SDS-聚丙烯酰胺凝胶.ppt

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳一.什么是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳?1.聚丙烯酰胺凝胶:由丙烯酰胺单体(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素,以及加速剂四甲基乙 二胺(TEMED)作用下聚合交联而成的三维网状结构凝 胶.形成的凝胶具有稳定的亲水性,无电离基团,不带电荷,几乎无吸附和电渗作用.凝胶孔径可控制.*凝胶机械性能和孔径大小:由总浓度T%控制.即100ml凝胶溶液中含有Acr、Bis的总克数.T%越大,平均孔径越小,机械强度大.交联度C%:Acr和Bis的比例.即交联剂Bis占单体Acr与Bis总量的百分数.*分子量范围 适用的凝胶浓度(%)蛋 白 质 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸 104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.62.SDS:十二烷基磺硫酸钠(sodiumdodecylsulfate,SDS)阴离子去污剂在水溶液中以单体（monomer）和分 子团（micellae）的混合形式存在.破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非 共价键，使蛋白质变性(denature)而改变原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结合而形成带负电荷的蛋 白质-SDS复合物。聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物,电泳系统中加入一定浓度的SDS称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE).SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于蛋白质的分离、蛋白质或肽类分子量的测定.二.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理:SDS与样品中各蛋白质形成的SDS-蛋白质复合物带有大量的负电荷,从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低或减至最小,与此同时蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋向一致使被测物的泳动速率的大小完全取决与该物质的分子量.(一)蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子去污剂和 强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决 于亚基分子量的大小,而电荷因素可以被忽略。1.SDS 阴离子去污剂,变性剂,助溶剂.断裂分子内和分子间的氢键,分子去折叠,破坏蛋白质分子的二级和三级结构.2.强还原剂a.-巯基乙醇b.二硫苏糖醇(DTT)使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂.SDS和还原剂的作用：（1）分子被解聚（2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带 负电荷的蛋白质-SDS胶束。（3）蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超 过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了 不同分子之间原有的电荷差异 蛋白质-SDS胶束的特点 （1）形状像一个长椭圆棒 （2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的.（3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比.胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系.*不同的蛋白质分子有不同的电泳迁移率mR，自由迁移率m0和阻滞系数KR值 不同蛋白质的SDS复合物的m0值都很接近，分子量相差5倍的蛋白质之间，m0值只相差10%，如果忽略这个差 别,就可以认为，各种蛋白质-SDS复合物的m0基本上是一个定值。这表明，不同蛋白质的SDS复合物都带有相同密度的负电荷，并具有同样的构象它们的净电荷量与摩擦系数(f由溶液的粘滞性、蛋白质分子的大小和形状决定)之比（q/f）都接近于一个定值而不受各种蛋白质原来电荷、分子大小和形状的影响，因而，在溶液中，自由迁移率就表现出一致性；但在一定浓度的凝胶中，由于引入凝胶的分子筛效应，电泳迁移率mR就成为蛋白质分子量函数.3.影响SDS电泳的关键因素(1)溶液中SDS单体浓度（1mmol/L)大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1：1.4(2)样品缓冲液的离子强度（不0.26)低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度。（3）二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况 下，蛋白质分子才能被解聚,SDS才能定量地结合到蛋 白质分子上去，并使之具有相同的构象而给出相对迁 移率和分子量对数的线性关系。（二）缓冲系统的选择 一般情况下，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但 缓冲液的选择对蛋白质的分离和电泳的速度是非常 关键的。电泳缓冲液的种类：1.磷酸缓冲液 2.Tris-醋酸钠缓冲系统 3.咪唑缓冲液系统：比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速度比后者快一倍.4.尿素系统：适用分子量低于15KD的蛋白样品.5.Tris-甘氨酸系统：使用最多的缓冲液 6.Tris-硼酸盐缓冲液：测定糖蛋白的分子量（三）凝胶浓度的选择 由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后SDS-蛋白质胶束的大小，因此 凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。*不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度.（四）分子量测定 1.相对迁移率（relativemobility，Rf）Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝前沿的迁移距离得到的。测量位置应在蛋白带的中央。蛋白带迁移距离Rf=溴酚蓝迁移距离2.作图 以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐标，Rf为横坐标绘图 3.通过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标准曲线上 读出他的分子量 *a.标准蛋白质的相对迁移率最好在0.20.8之间均匀分布.b.SDS-凝胶电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做 标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。三.去污剂的选择 无离子去污剂：LubroW；Brij35，TweenTriton 阳离子去污剂：cetyltrimethylammoniumbromide（CTAB）cetylpyyridinium（CPC）阴离子去污剂：SDSdeoxycholate四.方法 1.分类 (1)根据对样品的处理方式的不同 还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同 连续电泳 不连续电泳（3）根据电泳的形式 圆盘电泳 垂直电泳 平板电泳 水平电泳连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗 粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应.不连续系统：缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度均不连 续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子 筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及 分辨率均较前者佳.不连续系统中的三种物理效应：电荷效应：分子筛效应:浓缩效应 2.2.操作操作 (1)(1)制备分离胶（制备分离胶（separating gel)(2)(2)制备积层胶制备积层胶(stacking gel）(3)加样样品的处理 在蛋白溶液中加入过量的SDS后,可引起以下的反应：蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或-二巯基乙醇后，蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护SH基团，而得到窄的电泳带。非还原的SDS处理 许多样品，如生理体液、血清或尿素，一般只需用1%SDS在100煮沸3分钟，并不需要加还原剂，此时二硫键不能被断裂，蛋白并没有完全被去折叠。(5)固定(6)染色考马斯亮蓝（coomassiebrilliantblue）R-250 三苯基甲烷，红蓝色，每个分子含有两个SO3H基团，偏酸性，和氨基黑一样也是结合在蛋白质的碱性基团上。G-250 二甲花青亮蓝，蓝绿色银染色 银染的机制是将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。(7)(7)照相，凝胶干燥照相，凝胶干燥(8)(8)定量测定定量测定3.电泳过程中的不正常现象（1）“微笑”现象 指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，说明凝胶的 不均匀冷却，中间部分冷却不好。（2）“皱眉”现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当 凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近 隔片的凝胶聚合不完全。(3)“拖尾”现象 样品溶解不佳引起(4)“纹理”现象 由于样品中的不溶颗粒引起的。(5)偏斜现象 电极放置不平行引起或加样位置偏斜而引起(6)(6)带太宽带太宽 加样加样量太多量太多或加样或加样孔泄漏孔泄漏引起引起蛋白质转移蛋白质经凝胶电泳分离后所得的区带通过另一次电泳转移到特定的固相支持物(常用硝酸纤维膜)上,称为转移电泳.蛋白质转移并固定特定的固相支持物上,然后一特定的亲和反应、免疫反应或结合反应以及显色系统分析此印迹,称为Western印迹法(WesternBlot).蛋白质转移步骤:1.SDS-PAGE电泳分离蛋白质.2.将已分离的蛋白质区带由电泳法转移至固相载体上.硝酸纤维膜 重氮苄氨基甲基膜上*固相载体:用于吸附生物大分子物质的固体材料.固相载体与蛋白质结合方式:(1)硝酸纤维膜:非共价吸附(2)重氮苄氨基甲基膜:共价结合Western印迹:鉴定蛋白质。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。步骤:1.固定:蛋白质行SDS-PAGE电泳并从聚丙烯酰胺凝胶上 转移至固相载体上.2.封闭:保持膜上没有特殊抗体结合的场所,使场所处于饱 和状态,用以保护特异性抗体结合到膜上并与蛋白 质反应.3.初级抗体(第一抗体):特异性4.第二抗体或配体试剂:与一抗特异性结合并作为指示剂5.显色封闭：用一种与待测物不反应的物质(如蛋白质、tween 20等)封阻载体印迹区域以外的剩余 吸附位点,使探针与印迹反应,且不吸附到 载体上,此过程称为封闭.封闭目的:使印迹结果背景干净,印迹的斑点或谱 带更为清晰.*第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度越快。此阶段分离效果肉眼不可见(只有在染色后才显出电泳区带)。第二阶段为电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压(100V)和大电流(12A)，通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3，3，二氨基联苯胺(呈硝酸纤维素膜棕色)和4氯1萘酚(呈蓝紫色)。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。优点:1.以膜为固定相,可在膜上对蛋白质进行多种检测和鉴定.例:放射自显影、染色、酶标免疫等 2.便于恢复蛋白质的天然构象应用：1.检测样品中特异蛋白的存在与否2.细胞中特异蛋白的半定量分析 同一蛋白质在不同细胞或统一细胞不同条件 下的相对含量分析.3.蛋白质分子相互作用的研究