反蛋白作为抗原诱导免疫系统产生免疫应答，即通过细胞和体液免疫反应产生抗体，从而达到预防和治疗疾病的目的。应产生抗体，从而达到预防和治疗疾病的目的。免疫载体免疫载体免疫载体免疫载体：核酸疫苗是通过疫苗载体将抗原编码基因导入机体而激发免疫的。核酸疫苗是通过疫苗载体将抗原编码基因导入机体而激发免疫的。进入体内的核酸必须表达出相应的蛋白抗原才能发挥疫苗的作用。为进入体内的核酸必须表达出相应的蛋白抗原才能发挥疫苗的作用。为此，疫苗载体起着重要的作用。典型的核酸疫苗载体有此，疫苗载体起着重要的作用。典型的核酸疫苗载体有pcDNA3.1pcDNA3.1，以，以及在此基础上去掉病毒复制单位并用双宿主可用的卡那霉素抗性基因及在此基础上去掉病毒复制单位并用双宿主可用的卡那霉素抗性基因替换氨苄青霉素抗性基因和新霉素抗性基因的改建载体替换氨苄青霉素抗性基因和新霉素抗性基因的改建载体Pvax1.(Pvax1.(见书见书349349页图页图18-618-6）核酸疫苗的优点核酸疫苗的优点：第一，安全性好，没有感染的危险；第一，安全性好，没有感染的危险；第二，免疫效果好，核酸疫苗能在自身细胞中产生与自然第二，免疫效果好，核酸疫苗能在自身细胞中产生与自然 抗原接近的外源性蛋白，能诱导产生类似自然抗原抗原接近的外源性蛋白，能诱导产生类似自然抗原 的免疫应答；的免疫应答；第三，制备简单，只需对编码抗原的基因进行免疫克隆，第三，制备简单，只需对编码抗原的基因进行免疫克隆，不需在体外表达和纯化蛋白质；不需在体外表达和纯化蛋白质；第四，核酸疫苗的本质是核酸分子，因而不同于蛋白质和第四，核酸疫苗的本质是核酸分子，因而不同于蛋白质和 活疫苗，可以在室温条件下保存，不存在疫苗的冷活疫苗，可以在室温条件下保存，不存在疫苗的冷 藏和低温运输问题，从而保证藏和低温运输问题，从而保证DNADNA疫苗的高效接种疫苗的高效接种 率；率；第五，免疫应答持久，外源基因的不断表达可持续提供抗第五，免疫应答持久，外源基因的不断表达可持续提供抗 原。原。RNA干扰 RNARNARNARNA干扰现象干扰现象干扰现象干扰现象 RNA RNA干扰（干扰（RNA interference,RNAiRNA interference,RNAi）是指对应于某种）是指对应于某种MrnaMrna的的正义正义RNARNA和反义和反义RNARNA组成的双链组成的双链RNARNA（ds RNAds RNA）分子使）分子使mRNAmRNA发生特异性降解，导致其不能表达的转录后基因沉发生特异性降解，导致其不能表达的转录后基因沉默（默（post transcriptional gene silencing,PTGS)post transcriptional gene silencing,PTGS)现象。现象。RNAi RNAi发挥作用的过程可分为两个阶段：发挥作用的过程可分为两个阶段：起始阶段：起始阶段：起始阶段：起始阶段：双链双链RNARNA分子进入细胞后被分子进入细胞后被DicerDicer的核酸酶切割的核酸酶切割为为21212323个核苷酸长的小分子干扰个核苷酸长的小分子干扰RNARNA片段（片段（small small interfering RNAinterfering RNA，siRNA).siRNA).然后双链然后双链siRNAsiRNA与核酸酶结合形成与核酸酶结合形成RNARNA诱导沉默复合体（诱导沉默复合体（RNA-induced silencing cimplex,RISC)RNA-induced silencing cimplex,RISC)效应阶段效应阶段效应阶段效应阶段:siRNAsiRNA打开双链从而激活打开双链从而激活RISCRISC，激活的，激活的RISCRISC通过通过碱基配对与对应的碱基配对与对应的mRNAmRNA结合，并在距离结合，并在距离siRNA3siRNA3端端1212个个碱基的位置切割碱基的位置切割mRNAmRNA。同时，。同时，siRNAsiRNA可作为引物并以可作为引物并以mRNA mRNA 为模板合成新的为模板合成新的ds RNAds RNA。RNARNARNARNA干扰的应用干扰的应用干扰的应用干扰的应用(见书见书351351页）页）基因治疗基因治疗的思想基因治疗的思想基因治疗的思想基因治疗的思想 基因治疗（基因治疗（gene therapy)gene therapy)是将目的基因放进特定载体中导入是将目的基因放进特定载体中导入靶细胞或组织，通过替换或补偿引起疾病的基因，或者关靶细胞或组织，通过替换或补偿引起疾病的基因，或者关闭或抑制异常表达的基因来克服疾病的治疗方法。闭或抑制异常表达的基因来克服疾病的治疗方法。基因治疗策略：其一，通过导入正常基因的方法来修复缺基因治疗策略：其一，通过导入正常基因的方法来修复缺陷基因的功能或者加强某些原有基因的功能。其二，通过陷基因的功能或者加强某些原有基因的功能。其二，通过导入抗原、抗体或细胞因子的编码基因到患者体内，改变导入抗原、抗体或细胞因子的编码基因到患者体内，改变患者免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。患者免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。基因治疗的实践基因治疗的实践基因治疗的实践基因治疗的实践基因治疗的工作原理基因治疗的工作原理基因治疗的工作原理基因治疗的工作原理 目的基因导入人体的方法目的基因导入人体的方法 腺病毒载体腺病毒载体重组人重组人p53p53腺病毒基因治疗药物腺病毒基因治疗药物