免疫共沉淀-研究生实验课复习课程.ppt
免疫免疫(miny)共沉淀共沉淀(co-immunoprecipitation)第一页,共30页。背背 景景据估计,人体中大约总共可产生据估计,人体中大约总共可产生500,000种蛋白,而单个细胞种蛋白,而单个细胞可以产生可以产生 10,000 种。种。在这些蛋白中,在这些蛋白中,80%不是以独立不是以独立(dl)的方式存在的,而是存的方式存在的,而是存在于一个蛋白复合体中。在于一个蛋白复合体中。蛋白蛋白-蛋白的相互作用包含在一个细胞网络中,我们形象地称蛋白的相互作用包含在一个细胞网络中,我们形象地称之为通过节点(之为通过节点(nodes)连接的枢纽()连接的枢纽(hubs)。)。蛋白蛋白(dnbi)的相互的相互作用作用第二页,共30页。Standard TechniquesGlutathione-S-Transferase Fusion ProteinsAffinity TagsTandem Affinity Purification(TAP)TagsStrep-Tag IIIQuantitative ProteomicsChemical CrosslinkingTwo-hybrid YeastPhage-display Universal Verification of Interaction TechniquesCo-ImmunoprecipitationConfocal MicroscopyBiophysical Verification of Interaction TechniquesFluorescence Resonance Energy Transfer(FRET)GFP-Protein Proximity Imaging Microscopy(GFP-PRIM)Mass Spectroscopy(MS)Atomic Force Microscopy(AFM)Surface Plasmon Resonance(SPR)第三页,共30页。实验实验(shyn)目的目的学习并掌握免疫共沉淀的原理及操作方法,学习并掌握免疫共沉淀的原理及操作方法,了解免疫共沉淀结果了解免疫共沉淀结果(ji gu)分析。分析。了解与免疫共沉淀相关的实验及进展了解与免疫共沉淀相关的实验及进展第四页,共30页。免疫共沉淀是以抗体和抗原免疫共沉淀是以抗体和抗原(kngyun)之间的专一之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。用的有效方法。金标准金标准 用途:测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用途:测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。概念概念(ginin)及及用途用途第五页,共30页。bindingwashelutionYYYYY当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质质 x 的抗体免疫沉淀的抗体免疫沉淀 x,那么,那么(n me)与与 x 在体内结合的蛋白在体内结合的蛋白质质 y 也能沉淀下来。也能沉淀下来。实验实验(shyn)原理原理第六页,共30页。第七页,共30页。n人脑微血管内皮细胞培养于直径为人脑微血管内皮细胞培养于直径为6cm的培养皿,培养大约的培养皿,培养大约90%以上融合以上融合(rngh)后,倒掉培养液,后,倒掉培养液,PBS洗洗3次;次;n加入加入1ml Lysis Buffer(20mM Tris,150mM NaCl,1mM EDTA,1mM EGTA,1%TritonX-100,1mM-Glycerolphosphate,1mM Na3VO4,Cocktail proteinase,pH 7.5),冰上放置),冰上放置30min,裂,裂解细胞;解细胞;实验实验(shyn)步骤步骤第八页,共30页。采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质相互采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(作用,多采用非离子变性剂(NP40或或Triton X-100)。每种细胞。每种细胞的裂解条件不一样,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂的裂解条件不一样,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2SDS)。为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂,低温下进行实验。制剂,低温下进行实验。Na3VO4作用为保护磷酸化的蛋白不会被磷酸酶还原作用为保护磷酸化的蛋白不会被磷酸酶还原(hun yun)。因此在做磷酸化的信号转导时需添加。因此在做磷酸化的信号转导时需添加。第九页,共30页。n将裂解液转移至将裂解液转移至EP管中,管中,4转鼓摇转鼓摇15min,14000g 4离心离心15min;n吸取吸取(xq)上清液到新上清液到新EP管中,每管加管中,每管加1g 对照兔对照兔IgG,同时加入,同时加入Protein A agarose,4转鼓转转鼓转30min,4 10000g 离心离心5min;n preclear及其作用及其作用n 一抗和相应来源的一抗和相应来源的normal mouse,rat,rabbit or goat IgG中有相同中有相同或相似的成分或相似的成分(如无关如无关IgG),用一抗相应来源的用一抗相应来源的IgG与蛋白裂解液和与蛋白裂解液和protein Aagarose可以去除一抗中无关可以去除一抗中无关IgG对蛋白裂解液中物质的对蛋白裂解液中物质的非特异吸附非特异吸附,二是可以去除蛋白液中与二是可以去除蛋白液中与protein Aagarose非特异结非特异结合的物质。做合的物质。做 preclear 的的IgG 是不针对特异性抗原的。是不针对特异性抗原的。n 琼脂糖珠的选择琼脂糖珠的选择n SEPHAROSE是注册商品名是注册商品名,本身是本身是agarose做的凝胶。做的凝胶。n 第十页,共30页。n转移上清液至一新管中,将每管总蛋白转移上清液至一新管中,将每管总蛋白(dnbi)定量至定量至500-2000(250-1000)g,用,用lysis Buffer将体积补齐至将体积补齐至600-800 l。加入。加入AKT兔抗人多克隆抗体兔抗人多克隆抗体10 l,4 转鼓过夜转鼓过夜(10min);n 孵育液体积的控制:考虑抗体孵育液体积的控制:考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上上,残存在上清。缓冲液太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。清。缓冲液太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。n加入加入35 l Protein A agarose,4转鼓转转鼓转2h(10min);n1000g 4 离心离心5min,PBS洗洗3次,加入次,加入40l 2SDS Sample Buffer(125mM TrisCl pH6.8,4%SDS,20%Glycerol,100mM DTT,0.02%溴酚蓝)沸水浴中煮沸溴酚蓝)沸水浴中煮沸5min;nWestern Blot检测样品,剩余样品检测样品,剩余样品-20保存。保存。第十一页,共30页。抗体的选择:抗体的选择:1.使用明确的抗体:实验最需要注意的就是抗体的性质。抗体使用明确的抗体:实验最需要注意的就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免疫细胞化学不同和抗原结合能力也不同,免疫细胞化学(huxu)染色能染色能结合未必能用在结合未必能用在IP反应。仔细检查抗体的说明书。特别是多反应。仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题,确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉抗的特异性是问题,确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;于避免污染的发生;2.使用对照抗体:使用对照抗体:单克隆抗体:正常小鼠的单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗或另一类单抗 兔多克隆抗体:正常兔兔多克隆抗体:正常兔IgG3.抗体用量的控制:抗体用量的控制:1-4g(通常用(通常用2 g)4.确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。第十二页,共30页。优优 点点1.相互作用的蛋白都是经翻译后修饰相互作用的蛋白都是经翻译后修饰(xish)的,处于天然状态;的,处于天然状态;2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;可以避免人为的影响;3.可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。合物。第十三页,共30页。缺缺 点点1.可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用质相互作用2.两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;有第三者在中间起桥梁作用;3.如用如用western blot检验,必须在实验前预测目的检验,必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体蛋白是什么,以选择最后检测的抗体(kngt),若预测不正确,实验就得不到结果(但如果,若预测不正确,实验就得不到结果(但如果结合质谱检测就可以分析所有的结合蛋白的种结合质谱检测就可以分析所有的结合蛋白的种类)。类)。第十四页,共30页。通过质谱确定捕获通过质谱确定捕获(bhu)的蛋的蛋白白第十五页,共30页。结果结果(ji gu)分析分析1.盐离子浓度影响盐离子浓度影响coIP结果结果很多蛋白复合体对盐浓度敏感,但敏感性有强弱之别。通很多蛋白复合体对盐浓度敏感,但敏感性有强弱之别。通常来说,真实存在着的蛋白复合体能耐受生理盐常来说,真实存在着的蛋白复合体能耐受生理盐(0.15M)或更高浓度,即在生理盐浓度下不会)或更高浓度,即在生理盐浓度下不会(b hu)解解体。具体如,某种体。具体如,某种CDK和和Cyclin其牢固程度能耐受其牢固程度能耐受0.8-1.0M以上的高盐而不解体。因此,了解一个蛋白复合体对以上的高盐而不解体。因此,了解一个蛋白复合体对盐浓度的耐受,既是一个帮助判断蛋白复合体是否真实存盐浓度的耐受,既是一个帮助判断蛋白复合体是否真实存在的一个重要依据,更是一个非常重要的生化数据;对某在的一个重要依据,更是一个非常重要的生化数据;对某些体外生化反应的蛋白原料的纯化制备也是很重要的辅助些体外生化反应的蛋白原料的纯化制备也是很重要的辅助依据。在生理盐或更低盐浓度下进行依据。在生理盐或更低盐浓度下进行coIP可能增加假阳性可能增加假阳性几率几率很多蛋白间非特异性的黏粘被记录下来。通常选择很多蛋白间非特异性的黏粘被记录下来。通常选择0.15-0.3M做细胞裂解。纯化蛋白通常选取做细胞裂解。纯化蛋白通常选取0.6M以上进行以上进行IP。第十六页,共30页。2.过表达过表达血清中丰富的血清中丰富的BSA可以被任意抗体识别(其实也是一种相互可以被任意抗体识别(其实也是一种相互作用),同理高丰度的两种或多种蛋白作用),同理高丰度的两种或多种蛋白(dnbi)人为拼凑到人为拼凑到一起,也可以非特异性的黏粘或者发生弱的相互作用。一起,也可以非特异性的黏粘或者发生弱的相互作用。3.不添加不添加NP40一类表面活性剂,削弱对非特异性结合的拮抗一类表面活性剂,削弱对非特异性结合的拮抗NP40除可以在膜上穿孔外,也可以有效拮抗非特异性的蛋除可以在膜上穿孔外,也可以有效拮抗非特异性的蛋白白(dnbi)相互作用,提高相互作用,提高coIP的特异性。的特异性。通常通常IP体系中体系中NP40含量含量0.2-0.5%。NP40在在0.5-1.0%时,染色体很容易析出,造成样品过粘而时,染色体很容易析出,造成样品过粘而需要超声。需要超声。第十七页,共30页。4.超声和冻融的影响超声和冻融的影响 很多市售或自制的裂解液过于温和,需要考虑采很多市售或自制的裂解液过于温和,需要考虑采用机械或者超声等手段提高裂解效率(超声要慎用机械或者超声等手段提高裂解效率(超声要慎用,可能破坏弱的相互作用)。用,可能破坏弱的相互作用)。但是,有些时候裂解液的冻融又可能影响某些弱但是,有些时候裂解液的冻融又可能影响某些弱的相互作用,所以不太建议冻融裂解液的相互作用,所以不太建议冻融裂解液即最即最好裂解液制备好后立即进行好裂解液制备好后立即进行coIP。如果证实冻融。如果证实冻融无影响可考虑将蛋白无影响可考虑将蛋白(dnbi)样品保存样品保存-80度待用。度待用。5.Tag的影响的影响 His-tagged主要用于纯化蛋白主要用于纯化蛋白(dnbi)。用。用His-tagged蛋白蛋白(dnbi)进行进行coIP存在潜在的隐患。因存在潜在的隐患。因为很多蛋白为很多蛋白(dnbi)会有富含会有富含histidine的的domain,遇到效价非常好的抗体会使很多内源性的蛋白遇到效价非常好的抗体会使很多内源性的蛋白(dnbi)都被该抗体识别。造成都被该抗体识别。造成coIP的假象。的假象。第十八页,共30页。TAP tag不能用于分析钙调信号通路。不能用于分析钙调信号通路。TAP tag实际上从成本角度和实际上从成本角度和His tag差不差不多,洗脱试剂价格低廉,因此可用于质谱分析,能获取最全面的相互作用的信多,洗脱试剂价格低廉,因此可用于质谱分析,能获取最全面的相互作用的信息。然而由于其中包含钙调蛋白和蛋白息。然而由于其中包含钙调蛋白和蛋白A的相互作用的相互作用domain,天然会结合钙信,天然会结合钙信号相关蛋白,从而干扰或掩盖靶蛋白与钙信号蛋白之间的相互作用,有一定的号相关蛋白,从而干扰或掩盖靶蛋白与钙信号蛋白之间的相互作用,有一定的应用局限。应用局限。Myc、HA、Flag-tagged:Myc仍然会有天然的干扰,应用略有局限;相较后仍然会有天然的干扰,应用略有局限;相较后两者是人工合成专门用于两者是人工合成专门用于tagged蛋白(有相应的专利蛋白(有相应的专利(zhunl),因此目前无论,因此目前无论抗体或交联好的抗体或交联好的beads价格都非常昂贵),因此干扰最小、最常用。如需进一价格都非常昂贵),因此干扰最小、最常用。如需进一步细致区分,步细致区分,a-Flag效价比效价比a-HA略高,因此更适合略高,因此更适合IP。第十九页,共30页。tag的位置。将的位置。将tag构建到蛋白的构建到蛋白的N端还是端还是C端,也是一个潜在端,也是一个潜在的能够影响的能够影响coIP结果的因素。比如结果的因素。比如(br),分泌蛋白的,分泌蛋白的N端通端通常有分泌信号肽,如果将常有分泌信号肽,如果将tag构建到构建到N端,则外分泌时会被信端,则外分泌时会被信号肽酶连同信号肽一起切除;所以这时必须构建在号肽酶连同信号肽一起切除;所以这时必须构建在C端。再端。再如,多数蛋白的如,多数蛋白的C端是疏水区,有的时候将端是疏水区,有的时候将tag构建在构建在C端会端会影响蛋白原来的空间结构,如恰好影响蛋白原来的空间结构,如恰好C端同时是相互作用的结端同时是相互作用的结构域,某些时候还可能被遮蔽,从而干扰相互作用。因此,构域,某些时候还可能被遮蔽,从而干扰相互作用。因此,通常构建质粒的时候是通常构建质粒的时候是N端、端、C端端tagged同时分别构建,以备同时分别构建,以备万一。万一。第二十页,共30页。更高效更高效(o xio)的方法的方法使用使用Dynabeads蛋白蛋白A或或G进行进行(jnxng)免免疫沉淀反应疫沉淀反应 Dynabeads 磁珠磁珠 vs 琼脂糖珠分离纯化蛋白质琼脂糖珠分离纯化蛋白质注重注重(zhzhng)品质和特异性,而非数量。品质和特异性,而非数量。此时,磁珠是最佳的选择。此时,磁珠是最佳的选择。第二十一页,共30页。常见问题及解决常见问题及解决(jiju)策略策略1.目的蛋白分子量比预期大?目的蛋白分子量比预期大?2.至少两种可能性是存在的至少两种可能性是存在的一个是在所谓一个是在所谓“摇摇”的过程中,目的蛋白被修饰的过程中,目的蛋白被修饰(xish)。正常的细胞中有很多正常的细胞中有很多departments,每个,每个department都有特都有特定蛋白的存在,比如线粒体蛋白、溶酶体蛋白、叶绿体蛋白、定蛋白的存在,比如线粒体蛋白、溶酶体蛋白、叶绿体蛋白、内质网结合蛋白、核蛋白;一旦细胞被匀浆化,各个内质网结合蛋白、核蛋白;一旦细胞被匀浆化,各个departments就不存在了,每个蛋白都会与其他所有蛋白有就不存在了,每个蛋白都会与其他所有蛋白有接触的机会,所以,发生一些接触的机会,所以,发生一些unexpected修饰修饰(xish)(或(或切割)是正常现象。切割)是正常现象。再有一种可能是再有一种可能是B蛋白只能结合被修饰蛋白只能结合被修饰(xish)的的A蛋白,蛋白,从而在免疫沉淀的过程中富集了这种被修饰从而在免疫沉淀的过程中富集了这种被修饰(xish)的的A蛋蛋白。白。第二十二页,共30页。2.背景深条带多,特异性差。背景深条带多,特异性差。最简单的改进方法:换特异性高的抗体,最好用单抗。如果不换抗体,还可以改最简单的改进方法:换特异性高的抗体,最好用单抗。如果不换抗体,还可以改进共沉淀的条件,例如孵育的温度,孵育的时间,抗体的浓度等等。另外,曝光进共沉淀的条件,例如孵育的温度,孵育的时间,抗体的浓度等等。另外,曝光的时候,时间不要太长,可以降低背景。也可能是抗体浓度过高,可以降低抗体的时候,时间不要太长,可以降低背景。也可能是抗体浓度过高,可以降低抗体作用浓度。作用浓度。3.没有检测到与目的蛋白相互作用的蛋白或者检测得到的信号太弱没有检测到与目的蛋白相互作用的蛋白或者检测得到的信号太弱 裂解液中的去垢剂浓度过高或者配方过于剧烈:降低去垢剂浓度或者更换去垢裂解液中的去垢剂浓度过高或者配方过于剧烈:降低去垢剂浓度或者更换去垢剂种类(按作用剧烈程度来区分剂种类(按作用剧烈程度来区分:SDS Trition NP40 Digitonin CHAPS)受蛋白的亚细胞定位影响:重新选择裂解液配方以释放目的蛋白受蛋白的亚细胞定位影响:重新选择裂解液配方以释放目的蛋白 蛋白之间的相互作用太弱或者不太稳定蛋白之间的相互作用太弱或者不太稳定(wndng):选择亲和力更高的抗体以捕:选择亲和力更高的抗体以捕获更多的目的蛋白从而捕获更多的相互作用蛋白获更多的目的蛋白从而捕获更多的相互作用蛋白;过表达提高目的蛋白的含量;过表达提高目的蛋白的含量;选择目的蛋白或者相互作用蛋白含量高的样品进行免疫共沉淀实验选择目的蛋白或者相互作用蛋白含量高的样品进行免疫共沉淀实验第二十三页,共30页。相关相关(xinggun)技术技术体外免疫共沉淀(体外免疫共沉淀(TnT试剂盒,试剂盒,promega)免疫沉淀(免疫沉淀(immunoprecipitation)利用抗体可与抗原利用抗体可与抗原(kngyun)特异性结特异性结合的特性,将抗原合的特性,将抗原(kngyun)(常为靶蛋(常为靶蛋白)从混合体系沉淀下来。白)从混合体系沉淀下来。第二十四页,共30页。第二十五页,共30页。Pull down 利用利用(lyng)抗体可与抗原特异性结合的抗体可与抗原特异性结合的特性,将诱饵蛋白与标签结合,再固化在特性,将诱饵蛋白与标签结合,再固化在吸附介质上,之后将抗原(常为靶蛋白)吸附介质上,之后将抗原(常为靶蛋白)从混合体系沉淀下来的方法。从混合体系沉淀下来的方法。除了常用的除了常用的GST-pull down,还有生物素,还有生物素标记蛋白标记蛋白-pull down,His-pull down等。等。第二十六页,共30页。第二十七页,共30页。Glutathione-S-Transferase Fushion Proteins(GST-Pull Down Assays)局限性:完全局限性:完全(wnqun)是体外实验是体外实验结果结果将靶蛋白将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂甘肽亲和树脂(shzh)GTH(Glutathione),作为与目作为与目的蛋白亲和的支撑物的蛋白亲和的支撑物,充当一种充当一种“诱饵蛋诱饵蛋白白”,目的蛋白溶液过柱目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之可从中捕获与之相互作用的相互作用的“捕获蛋白捕获蛋白”(目的蛋白目的蛋白),洗洗脱结合物后通过脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析电泳分析,从从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白的目的蛋白,“诱饵蛋白诱饵蛋白”和和“捕获蛋白捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。第二十八页,共30页。第二十九页,共30页。Thank U第三十页,共30页。