肝脏蛋白的提取和浓度测定优秀PPT.ppt

肝脏蛋白的提取和浓度测定现在学习的是第1页，共18页实验目的实验目的了解并掌握蛋白质的提取方法 了解掌握考马斯亮蓝法（Braford法）测定蛋白质含量的原理和方法 现在学习的是第2页，共18页实验内容实验内容实验目的实验目的肝脏组织蛋白肝脏组织蛋白肝脏组织蛋白肝脏组织蛋白的提取的提取的提取的提取蛋白的浓度测蛋白的浓度测蛋白的浓度测蛋白的浓度测定定定定现在学习的是第3页，共18页 原理原理：RIPA裂解液是一种传统的细胞组织快速裂解液，主要裂解成分含1%Triton X-100,0.5%胆氧胆酸钠（sodium deoxycholate）,0.1%SDS，得到的蛋白样品可以用于常规的Western。1.1.肝脏组织的提取肝脏组织的提取现在学习的是第4页，共18页操操作作步步骤骤超声匀浆超声匀浆冰上放置冰上放置 4度离心度离心吸取上清吸取上清1.1.肝脏组织的提取肝脏组织的提取组织取材组织取材现在学习的是第5页，共18页1.1.肝脏组织的提取肝脏组织的提取 （1）组织取材）组织取材：取约100mg大鼠肝脏组织，用灭菌的剪刀将组织块尽量剪碎，放入1.5ml 灭菌的EP管中 现在学习的是第6页，共18页1.1.肝脏组织的提取肝脏组织的提取 （2）超声匀浆）超声匀浆：加0.5mlRIPA裂解液（含50ulPMSF）,置于冰上，用超声匀浆器进行匀浆,超声每次10秒，重复3次现在学习的是第7页，共18页1.1.肝脏组织的提取肝脏组织的提取 （3）冰上放置）冰上放置：裂解完全后，冰上放置30分钟 现在学习的是第8页，共18页1.1.肝脏组织的提取肝脏组织的提取 （4）4度离心度离心：放入离心机中，4 12000rpm离心5min 现在学习的是第9页，共18页1.1.肝脏组织的提取肝脏组织的提取 （5）吸取上清）吸取上清：取上清分装于0.2ml离心管中并置于20保存，待用 现在学习的是第10页，共18页超声匀浆要保持低温超声强度以不产生泡沫为准注意事项现在学习的是第11页，共18页2.2.蛋白的浓度测定蛋白的浓度测定l考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法lBCA法法l紫外吸收法紫外吸收法lLowryLowry法法(Folin-(Folin-酚试剂法酚试剂法)l双缩脲法双缩脲法现在学习的是第12页，共18页现在学习的是第13页，共18页2.2.蛋白的浓度测定蛋白的浓度测定-考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法1976年年由由Bradford建建立立的的考考马马斯斯亮亮兰兰法法（Bradford法法），具具有有超超过过其其他他几几种种方方法法的的突突出出优优点点，因因而而正正在在得得到到广广泛泛的的应用。应用。考考马马斯斯亮亮兰兰能能与与蛋蛋白白质质的的疏疏水水微微区区相相结结合合，这这种种结结合合具具有有高高敏敏感感性性，考考马马斯斯亮亮兰兰G-250的的最最大大光光吸吸收收峰峰在在465nm，当当它它与与蛋蛋白白质质结结合合形形成成复复合合物物时时，其其最最大大吸吸收收峰峰改改变变为为595nm。在在595nm下下，光光密密度度与与蛋蛋白白质质含含量量呈呈线线性性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。关系，故可以用于蛋白质含量的测定。现在学习的是第14页，共18页15实验步骤空白管空白管 标准管标准管 测定管测定管 0 1 2 3 4 5 61mg/mL牛血清牛血清白蛋白溶液白蛋白溶液蒸馏水蒸馏水待测样品待测样品考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 1 5 5 5 5 5 5 5管号管号试剂试剂(ml)1.取试管取试管7支，编号，按下表加入试剂支，编号，按下表加入试剂:2.混匀混匀,室温放置室温放置2 min。在波长。在波长 595nm 处以处以0号管调号管调零，测定各管吸光度值。零，测定各管吸光度值。现在学习的是第15页，共18页16 以标准液的以标准液的蛋白质浓度蛋白质浓度为横坐标，为横坐标，吸光度值吸光度值为纵为纵坐标绘制标准曲线。坐标绘制标准曲线。C（蛋白浓度）（蛋白浓度）A（吸光度）（吸光度）Axcx 绘制标准曲线：绘制标准曲线：0.2 0.40.6 0.81.0mg/mLmg/mLOD现在学习的是第16页，共18页实验内容实验内容肾脏蛋白的提取蛋白的浓度测定现在学习的是第17页，共18页18认真操作认真操作-仔细观察仔细观察-用心分析用心分析-完成报告完成报告现在学习的是第18页，共18页