细胞凋亡和细胞坏死.ppt

细胞凋亡与细胞坏死细胞凋亡与细胞坏死 细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡（科普（科普（科普（科普诗）诗）诗）诗）似秋叶的似秋叶的似秋叶的似秋叶的凋零，凋零，凋零，凋零，告别生命之辉煌；告别生命之辉煌；告别生命之辉煌；告别生命之辉煌；那难以计数的攻击、诱导，那难以计数的攻击、诱导，那难以计数的攻击、诱导，那难以计数的攻击、诱导，轻启着道道程序，轻启着道道程序，轻启着道道程序，轻启着道道程序，逼细胞步步走向生命的末端；逼细胞步步走向生命的末端；逼细胞步步走向生命的末端；逼细胞步步走向生命的末端；啊，活性氧处处肆虐，啊，活性氧处处肆虐，啊，活性氧处处肆虐，啊，活性氧处处肆虐，钙波涛惊石裂岸，钙波涛惊石裂岸，钙波涛惊石裂岸，钙波涛惊石裂岸，线粒体把生命之光一点一点拧淡线粒体把生命之光一点一点拧淡线粒体把生命之光一点一点拧淡线粒体把生命之光一点一点拧淡;细胞凋亡细胞凋亡（科普诗）（科普诗）似秋叶的凋零，似秋叶的凋零，告别生命之辉煌；告别生命之辉煌；那难以计数的攻击、诱导，那难以计数的攻击、诱导，轻启着道道程序，轻启着道道程序，逼细胞步步走向生命的末端；逼细胞步步走向生命的末端；啊，活性氧处处肆虐，啊，活性氧处处肆虐，钙波涛惊石裂岸，钙波涛惊石裂岸，线粒体把生命之光一点一点拧淡线粒体把生命之光一点一点拧淡;危难中的细胞啊，危难中的细胞啊，你沉稳不乱，你沉稳不乱，DNADNA片片切割，片片切割，化云梯直通天堂；化云梯直通天堂；细胞体分团相聚，细胞体分团相聚，把生命的凝重浓集在小体上；把生命的凝重浓集在小体上；分别了朝夕相处的伙伴，分别了朝夕相处的伙伴，再见了快乐美好的时光；再见了快乐美好的时光；这一切的一切又融入临近的胞体，这一切的一切又融入临近的胞体，腾出的空间再写生命的篇章。腾出的空间再写生命的篇章。细胞死亡形式细胞死亡形式1.细胞坏死 由于比较强烈的有害刺激或细胞内环境的严重紊乱而导致的细胞死亡。2.细胞凋亡 由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程称为细胞凋亡（apoptosis),又称程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD)。坏死坏死 凋亡凋亡1.1.性质性质病理性病理性,非特异性非特异性生理性或病理性，特异性生理性或病理性，特异性2.2.诱导因素诱导因素强烈病理性刺激强烈病理性刺激,随机发生随机发生生理性或较弱病理性刺激生理性或较弱病理性刺激,非随机发生非随机发生3.3.生化特点生化特点被动过程被动过程,无新蛋白合成无新蛋白合成,不不耗能耗能耗能的主动过程，有新蛋白合成耗能的主动过程，有新蛋白合成4.4.形态变化形态变化细胞结构全面溶解、破坏、细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀细胞肿胀胞膜及胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩固缩,膜可发泡成芽膜可发泡成芽,形成凋亡小体形成凋亡小体5.DNA5.DNA电泳电泳弥散性降解，电泳呈均一弥散性降解，电泳呈均一DNADNA片状片状DNADNA片段化（片段化（180-120bp180-120bp）,电泳呈电泳呈“梯梯”状条带状条带6.6.炎症反应炎症反应溶酶体溶酶体破裂，局部炎症反应破裂，局部炎症反应 溶酶体溶酶体相对完整，局部无炎症反应相对完整，局部无炎症反应7.7.凋亡小体凋亡小体无无有有8.8.基因调控基因调控无无有有细胞凋亡与坏死的比较细胞凋亡与坏死的比较细胞凋亡的生理和病理意义细胞凋亡的生理和病理意义1.1.确保正常发育、生长确保正常发育、生长:指趾间隙形成；指趾间隙形成；2.2.维持内环境稳定维持内环境稳定:组织细胞更新组织细胞更新(上皮组织上皮组织/血血细胞细胞/衰老细胞衰老细胞)、生理器官内分泌调控（子、生理器官内分泌调控（子宫产后复员宫产后复员/月经期子宫内膜脱落）、受损月经期子宫内膜脱落）、受损不能修复细胞或突变细胞清除；不能修复细胞或突变细胞清除；3.3.发挥积极的防御功能：病原微生物的宿主细发挥积极的防御功能：病原微生物的宿主细胞发生主动凋亡。胞发生主动凋亡。细胞凋亡与疾病发生机制的新认识细胞凋亡与疾病发生机制的新认识1.1.该该“死死”的细胞（如的细胞（如肿瘤细胞、自身反应性免疫细胞肿瘤细胞、自身反应性免疫细胞）未死未死，是造成肿瘤、自身免疫性疾病的主要发病机制，是造成肿瘤、自身免疫性疾病的主要发病机制之一。之一。细胞凋亡不足细胞凋亡不足2.2.不该不该“死死”的细胞（如的细胞（如神经元、心肌细胞神经元、心肌细胞）死死了了，这与老年性痴呆、心肌缺血，这与老年性痴呆、心肌缺血/再灌注损伤等再灌注损伤等发病有关。发病有关。细胞凋亡过度细胞凋亡过度细胞凋亡的过程细胞凋亡的过程1.1.凋亡信号转导凋亡信号转导2.2.凋亡基因激活凋亡基因激活3.3.细胞凋亡的执行细胞凋亡的执行4.4.凋亡细胞的清除凋亡细胞的清除凋亡过程及分期诱导期诱导期 执行期执行期 消亡期消亡期 凋凋亡亡诱诱导导因因素素受受体体cAMPCa2+神神经经酰酰胺胺死死亡亡信信号号凋凋亡亡相相关关基基因因激激活活Dnase激活激活Capases激活激活巨噬巨噬细胞细胞吞噬细胞吞噬细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡时细胞的主要变凋亡时细胞的主要变化化一、细胞凋亡的形态学改变一、细胞凋亡的形态学改变1.细胞膜的变化：微绒毛、细胞突起和细胞表面皱褶消失；细胞膜的变化：微绒毛、细胞突起和细胞表面皱褶消失；胞膜空泡化，内质网不断扩张并与胞膜融合形成芽状突起胞膜空泡化，内质网不断扩张并与胞膜融合形成芽状突起（出芽出芽）；）；2.细胞质变化：胞质浓缩、细胞器变化（线粒体变大脊增多细胞质变化：胞质浓缩、细胞器变化（线粒体变大脊增多可可空泡化空泡化，内质网腔扩大提供包裹膜）；，内质网腔扩大提供包裹膜）；3.细胞核变化：核内染色质浓缩细胞核变化：核内染色质浓缩边集边集空泡化、固缩、出芽、边集、凋亡小体空泡化、固缩、出芽、边集、凋亡小体（apoposis boby）最早期形态学改变是细胞间的间接最早期形态学改变是细胞间的间接丢失丢失 与邻近细胞脱离并失去微绒毛与邻近细胞脱离并失去微绒毛 胞浆浓缩及核质密度增高胞浆浓缩及核质密度增高 （DNA断裂）断裂）凋亡小体凋亡小体 识别、吞噬（无识别、吞噬（无炎症反应）炎症反应）典型的典型的凋亡小体（凋亡小体（apoposis boby）：）：由透亮空泡和不透由透亮空泡和不透光的浓密的核碎片两部分光的浓密的核碎片两部分组成。组成。胸腺细胞胸腺细胞正常凋亡胸腺细胞胸腺细胞正常正常凋亡细胞凋亡的生化改变细胞凋亡的生化改变1.DNA的片段化的片段化“梯梯”状条带状条带2.内源性核酸内切酶激活及其作用内源性核酸内切酶激活及其作用3.凋亡蛋白酶（凋亡蛋白酶（caspases）的激活及其作用）的激活及其作用1.DNA的片段化的片段化“梯梯”状状条条 带为细胞凋亡主要特带为细胞凋亡主要特征征几乎所有凋亡细胞均有核小体间的裂几乎所有凋亡细胞均有核小体间的裂 解，导致解，导致DNA 的断裂；的断裂；DNA降解过程的特异性：不伴有组蛋降解过程的特异性：不伴有组蛋 白和其它核蛋白的降解；白和其它核蛋白的降解；染色质在核小体间的裂解是凋亡细胞染色质在核小体间的裂解是凋亡细胞 和形态改变的基础；和形态改变的基础；DNA 片段化是凋亡的片段化是凋亡的“黄金标记黄金标记”。2.2.内源性核酸内切酶激活及其作用内源性核酸内切酶激活及其作用由一系列胞内信号转导环节激活，由一系列胞内信号转导环节激活，执行染色质执行染色质DNADNA切割切割3.Caspase 9 激活，需要通过激活，需要通过CARD（caspase-recruitment domain)、Apaf-1、细胞色素、细胞色素c、ATP等多个因子的参等多个因子的参与与1.1.灭活灭活细胞凋亡的抑制物（如细胞凋亡的抑制物（如Bcl-2Bcl-2）；）；2.2.水解水解细胞的蛋白质结构，细胞的蛋白质结构，导致细胞解体，形成导致细胞解体，形成凋亡凋亡小体（小体（apoposisapoposis bobyboby）；）；3.3.在凋亡级联反应中水解在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白相关活性蛋白，使该蛋白获，使该蛋白获得或丧失某种生物学功能得或丧失某种生物学功能CaspasesCaspases在凋亡中的主要作用在凋亡中的主要作用细胞凋亡的调控（一）细胞凋亡相关因素 1.1.诱导性因素诱导性因素 2.2.抑制性因素抑制性因素 (二)细胞凋亡信号的转导1.1.细胞凋亡的诱导因素细胞凋亡的诱导因素J.生理活性因子：生理活性因子：TNFTNF家族（家族（FasFas-L,TNF)-L,TNF)、TGFTGF、神经递质、神经递质(谷氨酸、多巴胺谷氨酸、多巴胺)、生长、生长因子撤退、因子撤退、GCGC等等 J.损伤相关因子：热休克、病毒感染、自损伤相关因子：热休克、病毒感染、自由基、癌基因、抑癌基因、放射线等由基、癌基因、抑癌基因、放射线等J.化疗药物化疗药物J.毒素：乙醇、毒素：乙醇、-淀粉样肽淀粉样肽2.2.细胞凋亡的抑制因素细胞凋亡的抑制因素.凋亡相关基因的抑制作用：凋亡相关基因的抑制作用：p53p53、bcl-2bcl-2、bclbcl-XL-XL等。等。.生理性抑制剂：生长因子、细胞外基质、生理性抑制剂：生长因子、细胞外基质、锌、雄激素、雌激素等锌、雄激素、雌激素等.病毒基因：腺病毒病毒基因：腺病毒E1BE1B、杆状病毒、杆状病毒p35p35、棒、棒状病毒状病毒IAPIAP、牛痘病毒、牛痘病毒CrmACrmA、EBV EBV BHRF1BHRF1等等.药物：药物：CalpainCalpain抑制剂、抑制剂、caspasescaspases抑制剂、促抑制剂、促癌剂、佛波豆蔻乙脂癌剂、佛波豆蔻乙脂(PMA)(PMA)等等(二二)细胞凋亡信号的转导细胞凋亡信号的转导 -凋亡信号转导系统特点凋亡信号转导系统特点 多样性：不同种类的细胞系统不同多样性：不同种类的细胞系统不同 偶联性：与增殖分化的信号系统交叉偶联偶联性：与增殖分化的信号系统交叉偶联 同一性：多因素，共用同一系统触发同一性：多因素，共用同一系统触发 多途性：同一诱导因素启动多条信号转导多途性：同一诱导因素启动多条信号转导途径途径细胞凋亡信号的转导细胞凋亡信号的转导诱导信号诱导信号cellR神经酰胺神经酰胺多多途径途径RSAPK/JNKP53 基因基因NF-kB,JNK/AP-1途径途径激活激活bax or 下调下调bcl-2ROSmtDNA 细胞凋亡相关基因细胞凋亡相关基因抑制凋亡基因：抑制凋亡基因：bcl-2bcl-2促进凋亡基因：促进凋亡基因：fasfas，P53P53双向调控基因：双向调控基因：c-mycc-myc，bclxbclxBcl-2Bcl-2抗凋亡机制抗凋亡机制直接的抗氧化直接的抗氧化抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质抑制促凋亡的抑制促凋亡的BaxBax，BakBak细胞毒作用细胞毒作用抑制抑制CaspasesCaspases激活激活维持细胞钙稳态维持细胞钙稳态细胞凋亡发生机制细胞凋亡发生机制（一）氧化损伤一）氧化损伤（二）钙稳态失衡（二）钙稳态失衡 (三三)线粒体损伤线粒体损伤（一）氧化损伤机制（一）氧化损伤机制氧自由基可破坏机体正常的氧化/还原的动态平衡，造成生物大分子的氧化损伤，干扰正常的生命活动，形成严重的氧化应激状态后果：诱导细胞凋亡。（二）钙稳态失衡引起细二）钙稳态失衡引起细 胞凋亡的可能机制胞凋亡的可能机制1.激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶(DNase)，降解DNA链；2.激活谷氨酰胺转移酶，催化细胞内肽链间的酰基转移，在肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成；3.激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因的转录；4.Ca2+在ATP的配合下使DNA链舒展，暴露出核小体之间的连接区内的酶切位点，有利于DNA内切酶切割DNA。细胞凋亡的生物学意义细胞凋亡的生物学意义1.1.发育发育 从低等动物到高等动物的发育，都存在着从低等动物到高等动物的发育，都存在着程序性细胞死亡的现象。程序性细胞死亡的现象。2.2.免疫系统免疫系统 淋巴细胞发育分化成熟过程中，始终淋巴细胞发育分化成熟过程中，始终伴随着细胞凋亡。伴随着细胞凋亡。3.3.衰老衰老 细胞凋亡与许多年龄相关疾病有直接或间细胞凋亡与许多年龄相关疾病有直接或间接的联系。接的联系。4.4.损伤与修复损伤与修复 5.5.肿瘤发生肿瘤发生 细胞增殖与死亡的速度平衡失调。细胞增殖与死亡的速度平衡失调。6.6.病毒致病病毒致病 病毒表达抗凋亡蛋白。病毒表达抗凋亡蛋白。细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测 随着研究技术的提高和对凋亡的认识不断深随着研究技术的提高和对凋亡的认识不断深入，检测凋亡的方法已从细胞、染色质到分入，检测凋亡的方法已从细胞、染色质到分子水平日趋完善和成熟。子水平日趋完善和成熟。1.1.形态学检测形态学检测2.DNA2.DNA降解分析降解分析3.3.凋亡酶学分析凋亡酶学分析4.4.凋亡相关蛋白分析凋亡相关蛋白分析5.5.流式细胞分析流式细胞分析一细胞凋亡的形态学分一细胞凋亡的形态学分析析 细胞凋亡的形态学变化主要表现细胞凋亡的形态学变化主要表现为：细胞皱缩为：细胞皱缩(cell shrinkage)，失去细失去细胞连接胞连接(cell junction)，微绒毛微绒毛(microvilli)消失，发泡消失，发泡(blebbing)，染色质浓集并靠近核膜，形成沿核膜收染色质浓集并靠近核膜，形成沿核膜收缩的新月状体缩的新月状体(crescents)，形成凋亡小形成凋亡小体体(apoptotic body)等。等。细胞凋亡的形态学检测方法细胞凋亡的形态学检测方法 检测方法检测方法 可鉴定凋亡细胞特征可鉴定凋亡细胞特征 光学显微镜光学显微镜 相差显微镜相差显微镜 透射电镜透射电镜 聚焦激光扫聚焦激光扫 描电镜描电镜 扫描电镜扫描电镜 流式细胞仪流式细胞仪 缩时摄影术缩时摄影术细胞体积缩小、核浓缩、细胞周围透明圈细胞体积缩小、核浓缩、细胞周围透明圈细胞发泡、凋亡小体细胞发泡、凋亡小体微绒毛消失、染色质沿核膜分布、新月体状核、微绒毛消失、染色质沿核膜分布、新月体状核、凋亡小体凋亡小体凋亡细胞内固缩染色质及核碎片定位凋亡细胞内固缩染色质及核碎片定位细胞膜表面泡状鼓起细胞膜表面泡状鼓起低前向散射光低前向散射光(FSC)、高侧向散射光高侧向散射光(SSC)凋亡细胞的形成过程凋亡细胞的形成过程二二.DNA降解分析降解分析DNA降解过程的特点：降解过程的特点：1.发生于凋亡早期，由内源性核酸内切发生于凋亡早期，由内源性核酸内切酶激活引起酶激活引起2.DNA在核小体连接部位断裂，产生在核小体连接部位断裂，产生180200bp为最小单位的单体或寡聚体为最小单位的单体或寡聚体片断片断3.DNA碎片可被细胞膜包裹，形成凋亡碎片可被细胞膜包裹，形成凋亡小体小体(一一)DNA凝胶电泳凝胶电泳 原理：凋亡细胞降解产生一系列原理：凋亡细胞降解产生一系列规则的规则的DNA片断，其电泳结果呈典型的片断，其电泳结果呈典型的“梯状带梯状带”(ladder)；而坏死或凋亡而坏死或凋亡后坏死细胞的后坏死细胞的DNA分解是随机的，产生分解是随机的，产生的碎片分子量大小不一，在电泳时形成的碎片分子量大小不一，在电泳时形成“涂片状涂片状”(smear)。普通琼脂糖凝胶电泳、普通琼脂糖凝胶电泳、Southern blotting、放射自显影放射自显影(32PdATP或或32PdCTP连接到连接到DNA片断的片断的3 端端)(二二)原位标记法原位标记法TUNEL(TdT mediated dUTP nick end labeling)终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记技术。位缺口末端标记技术。原理：在原理：在TdT的作用下，带有标记物的的作用下，带有标记物的dUTP被连接在断裂被连接在断裂DNA3末端，然后通过相应的方末端，然后通过相应的方法检测标记物，从而判断是否有凋亡发生。法检测标记物，从而判断是否有凋亡发生。应用范围：石蜡包埋的组织切片、冰冻组织切应用范围：石蜡包埋的组织切片、冰冻组织切片、培养细胞、组织中分离的细胞片、培养细胞、组织中分离的细胞(三三)ELISA法法 原理：以抗组蛋白抗体包被微孔板原理：以抗组蛋白抗体包被微孔板壁，加入标本，凋亡细胞的核小体可与抗壁，加入标本，凋亡细胞的核小体可与抗体结合，再加入抗体结合，再加入抗-DNA片断片断-POD复合复合物，与核小体中的物，与核小体中的DNA片断结合，最后片断结合，最后加入加入POD显色底物，以酶标仪测定光密度显色底物，以酶标仪测定光密度以进行定量分析。以进行定量分析。三三.凋亡酶学分析凋亡酶学分析1.内切核酸酶内切核酸酶(endonuclease,DNase)种类：种类：DNase （内质网、高尔基体内质网、高尔基体),DNase（溶酶体、胞核溶酶体、胞核)，NUC18（胞核，胞核，胸腺细胞中胸腺细胞中)等等 作用：作用：使使DNA断裂成断裂成180200bp或其或其倍数的片断倍数的片断 激活机制：激活机制：CAD(caspase-activate DNase)ICAD(inhibtor of CAD)检测：检测：Western BlottingCaspases的检测的检测 1.Caspase-3活性测定活性测定(FIENA法法)荧光测定免疫吸附法荧光测定免疫吸附法(flurometric immunosorbent enzyme assay,FIENA),caspase-3可作用于连接荧光素的特异底物乙酰可作用于连接荧光素的特异底物乙酰化天冬氨酸化天冬氨酸-谷氨酸谷氨酸-颉氨酸颉氨酸-天冬氨酰胺天冬氨酰胺(Ac-DEVD),产生发荧光的裂解产物产生发荧光的裂解产物AFC，且，且caspase-3活性与活性与Ac-DEVD-AFC分解的量或自分解的量或自由荧光由荧光AFC产生荧光的强弱成正比，故可定量检测产生荧光的强弱成正比，故可定量检测 2.蛋白印迹法蛋白印迹法 Caspases作用底物的检测作用底物的检测 PARP89kD的检测的检测四四.凋亡相关蛋白分析凋亡相关蛋白分析1.Bcl-2家族家族 促进凋亡：促进凋亡：Bax,Bal,Bcl-Xs,Bad,Bid,Bik,Bim,Hrk,Bok等等 抑制凋亡：抑制凋亡：Bcl-2,Bcl-Xl,Bcl-w,Mcl-1,A1/Bfl-1等等 均含有均含有BH(Bcl-2 homology)结构域，通过结构域，通过此结构域以二聚体形式调控凋亡。此结构域以二聚体形式调控凋亡。2.其他相关蛋白其他相关蛋白 p53,Myc,Fas等等 五、流式细胞分析五、流式细胞分析五、流式细胞分析五、流式细胞分析（Flow Flow CytometryCytometry，FCMFCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。现代细胞分析技术。FCM分析细胞凋亡的方分析细胞凋亡的方法法一一.细胞形态分析细胞形态分析二二.细胞膜结构与功能改变分析细胞膜结构与功能改变分析三三.细胞细胞DNA含量分析含量分析四四.TUNEL法法