农杆菌转化原理及技术讲课稿.ppt
农杆菌介导的水稻遗传 转化(zhunhu)原理及技术 颜静宛第一页，共28页。水稻遗传转化已成为水稻分子生物学 研究(ynji)和遗传改良的重要技术基础第二页，共28页。几种常用植物基因转化方法(fngf)的比较转化方法 农杆菌法农杆菌法PEG法法电击法电击法微针注射法微针注射法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法受体材料完整细胞原生质体原生质体原生质体完整细胞卵细胞宿主范围有无无无无有性繁殖植物组培条件简单复杂复杂复杂简单无嵌合体比例有无无无多无操作复杂性简单简单复杂复杂复杂简单设备要求便宜便宜昂贵昂贵昂贵便宜工作效率高低低低高低单子叶植物应用少可行可行可行广泛广泛第三页，共28页。农杆菌(gnjn)介导法的优点v操作简便v外源基因插入一般为单拷贝或低拷贝v转移DNA片段明确(mngqu)v可转移大片段DNAv可直接用不同的植物组织进行基因转移 第四页，共28页。农杆菌介导遗传(ychun)转化的原理第五页，共28页。v农杆菌是一种革兰氏阴性(ynxng)土壤杆菌，分为发根农杆菌（导致毛状根的发生）和根癌农杆菌（导致冠瘿瘤，冠瘿瘤细胞可产生正常细胞不能产生的冠瘿碱）。v根癌农杆菌含有可向植物转移并使植物致瘤的质粒（Ti质粒）。v根癌农杆菌的Ti质粒包括毒性区（Vir区）、结合区（Con区）、复制起始区（Ori区）和T-DNA区四个部分，其中与冠瘿瘤生成有关系的是Vir区和T-DNA区。第六页，共28页。vT-DNA区左右边界各有25bp的重复序列，其中14bp是核心，分10bp（CAGGAATATAT)和4bp（GTAA)不连续(linx)的两组，是完全保守的。vVir区为30Kb,由 VirA、VirB、VirC、VirD、VirG、VirH等七个操纵子共24个基因起共调控作用。第七页，共28页。Ti质粒结构质粒结构(jigu)示意图示意图 第八页，共28页。农杆菌农杆菌(gnjn)(gnjn)侵染过程侵染过程 v损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杆菌的侵染信号损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杆菌的侵染信号;v这些化学诱导物透过农杆菌的细胞膜这些化学诱导物透过农杆菌的细胞膜,活化活化virAvirA和和 virG virG基因基因,再诱导再诱导VirVir区的其他基因区的其他基因;vVirVir基因的活化基因的活化,作用于作用于T-DNAT-DNA的加工及的加工及T-DNAT-DNA的转移的转移;vT-DNAT-DNA进入植物细胞后整合到核进入植物细胞后整合到核DNADNA上上;vT-DNAT-DNA在植物细胞中表达产生冠瘿碱及植物激素在植物细胞中表达产生冠瘿碱及植物激素;v农杆菌农杆菌TiTi质粒上有专一性的冠瘿碱分解质粒上有专一性的冠瘿碱分解(fnji)(fnji)酶基因酶基因(ocs),(ocs),该基因启动合成各种酶该基因启动合成各种酶,分解分解(fnji)(fnji)植物细胞产生的冠瘿碱植物细胞产生的冠瘿碱作为惟一的碳源和氮源作为惟一的碳源和氮源;v冠瘿碱促进农杆菌的附着及激活冠瘿碱促进农杆菌的附着及激活tratra基因有利于基因有利于TiTi质粒的接合质粒的接合转移转移,扩大侵染范围扩大侵染范围第九页，共28页。根癌农杆菌通过基因转化把T-DNA上的基因导入植物(zhw)细胞并整合到核DNA上。第十页，共28页。Biology of A.tumefaciensWell known to induce crown gall tumor A.tumefaciens lives around root surfaces(in rhizosphere)where it using nutrients that leak from the root tissuesinfects only through wound sites and actively chemotactic to themPlant wound produces acetosyringone Bacterial T-plasmid produces receptors for acetosyringone 第十一页，共28页。Produce callus transform callus stimulate shooting by cytokinin addition+cytokininThis procedure is easy for dicotyledone plants(legumes etc)第十二页，共28页。第十三页，共28页。农杆菌介导转化(zhunhu)水稻的方法第十四页，共28页。水稻（籼稻水稻（籼稻(xindo)(xindo)）根癌农杆菌转化）根癌农杆菌转化技术流程技术流程愈伤诱导愈伤诱导(yudo)共培养共培养抗性愈伤的筛选抗性愈伤的筛选(shixun)与与再生成完整植株再生成完整植株整整 个个 操操 作作 过过程程 约约 需需8 8天天第一天（预培养）第一天（预培养）第三天（划菌）第三天（划菌）第五天（侵染、共培养第五天（侵染、共培养)第八天（脱菌、筛选）第八天（脱菌、筛选）N NB B培培养养基基为为基基本本培培养养基基加加入入相相应应植植物物生生长长调调节节剂剂 技术关键：技术关键：诱导与培养诱导与培养“状态良好状态良好”的胚性愈伤组织；用于转化的胚性愈伤的继代的胚性愈伤组织；用于转化的胚性愈伤的继代次数不超过次数不超过8 8代；高密度根农杆菌液侵染与共培养；干燥处理；共培养后有效去除代；高密度根农杆菌液侵染与共培养；干燥处理；共培养后有效去除农杆菌或者抑制农杆菌生长（合适的抗生素及其浓度）；快速筛选（农杆菌或者抑制农杆菌生长（合适的抗生素及其浓度）；快速筛选（2-32-3次筛选）；次筛选）；迅速分化再生。迅速分化再生。第十五页，共28页。一、一、培养基培养基v基本培养基为NB培养基，愈伤诱导、转化及分化等培养基配方(pi fng)如下：v1.诱导培养基：NB+2,4-D2 mgL-1；pH 5.8-5.9。v2.预培养培养基：NB+2,4-D2 mgL-1；pH 5.8-5.9。v3.共培养培养基：NB+2,4-D2 mgL-1+AS100 ML-1；pH 5.2。v4.选择培养基：NB+2,4-D 2mgL-1+羧苄青霉素 250mgL-1+Hyg 30-50 mgL-1，pH 5.8-5.9。v5.分化培养基：NB+KT10mgL-1+NAA0.4 mgL-1；pH 5.8-5.9。v6.生根培养基：1/2MS；pH 5.8-5.9。第十六页，共28页。二、胚性愈伤组织二、胚性愈伤组织(zzh)的诱导及继代的诱导及继代 v取水稻授粉后15-20d的未成熟穗，将未成熟种子剥壳(bo k)，用75%乙醇浸泡1min，再转入25的次氯酸钠溶液中振荡灭菌25min，于超净工作台中无菌水冲洗3-5次，将消毒后种子的幼胚挑出并接种于诱导培养基中，每皿约30粒，于28暗培养7d，切除胚根，继续培养7d，待愈伤长大后进行继代培养。从第三代开始可以选择适当的胚性愈伤用于农杆菌转化。第十七页，共28页。胚性愈伤胚性愈伤第十八页，共28页。三、农杆菌(gnjn)介导转化水稻 v1.愈伤组织的预培养v选取自然分散、颜色(yns)鲜黄、直径约为2-3mm的颗粒状愈伤，转接到预培养培养基中，置于27暗培养4天。第十九页，共28页。v2.农杆菌的培养及处理v从低温（-85）冻存管中刮取少量菌液于附加Kan50 mgL-1和Rif50 mgL-1YEB固体(gt)培养基划线，然后在28暗培养3672h进行活化；取活化平板上的单菌落转接划菌，28培养两天后，用适量添加有100ML-1乙酰丁香酮（AS）的AAM培养基将菌洗脱，悬浮于添加有100ML-1乙酰丁香酮20 ml AAM培养基中，剧烈摇动1min后，调整菌液浓度至OD600nm=1.52.0，静置1h，以便让农杆菌形成悬浮液。第二十页，共28页。v3.3.共培养共培养v取经预培养的愈伤于灭菌的培养瓶中，加入取经预培养的愈伤于灭菌的培养瓶中，加入上述上述(shngsh)(shngsh)处理的农杆菌菌液，略微摇处理的农杆菌菌液，略微摇动后静置动后静置30min30min，于无菌滤纸上晾干愈伤后接，于无菌滤纸上晾干愈伤后接种于共培养基，种于共培养基，2525暗培养暗培养3d3d。第二十一页，共28页。v4.洗除农杆菌v挑取共培养后的愈伤于广口培养瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动(yo dng)数次，直至水中不见丝状菌体。最后一次用含250 mgL-1羧苄青霉素的无菌水静置1h，然后置于无菌滤纸上晾干。第二十二页，共28页。v5.愈伤组织的筛选(shixun)v将愈伤转移至选择培养基筛选(shixun)抗性愈伤，每两周转接1次。抗性愈伤抗性愈伤 非抗性愈伤非抗性愈伤第二十三页，共28页。v6.抗性愈伤组织(zzh)的继代与植株的再生v每两周将愈伤转移至新选择培养基上，约需三周即可见瘤状鲜黄色抗性愈伤从褐化干瘪的愈伤中长出。待愈伤长大后挑选抗性愈伤的一部分转移至分化培养基上。2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽，随后根也长出。将幼苗移至生根培养基上，每培养瓶1个克隆。待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗净根上的培养基后，移至温室盆栽。第二十四页，共28页。v 抗性愈伤的分化抗性愈伤的分化(fnhu)(fnhu)抗性苗的生抗性苗的生根根第二十五页，共28页。v 转基因植株(zhzh)田间种植第二十六页，共28页。转化率、分化转化率、分化(fnhu)率和共转化率的计算率和共转化率的计算v抗性愈伤获得率（%）=抗性克隆(k ln)数/转化克隆(k ln)数100%v绿苗率（%）=再生克隆(k ln)数/抗性克隆(k ln)数100%第二十七页，共28页。第二十八页，共28页。
