动物细胞工程 (2)精选课件.ppt

关于动物细胞工程(2)第一页，本课件共有111页内容介绍内容介绍一般概述一般概述相关概念相关概念细胞培养准备与操作要点细胞培养准备与操作要点（灭菌、营养、保存）（灭菌、营养、保存）动物细胞培养方法动物细胞培养方法动物细胞工程应用动物细胞工程应用2第二页，本课件共有111页第一节第一节 概述概述 动物细胞工程是以动物细胞工程是以动物细胞培养技术动物细胞培养技术为为主要手段，对动物细胞在离体条件下的细胞主要手段，对动物细胞在离体条件下的细胞形态、结构、生理功能进行研究，在此基础形态、结构、生理功能进行研究，在此基础上，采用工程技术手段对细胞的遗传或生理上，采用工程技术手段对细胞的遗传或生理特性进行改造，以获得有价值的细胞产物、特性进行改造，以获得有价值的细胞产物、器官或个体的生物技术。器官或个体的生物技术。3第三页，本课件共有111页动物细胞工程主要包括：动物细胞工程主要包括：动物细胞培养动物细胞培养细胞杂交（融合）技术细胞杂交（融合）技术胚胎培养胚胎培养细胞核移植细胞核移植干细胞培养干细胞培养等。等。4第四页，本课件共有111页一、体外培养技术的产生与发展一、体外培养技术的产生与发展 1919世纪后期，胚胎学的发展极为世纪后期，胚胎学的发展极为迅速，人们在研究胚胎学时，将一迅速，人们在研究胚胎学时，将一些活的组织放在体外进行观察，从些活的组织放在体外进行观察，从而拉开了培养技术的序幕。而拉开了培养技术的序幕。5 5第五页，本课件共有111页1.早期组织培养早期组织培养1859年，法国解剖学家年，法国解剖学家Vulpain将将蛙尾组织蛙尾组织在水中在水中培养，观察到了生长与分化现象。培养，观察到了生长与分化现象。1885年，德国人年，德国人Roux用温用温生理盐水在体外培养鸡胚生理盐水在体外培养鸡胚组织组织并使之存活了数天，被认为是组织培养的萌芽。他并使之存活了数天，被认为是组织培养的萌芽。他首次提出了组织培养的概念首次提出了组织培养的概念。1897年，年，Loeb首次在含有首次在含有血凝块血凝块的试管中培养兔的试管中培养兔的甲状腺、卵巢、肾脏等，发现这些器官在的甲状腺、卵巢、肾脏等，发现这些器官在3天内仍天内仍保持正常的组织学结构。他的工作被认为是保持正常的组织学结构。他的工作被认为是器官培器官培养的最早尝试养的最早尝试。6第六页，本课件共有111页2.2.基本培养技术的建立基本培养技术的建立1907年，实验胚胎学家年，实验胚胎学家Harrison（哈里森）为了（哈里森）为了研究神经突起的起源问题而进行了一项著名的实研究神经突起的起源问题而进行了一项著名的实验：在无菌条件下将验：在无菌条件下将蛙胚神经组织蛙胚神经组织接种在蛙的淋巴接种在蛙的淋巴液中，放在一快盖玻片上，然后将盖玻片翻转并密封液中，放在一快盖玻片上，然后将盖玻片翻转并密封在一张凹玻片上，因而创建了在一张凹玻片上，因而创建了盖片悬滴培养法盖片悬滴培养法。Harrison采用该方法将神经组织培养了数周，并采用该方法将神经组织培养了数周，并观察到神经突起的生长。这项工作观察到神经突起的生长。这项工作标志着体外培标志着体外培养技术的创立养技术的创立。7第七页，本课件共有111页1912年，外科医生外科医生Carrel（卡勒尔）将外科手（卡勒尔）将外科手术的术的无菌操作观念无菌操作观念带入体外培养技术，并连续培带入体外培养技术，并连续培养鸡胚心肌组织长达数年。养鸡胚心肌组织长达数年。无菌观念已经成为体无菌观念已经成为体外培养的最重要理念外培养的最重要理念。Carrel的第二个重要贡献是将组织包埋技术、的第二个重要贡献是将组织包埋技术、营养供应和细胞传代技术引入体外培养实验，使营养供应和细胞传代技术引入体外培养实验，使Harrison的的盖片悬滴培养法盖片悬滴培养法更加完善。更加完善。1923年，年，Carrel又设计出又设计出卡氏瓶培养法卡氏瓶培养法，进，进一步扩大了组织的培养空间，卡氏瓶已成为体外一步扩大了组织的培养空间，卡氏瓶已成为体外培养的重要器皿。培养的重要器皿。8第八页，本课件共有111页1925年，年，Maximow又把又把Harrison的悬滴培养的悬滴培养法改良为法改良为双盖片培养双盖片培养,因而极大地方便了培养因而极大地方便了培养液的更换，大大降低了污染的机会。液的更换，大大降低了污染的机会。双盖片双盖片培养培养在体外培养的历史上发挥了重要作用，在体外培养的历史上发挥了重要作用，至今仍有不少学者采用这种方法。至今仍有不少学者采用这种方法。1926年，年，Strangewags设计了设计了试管培养法试管培养法，并改良了器官培养的营养供应方式，开始并改良了器官培养的营养供应方式，开始以以血浆和胚胎提取液混合物代替单纯的血凝块血浆和胚胎提取液混合物代替单纯的血凝块。9第九页，本课件共有111页1933年，年，Go Gey创立了创立了旋转管培养法旋转管培养法，并，并以此建立了许多细胞系。如来源于人的肿瘤以此建立了许多细胞系。如来源于人的肿瘤组织的组织的Hela细胞系细胞系。1949年，年，Polge等人发现等人发现甘油甘油能够用于保护能够用于保护低温下储藏的细胞。同年，低温下储藏的细胞。同年，Hanks等提出了等提出了Hanks平衡盐溶液平衡盐溶液。10第十页，本课件共有111页3.3.体外培养技术的发展体外培养技术的发展l1950年，年，J F Morgan等人提出了等人提出了199培培养基养基。l1951年年Pomerat设计出设计出灌流小室灌流小室，实现，实现了培养液的不断更新了培养液的不断更新；l1954年，年，Earle等建立了等建立了悬浮培养法悬浮培养法。11第十一页，本课件共有111页1957年，年，Dulbecco采用采用胰蛋白酶消化法胰蛋白酶消化法分分离细胞，创造了离细胞，创造了单层细胞培养法单层细胞培养法，以后的学，以后的学者采用该方法建立了许多细胞系（者采用该方法建立了许多细胞系（cell line）。）。1959年，年，Lovelock等人发现了一种新的等人发现了一种新的化学化学冷冻保护剂冷冻保护剂二甲基亚砜二甲基亚砜（DMSO）1960年，年，Baski观察到两种不同细胞混合培观察到两种不同细胞混合培养所产生的细胞自发养所产生的细胞自发融合现象融合现象。12第十二页，本课件共有111页二、动物细胞的体二、动物细胞的体外培养生长特性外培养生长特性13第十三页，本课件共有111页 除单细胞原生动物外，细胞培养过程具有以下特性；l 细胞生长缓慢细胞生长缓慢，分裂周期长，一般12-48小时，而且易受环境因素的影响；如CHO（中国仓鼠卵巢癌细胞）12.5小时，人胚肺成纤维细胞21小时；易受微生物污染，培养时需用抗生素培养时需用抗生素；l 动物细胞较微生物大得多，无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差适应环境能力差；l 培养过程需氧量少需氧量少，对搅拌搅拌或剪切力敏感；1.动物细胞培养特性动物细胞培养特性14第十四页，本课件共有111页 在培养中，细胞相互粘连以在培养中，细胞相互粘连以集群形式集群形式存在，存在，培养过程具有群体效应、锚地依赖性、功能培养过程具有群体效应、锚地依赖性、功能全能性及全能性及接触抑制性接触抑制性（有（有接触抑制现象接触抑制现象，即，即细胞在培养器皿表面生长到一定程度，相互细胞在培养器皿表面生长到一定程度，相互紧密接触时，细胞停止生长紧密接触时，细胞停止生长）：）：对环境因素非常敏感对环境因素非常敏感。培养器皿的特性、培。培养器皿的特性、培养液的温度、养液的温度、pH值、溶氧浓度、营养成分及值、溶氧浓度、营养成分及含量等均影响到细胞生长与分裂含量等均影响到细胞生长与分裂 原代培养细胞一般繁殖原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。代即退化死亡。15第十五页，本课件共有111页2 2、体外培养细胞生长方式、体外培养细胞生长方式 在活体内在活体内，细胞的形态与其功能密切相，细胞的形态与其功能密切相关。如肌细胞呈纤维状，便于收缩；神经细关。如肌细胞呈纤维状，便于收缩；神经细胞发出许多分支，便于形成网络；红细胞呈胞发出许多分支，便于形成网络；红细胞呈圆盘状，便于气体交换；上皮细胞呈不规则圆盘状，便于气体交换；上皮细胞呈不规则状，便于覆盖在器官表面相互挤压。状，便于覆盖在器官表面相互挤压。16第十六页，本课件共有111页在离体条件下，细胞一般表现为三种形态：在离体条件下，细胞一般表现为三种形态：（1 1）贴壁依赖型（贴壁依赖型（anchorage-dependent)anchorage-dependent)细细胞胞；（2 2）非贴壁依赖型（非贴壁依赖型（anchorage-anchorage-independent)independent)细胞细胞：也称为：也称为悬浮型细胞悬浮型细胞，包，包括来源于血液的细胞和许多括来源于血液的细胞和许多肿瘤细胞。肿瘤细胞。（3 3）兼性贴壁细胞兼性贴壁细胞：主要是一些细胞系，如：主要是一些细胞系，如CHOCHO细胞。细胞。17第十七页，本课件共有111页贴壁依赖型细胞包括贴壁依赖型细胞包括：（：（P87P87）1）成成纤纤维维细细胞胞：细细胞胞贴贴壁壁后后呈呈梭梭形形，细细胞胞中中央央有有圆圆形形的的核核，胞胞质质向向外外伸伸出出2-32-3个个长长短短不不一一的的突突起起，生生长长时时细细胞胞群群呈呈放放射射状状。成成纤纤维维细胞、肌细胞、成骨胳细胞均具有这种特点；细胞、肌细胞、成骨胳细胞均具有这种特点；2）上上皮皮型型细细胞胞：细细胞胞贴贴壁壁后后呈呈不不规规则则三三角角形形或或柳柳叶叶形形，细细胞胞中中央央有有圆圆形形的的核核，生生长长时时细细胞胞紧紧密密连连接接，长长成成单单层层片片状状。如如皮皮肤肤表表皮皮细细胞胞、肝肝细细胞胞、肺肺上上皮皮细细胞胞消消化化管管外外皮皮细细胞胞，肝肝脏脏上皮细胞等等均具有这种特点；上皮细胞等等均具有这种特点；3）游游走走型型细细胞胞：如如神神经经胶胶质质细细胞胞,分分散散生生长长，位位置置不不固固定定，外外形不规则等；形不规则等；4）多形型细胞多形型细胞：不常见，形态不规则，如神经组织细胞。不常见，形态不规则，如神经组织细胞。第十八页，本课件共有111页贴壁生长细胞的生长过程：贴壁生长细胞的生长过程：u游离期：细胞变圆游离期：细胞变圆u吸附期：因细胞不同而有差异吸附期：因细胞不同而有差异u潜伏期：细胞不分裂潜伏期：细胞不分裂u繁殖期：细胞分裂增值繁殖期：细胞分裂增值u停止、退化期：营养耗尽，产物积累，停止、退化期：营养耗尽，产物积累，细胞停止分裂并开始退化细胞停止分裂并开始退化19第十九页，本课件共有111页l细胞接种后在培养液中呈悬浮细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态，状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。呈圆球形。l10分钟一分钟一4小时小时游离期：游离期：吸附期：吸附期：l细胞附着于底物上，游离期细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞结束。细胞株平均在株平均在10分钟一分钟一4小时贴壁。小时贴壁。l 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等等20第二十页，本课件共有111页 血清中有促使细胞贴壁的血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）功能基团）为何会贴壁？为何会贴壁？21第二十一页，本课件共有111页细胞贴壁的过程：细胞贴壁的过程：22第二十二页，本课件共有111页l对数生长繁殖期：对数生长繁殖期：细胞数随时间变化成倍增长，呈细胞数随时间变化成倍增长，呈对数生长对数生长状态，状态，活力最佳，最适合进行实验研究。活力最佳，最适合进行实验研究。l潜伏期潜伏期 此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为株潜伏期一般为624小时。小时。23第二十三页，本课件共有111页v对数生长期是细胞活力最好的时期，在接种细对数生长期是细胞活力最好的时期，在接种细胞数量适宜情况下，指数生长期持续胞数量适宜情况下，指数生长期持续3-5d后，后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制接触抑制（Contact inhibition）。）。而恶性细胞则无而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区分正常接触抑制现象，因此接触抑制可作为区分正常与癌细胞标志之一。与癌细胞标志之一。v癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生的影响而发生密度抑制密度抑制（Density inhibition）24第二十四页，本课件共有111页l停止期（平台期）停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性。机制：接触抑制、密度依赖性。l退化期退化期：代谢产物积累，代谢产物积累，PH下降，细胞中毒受损，大量下降，细胞中毒受损，大量细胞出现死亡。细胞出现死亡。25第二十五页，本课件共有111页26第二十六页，本课件共有111页容易更换培养基；容易更换培养基；可采用灌注培养；可采用灌注培养；方便产物表达；方便产物表达；方便调节培养液与细胞的比例；方便调节培养液与细胞的比例；易于观察等。易于观察等。细胞贴壁生长优点细胞贴壁生长优点（P104）:27第二十七页，本课件共有111页3、体外培养细胞的生长与增殖1）、潜伏期（）、潜伏期（Latent phase）2）、指数生长期、指数生长期（Logarthmic growth phase）3）、停滞期）、停滞期（Stagnate phase）4）、死亡期）、死亡期28第二十八页，本课件共有111页胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健肽健，除去细胞间，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白粘蛋白及糖蛋白，影响细，影响细胞骨架，从而使细胞分离胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25，用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 胰蛋白酶消化液胰蛋白酶消化液29第二十九页，本课件共有111页第二节第二节 常见概念常见概念30第三十页，本课件共有111页一、原代培养与传（继）代培养一、原代培养与传（继）代培养1 1、原代培养（、原代培养（primary culture):primary culture):将组织将组织取出来后，先用胰蛋白酶等使组织分散取出来后，先用胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的细成单个细胞，然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，再将该悬浮液放入培养瓶中，胞悬浮液，再将该悬浮液放入培养瓶中，在培养箱中培养，这个过程称为在培养箱中培养，这个过程称为原代培原代培养养 。31第三十一页，本课件共有111页2 2、传（继）代培养（、传（继）代培养（secondary culture,secondary culture,passage,split):passage,split):细胞在培养瓶中贴壁生长。细胞在培养瓶中贴壁生长。随着细胞的生长和增殖，培养瓶中的细胞越来随着细胞的生长和增殖，培养瓶中的细胞越来越多，需要定期地用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上越多，需要定期地用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来，配制成细胞悬浮液，分装到两个或脱离下来，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中培养，这称为两个以上的培养瓶中培养，这称为传代培养传代培养。32第三十二页，本课件共有111页小细节问题小细节问题 v当细胞生长达到一定密度后，都需要做传代处理，当细胞生长达到一定密度后，都需要做传代处理，传代的频率传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖速度有关。数量和细胞增殖速度有关。v所谓细胞所谓细胞“一代一代”，即从细胞接种到分离再培，即从细胞接种到分离再培养的一段时间。如某一细胞系为养的一段时间。如某一细胞系为50代即该细胞已代即该细胞已传代传代50次。次。第三十三页，本课件共有111页二、细胞二、细胞株株与细胞系与细胞系1、细胞株（、细胞株（cell strain):原代培养的细胞原代培养的细胞一般传至一般传至10代左右就不容易传下去了，代左右就不容易传下去了，细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。但是有极少数的细胞能够度衰老死亡。但是有极少数的细胞能够度过过“危机危机”而继续传下去，这些存活的而继续传下去，这些存活的细胞一般能够传到细胞一般能够传到4050代，这种传代代，这种传代细胞叫做细胞叫做细胞株细胞株。细胞株细胞的遗传物。细胞株细胞的遗传物质没有发生改变。质没有发生改变。34第三十四页，本课件共有111页2、细胞系、细胞系(cell line)：当细胞株传至当细胞株传至50代以代以后又会出现后又会出现“危机危机”，不能再传下去。但，不能再传下去。但是有部分细胞的遗传物质发生了改变，并是有部分细胞的遗传物质发生了改变，并且带有癌变的特点，有可能在培养条件下且带有癌变的特点，有可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为无限制地传代下去，这种传代细胞称为细细胞系胞系。35第三十五页，本课件共有111页三、有限细胞系与无限细胞系三、有限细胞系与无限细胞系1 1、有限细胞系、有限细胞系（finite cell linefinite cell line）：指在连续传代培养后，）：指在连续传代培养后，细胞只能在有限的时间存活，最后细胞逐渐死亡。有限细胞细胞只能在有限的时间存活，最后细胞逐渐死亡。有限细胞系的存活时间与细胞来源（年龄、物种）有关，一般幼龄动系的存活时间与细胞来源（年龄、物种）有关，一般幼龄动物的存活时间比较长。物的存活时间比较长。例如来源于胚胎的成纤维细胞可以培养例如来源于胚胎的成纤维细胞可以培养5050代，而取自成年动代，而取自成年动物的成纤维细胞一般不超过物的成纤维细胞一般不超过3030代；鸡胚成纤维细胞可以培养代；鸡胚成纤维细胞可以培养3030代，而小鼠的则只能培养代，而小鼠的则只能培养1010代。代。研究表明细胞系的寿命与端粒和端粒酶有关。研究表明细胞系的寿命与端粒和端粒酶有关。36第三十六页，本课件共有111页2 2、无限细胞系、无限细胞系(infinite cell line)(infinite cell line)：也：也称为永久细胞系，理论上可以无限传代，称为永久细胞系，理论上可以无限传代，但实际上，每次传代后细胞有一定变化但实际上，每次传代后细胞有一定变化（例如，发生染色体丢失），多次传代（例如，发生染色体丢失），多次传代后必须对细胞再次进行筛选和纯化处理。后必须对细胞再次进行筛选和纯化处理。37第三十七页，本课件共有111页第三节第三节细胞培养的基本技术细胞培养的基本技术38第三十八页，本课件共有111页一、细胞体外生长的要求一、细胞体外生长的要求环境要求环境要求营养要求营养要求39第三十九页，本课件共有111页1、细胞培养的环境要求、细胞培养的环境要求uu温度温度uupH值值uu气体气体u渗透压渗透压思考：主要考虑哪些环境因素？思考：主要考虑哪些环境因素？4040第四十页，本课件共有111页1）、温度）、温度：l不同来源的细胞，其培养的最适温度不同。例如，不同来源的细胞，其培养的最适温度不同。例如，昆虫及鱼类细胞昆虫及鱼类细胞25-28度，哺乳动物细胞一般为度，哺乳动物细胞一般为37度；度；l细胞对细胞对低温低温的耐受力比高温强的耐受力比高温强。温度除直接影响细胞生长外，还与培养液的温度除直接影响细胞生长外，还与培养液的pH值值有关，有关，温度低时温度低时CO2溶解性增加溶解性增加，从而影响，从而影响pH。41第四十一页，本课件共有111页 CO2培养箱nCO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2。n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ，14 h)。箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。42第四十二页，本课件共有111页2）、）、pH值：值：l动物细胞培养最适动物细胞培养最适pH值为值为7.2-7.4，低于，低于6.8或高于或高于7.6均对细胞产生严重影响，甚至导致细胞死亡；均对细胞产生严重影响，甚至导致细胞死亡；l一般原代培养的细胞对一般原代培养的细胞对pH值要求严格，细胞系对值要求严格，细胞系对 一定一定范围的范围的pH值改变有抵抗力。值改变有抵抗力。l酚红酚红是常用的指示剂，用来检测是常用的指示剂，用来检测PH的变化：红色的变化：红色-pH7.4，橙色，橙色-pH7.0，黄色，黄色-pH6.5，蓝红色，蓝红色-pH7.6，紫色，紫色-pH7.8。43第四十三页，本课件共有111页3）、气体：）、气体：细胞在培养初期对溶氧要求较少，但在细胞在培养初期对溶氧要求较少，但在快速增殖（对数增长期或指数增长期）快速增殖（对数增长期或指数增长期）要求有较多的溶氧。要求有较多的溶氧。4）、渗透压：）、渗透压：培养液的渗透压一般保持在与体液培养液的渗透压一般保持在与体液相同相同的水平，对细胞较为适宜。例如，生理的水平，对细胞较为适宜。例如，生理盐水或平衡盐溶液。盐水或平衡盐溶液。44第四十四页，本课件共有111页2、细胞培养的营养要求、细胞培养的营养要求l动物细胞培养营养要求高，培养液的主要动物细胞培养营养要求高，培养液的主要成分：成分：葡萄糖葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和、氨基酸、无机盐、维生素和动物动物血清血清等。等。l培养基（培养液）是维持体外细胞生培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液。存和生长的溶液。l分天然培养基和合成培养基。分天然培养基和合成培养基。45第四十五页，本课件共有111页1）、天然培养基：）、天然培养基：n来自动物的来自动物的体液或组织液体液或组织液，早期广泛采用。，早期广泛采用。例如：血清、血浆、和组织提取液（如鸡例如：血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）等；胚和牛胚浸液）等；n优点：营养成分丰富，培养效果好，符合优点：营养成分丰富，培养效果好，符合细胞生长的要求；细胞生长的要求；n 缺点：缺点：成分不确定成分不确定，来源复杂、有限，不，来源复杂、有限，不能做到标准化，易发生能做到标准化，易发生支原体污染支原体污染。46第四十六页，本课件共有111页2）、合成培养基：）、合成培养基：根据动物的体液成份和细胞生长的需要，由各种营养物质根据动物的体液成份和细胞生长的需要，由各种营养物质组合而成，如组合而成，如MEM、DMEM、RPMI1640等。等。l优点优点：能够标准化生产，组分和含量相对固定，能够标准化生产，组分和含量相对固定，成本成本低；低；l缺点缺点：不能完全满足不能完全满足细胞生长与增殖的需要。因此，在培细胞生长与增殖的需要。因此，在培养时，一般在培养液中加入一定量（养时，一般在培养液中加入一定量（10-15%）的）的血清血清，为，为细胞提供促贴壁因子或促生长因子。细胞提供促贴壁因子或促生长因子。47第四十七页，本课件共有111页人人工工合合成成培培养养基基只只能能维维持持细细胞胞生生存存，要要想想使使细细胞胞生生长长和和繁繁殖殖，还还需需补补充充一一定定量量的的天天然然培培养基（如养基（如血清血清等）。等）。血清中含有：血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）；多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）；多种金属离子；多种金属离子；激素；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；各种生长因子；各种生长因子；转移蛋白；转移蛋白；其它不明成分。其它不明成分。48第四十八页，本课件共有111页l一般说来含一般说来含25小牛血清的培养基对大多小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加一般需加 10血清血清l血清中不仅存在血清中不仅存在促细胞生长因子促细胞生长因子，同对也存，同对也存在在细胞生长抑制因子或毒性因子细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的性是细胞和复杂血清因子的综合反应综合反应。l在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细无血清培养基培养细胞胞49第四十九页，本课件共有111页l l无血清培养基的无血清培养基的主要研制策略主要研制策略：在基础培养：在基础培养基中补充各种必需因子，如基中补充各种必需因子，如激素、生长因子激素、生长因子、结合蛋白结合蛋白、贴壁和扩展因子贴壁和扩展因子 等。等。l l无无血血清清培培养养基基由由基基础础培培养养基基和和替替代代血血清清的的补补充成分组成充成分组成。l l无无血血清清细细胞胞培培养养基基的的使使用用保保证证了了实实验验结结果果的的准准确确性性、可可重重复复性性和和稳稳定定性性，减减少少了了细细胞胞污污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。5050第五十页，本课件共有111页l血清质量好坏是实验成败的关键。血清质量好坏是实验成败的关键。l常用血清有常用血清有胎牛血清胎牛血清、新生牛血清、小牛血新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清清、兔血清、马血清等，其中以等，其中以胎牛血清胎牛血清质质量最好。量最好。l优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。无细菌、支原体、病毒污染。l血清的灭活（消除补体活性）：血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟分钟l血清的消毒：过滤除菌血清的消毒：过滤除菌51第五十一页，本课件共有111页完全培养基的组成完全培养基的组成n n基础培养基基础培养基 80一一95n n血清血清 5一一20n n碳酸氢钠碳酸氢钠 2.0 g/Ln n青、链霉素青、链霉素 各各100卑位毫升卑位毫升l庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定l淋可霉素：主要用于抑制支原体l培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长5252第五十二页，本课件共有111页例：培养基的配制例：培养基的配制l lPMI-1640培养粉培养粉 1袋袋l l碳酸氢钠碳酸氢钠 2.0 gl l青、链霉素青、链霉素 各各100单位毫升单位毫升l l 加三蒸水加三蒸水 至至 1000ml,过滤除菌。过滤除菌。l l 调节调节pH值至值至7.2 l l 加血清（终浓度为加血清（终浓度为10）5353第五十三页，本课件共有111页3、细胞传代方法、细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。种。1、悬浮生长细胞传代、悬浮生长细胞传代l离心法传代：离心（离心法传代：离心（1000转转/分分）去上清，沉淀物加新培养液）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。后再混匀传代。l直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2、半悬浮生长细胞传代半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）细胞）l此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3、贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代l 采用酶消化法传代。常用的消化液有采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。的胰蛋白酶液。54第五十四页，本课件共有111页二、细胞培养的准备二、细胞培养的准备实验室的布局实验室的布局仪器设备的准备仪器设备的准备实验用品的准备实验用品的准备55第五十五页，本课件共有111页l超净工作台；超净工作台；l细胞培养设备：如细胞培养设备：如CO2 2培养箱；培养箱；l培养器材：如培养瓶，培养板等；培养器材：如培养瓶，培养板等；l其其它它：纯纯水水设设备备，干干燥燥、消消毒毒除除菌菌设设备，清洗设备，冰箱等。备，清洗设备，冰箱等。1、仪器设备的准备、仪器设备的准备第五十六页，本课件共有111页2)、血清、血清：一般常用为小小牛牛血血清清(包括胎牛血清)，人血清和其它动物血清。由于不同的研究目的，血清成分往往干扰研究实验，如进行药物和受体及营养等方面的研究时，需要使用无血清培养基。1)、培养液培养液:目前常用的基础培养液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F12等，可根据培养需求合理选择。2、实验营养用品的准备、实验营养用品的准备第五十七页，本课件共有111页血清种类及来源：血清种类及来源：(1)胎牛血清胎牛血清(2)犊牛血清：犊牛出生后，不给吮乳，犊牛血清：犊牛出生后，不给吮乳，尽早由颈动脉无菌放血。尽早由颈动脉无菌放血。(3)牛、马、羊血清：通常由颈静脉采牛、马、羊血清：通常由颈静脉采取，或屠宰时由颈动脉放血采取。取，或屠宰时由颈动脉放血采取。(4)其它血清：如兔血清和鸡血清等，其它血清：如兔血清和鸡血清等，58第五十八页，本课件共有111页3)、平衡盐溶液、平衡盐溶液(BSS):主要用于作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压，提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。常用的有PBS，Hanks等。4)、抗生素、抗生素:常用为青霉素（每毫升培养液50100单位）和链霉素（每毫升培养液50100微克）。第五十九页，本课件共有111页Hanks液(1)原液甲：原液甲：NaCl 160 gKCl 8 gMgSO47H20 2 gMgCl26H20 2 g加水加水 至至800 mlCaCl2 2.8 g加水加水 至至100 ml 将上述两种溶液混合后，加水至将上述两种溶液混合后，加水至1000 m1，并加，并加2m1氯氯仿作为防腐剂，保存于仿作为防腐剂，保存于04冰箱内。冰箱内。60第六十页，本课件共有111页(2)原液乙：原液乙：Na2HPO412H2O 3.04 g KH2PO：1.20 g 葡萄糖葡萄糖 20.0 g 加水至加水至1 000 ml，加，加2ml氯仿防腐，保存于氯仿防腐，保存于04冰箱冰箱内。内。按下述比例配成按下述比例配成Hanks液：液：原液甲原液甲 1份份 原液乙原液乙 1份份 水水 18份份10磅磅15分钟灭菌后，置分钟灭菌后，置04冰箱内备用。使用时于冰箱内备用。使用时于100 ml Hanks液内加入液内加入3.5NaHCO3液，将液，将pH调至调至7.2-7.6。61第六十一页，本课件共有111页5）、细胞消化液：）、细胞消化液：能水解细胞间的蛋白质，起解离、分散细胞的作用。消化液种类：胰蛋白酶溶液：常用0.125和0.25 EDTA溶液：非酶性解离，常用0.0262第六十二页，本课件共有111页6）、培养基）、培养基pH调整液调整液lHEPES（N-2-hydroxy-ethylpiperazine-N-ethanesulfonic acid），缓冲效能(pKa)在20时为7.55，37为7.31；HEPES不是不是起维持起维持pH恒定的作用，而是起恒定的作用，而是起恒定和抵抗恒定和抵抗快速快速pH变化变化的的。lNaHCO3溶液，调整pH用。63第六十三页，本课件共有111页6)、其它添加成分、其它添加成分：有机补充物：有机补充物：如丙酮酸钠，谷胺酰氨等。促促细细胞胞分分裂裂因因子子：如生长因子类的FGF(成纤维细胞生长因子)，EGF(表皮生长因子)。贴贴壁壁和和铺铺展展因因子子：如胶原蛋白，纤粘蛋白等。可根据培养细胞的特殊要求进行添加。64第六十四页，本课件共有111页 解离常指组织、细胞的解离，在无菌情解离常指组织、细胞的解离，在无菌情况下采取动物的组织或器官，放在含有抗生况下采取动物的组织或器官，放在含有抗生素的平衡盐溶液素的平衡盐溶液(BSS)中，然后尽快在超净台中，然后尽快在超净台或无菌室内进行解离处理。或无菌室内进行解离处理。常用常用酶酶和和鳌合剂鳌合剂进行解离作用。进行解离作用。三、细胞的解离三、细胞的解离第六十五页，本课件共有111页解离细胞的方法解离细胞的方法1 1）胰蛋白酶胰蛋白酶解离细胞法：解离细胞法：所需时间较短，主要缺所需时间较短，主要缺点是破损细胞。点是破损细胞。2 2）胶原酶胶原酶解离细胞法：解离细胞法：这种方法对解离胚胎性、这种方法对解离胚胎性、正常和恶性组织是很有效的。胶原酶最终浓度正常和恶性组织是很有效的。胶原酶最终浓度200200u/mlu/ml，36.536.5温育，一般温育温育，一般温育4-48h4-48h。胶原酶和透明质酸酶。胶原酶和透明质酸酶协同作用有助于分离大鼠或兔的肝脏组织。协同作用有助于分离大鼠或兔的肝脏组织。3 3）机械机械解离细胞法：解离细胞法：比酶法所需时间短，但细胞比酶法所需时间短，但细胞存活率较低。存活率较低。4 4）螯合剂螯合剂解离细胞法：解离细胞法：分离效果差分离效果差第六十六页，本课件共有111页第三节、细胞的培养第三节、细胞的培养悬滴培养法悬滴培养法(hanging-drop culture)盖玻片培养法盖玻片培养法(coverslip culture)培养瓶培养法培养瓶培养法(flask culture)旋转管培养法旋转管培养法(rotate tube culture)培养板培养法培养板培养法(plate culture)灌流小室培养法灌流小室培养法(perfused chamber culture)一、体外培养的基本方法一、体外培养的基本方法67第六十七页，本课件共有111页1 1、悬滴培养法、悬滴培养法将组织块接种在一张包被有生长基质的盖玻片上，将组织块接种在一张包被有生长基质的盖玻片上，翻转盖玻片并置于凹玻片上，用熔蜡密封后放入翻转盖玻片并置于凹玻片上，用熔蜡密封后放入培养箱中培养。培养箱中培养。悬滴培养法包括单盖片培养法与双盖片培养法悬滴培养法包括单盖片培养法与双盖片培养法优点：优点：便于观察，培养液用量少；便于观察，培养液用量少；缺点：缺点：操作繁杂，空间小，培养环境难控制。操作繁杂，空间小，培养环境难控制。Levi-MontalciniLevi-Montalcini（19561956）采用双盖片悬滴培养法）采用双盖片悬滴培养法发现了神经生长因子并荣获发现了神经生长因子并荣获NobelNobel奖。奖。68第六十八页，本课件共有111页2 2、盖玻片培养法、盖玻片培养法p以盖玻片为生长表面以盖玻片为生长表面，将组织块接种盖玻，将组织块接种盖玻片上，然后一起放入片上，然后一起放入培养瓶或培养皿培养瓶或培养皿中进中进行培养。行培养。p优点：便于观察和染色处理；优点：便于观察和染色处理；p缺点：表面积小，仅适合短时间培养。缺点：表面积小，仅适合短时间培养。69第六十九页，本课件共有111页3 3、培养瓶培养法、培养瓶培养法将组织块或细胞接种在将组织块或细胞接种在培养瓶培养瓶中，再放入培养箱中培中，再放入培养箱中培养。养。玻璃培养瓶与塑料培养瓶（卡氏瓶）玻璃培养瓶与塑料培养瓶（卡氏瓶）培养瓶的规格：底面积（培养瓶的规格：底面积（2525、100cm100cm2 2）胶塞封口与螺口瓶（带通气膜）胶塞封口与螺口瓶（带通气膜）优点：优点：极大地极大地减少了污染减