细胞生物学研究方法(2010).ppt
细胞生物学研究方法(2010)Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望第一节第一节 显微技术显微技术光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。电子显微镜：以电子束为光源。电子显微镜：以电子束为光源。3.分辨力：指分辨物体最小间隔的能力分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。R=0.61/NA其中其中为入射光线波长；为入射光线波长；NA为镜口率为镜口率 sin/2，n=介质折射率；介质折射率；=镜口角（样品对物镜镜口的张角）镜口角（样品对物镜镜口的张角）。思考：思考：如何提高显微镜的分辨能力？如何提高显微镜的分辨能力？1.构成：构成：照明系统照明系统 光学放大系统光学放大系统 机械装置机械装置2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。像。（一）普通光学显微镜（一）普通光学显微镜（二）荧光显微镜二）荧光显微镜 Fluorescence microscope特特点点：光光源源为为紫紫外外线线，波波长长较较短短，分分辨辨力力高高于于普普通通显微镜；显微镜；有两个特殊的滤光片；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式。照明方式通常为落射式。把把透透过过标标本本的的可可见见光光的的光光程程差差变变成成振振幅幅差差，从从而而提提高高了了各各种种结结构构间间的的对对比比度度，使使各各种种结结构构变变得得清清晰晰可可见见。在在构构造造上上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。1.环形光阑（环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。）：位于光源与聚光器之间。2.相相位位板板（annular phaseplate）：物物镜镜中中加加了了涂涂有有氟氟化化镁镁的的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。（四）相差显微镜（四）相差显微镜倒置显微镜倒置显微镜 inverse microscope 物物镜镜与与照照明明系系统统颠颠倒倒，前前者者在在载载物物台台之之下下，后后者者在在载物台之上，载物台之上，用用于于观观察察培培养养的的活活细细胞胞，通通常常具具有有相相差差物物镜镜，有有的的还具有荧光装置。还具有荧光装置。Fluorescence image of epithelial cell,DNA in blue and Microtubules in green用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。观察、基因定位、疾病诊断。荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）（三）激光共聚焦扫描显微境（三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope,LCSM用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能能显示细胞样品的立体结构显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的分辨力是普通光学显微镜的3倍。倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像立体图像。激光共聚焦扫描显微镜二、电子显微镜二、电子显微镜（一）透射电子显微镜（一）透射电子显微镜transmission electron microscope,TEM透射电子显微镜透射电子显微镜TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM20世纪世纪60年代问世，年代问世，用来观察标本表面结构用来观察标本表面结构。分分辨辨力力为为610nm，由由于于人人眼眼的的分分辨辨力力（区区别别荧荧光光屏屏上上距距离离最最近近两两个个光光点点的的能能力力）为为0.2mm，扫扫描电镜的有效放大倍率为描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。（二）扫描电子显微镜（二）扫描电子显微镜人类红细胞人类红细胞酵母酵母人类精子人类精子Low speedHigh speedDifferential centrifugation差速离心的原理差速离心的原理原代培养原代培养(primary culture)(primary culture)直接从机体直接从机体取下细胞、取下细胞、组织和器官组织和器官后立即进行后立即进行培养培养 原原代代培培养养（primary culture）：即：直接来自动物机体的首次培养。传传代代培培养养（Passage）：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶称为传代或传传代代培培养养。细胞融合细胞融合 单克隆抗体技术单克隆抗体技术 1975年英国科学家Milstein和Kohler发明了单克隆抗体技术，获得1984年诺贝尔医学奖基因克隆基因克隆(gene cloning)(gene cloning)这项技术这项技术可概括为可概括为分、切、分、切、连、转、连、转、选选 动物细胞核移植克隆技术动物细胞核移植克隆技术 1997年，英国苏格兰罗斯林研究所细胞融合技术动物体细胞克隆转基因敲除小鼠的获得转基因敲除小鼠的获得 利用同源重组利用同源重组(基因打靶基因打靶)使使基因失活的方基因失活的方法法基因敲除是一基因敲除是一套组合技术，套组合技术，包括基因重组、包括基因重组、细胞分离、转细胞分离、转基因等基因等 两个关键技术两个关键技术:体外重组与体外重组与转基因鼠转基因鼠 基因敲进基因敲进(knockin)(knockin)将外源有功能的基因将外源有功能的基因(基因组中原先不存在基因组中原先不存在.或已失活的基因或已失活的基因),),转如细胞与基因组中的转如细胞与基因组中的同源序列进行同源重组同源序列进行同源重组,插入到基因组中插入到基因组中,在细胞内获得表达在细胞内获得表达,称为基因敲进称为基因敲进.
