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第二章第二章 植物化学成分的研究程序植物化学成分的研究程序有效成分化学结构的研究方法Procedure选定研究对象收集原料、品种鉴定筛选活性有活性动物实验制剂工业化研究申报临床研究（期临床、期临床）申报新药证书及生产批准文号试生产期临床实验（安全性考察）正式生产文献调研、文献调研、成分预实验、成分预实验、提取提取Content1.研究对象的确定2.文献资料查阅和信息收集3.植物化学成分的预实验4.植物化学成分的提取、分离、纯化和结构鉴定5.植物化学成分的结构改造和构效关系第一节研究对象的确定依据：1.古代医学典籍、民族医学资料或民间经验2.当地植物样品随机抽取3.植物化学分类学知识4.植物化学成分信息5.偶然的信息和意外的发现6.检索工具（internet）第二节文献资料查阅和信息收集主要专著和教科书主要工具书和检索工具期刊杂志网上查阅文献资料(文献查阅网站、专利）其他有用信息第三节植物化学成分的预实验在分离活性成分前，先用几种不同极性的溶剂分别进行提取，进行生物活性筛选，确定哪一个溶剂提取部位有效后，再对该部位进行各类化学成分的预试验，从而缩小预实验的范围。预试验的要求：1.预试验之前，了解植物的产地、生物学特性和分类学鉴定，以及借助外观、色、嗅、味等对植物样品所含成分作初步观察，以提供进一步检查的参考。如：甜味可能含糖类苷类味酸可能含柠檬酸苹果酸等羟基酸味苦可能含有生物碱苷类苦味质2.简便快捷且尽量正确一般试管试验也可用纸片法纸色谱或薄层色谱预试验主要分两类：一、单向预试法一、单向预试法仅为了测定某一特定成分。主要用水提取液、醇提取液和石油醚提取液来进行某类成分的检验。二、系统预试法二、系统预试法对植物中的各类成分进行比较全面的定性检查。常用递增极性的方法，依次用石油醚、乙醚、乙醇和水等进行抽提。植物的化学成分较复杂，有些成分是植物所共有的，如纤维素、蛋白质、油脂、淀粉、糖类、色素等。有些成分仅是某些植物所特有的，如生物碱类、甙类、挥发油、有机酸、鞣质等。冬虫夏草各类化学成分均具有一定的特性，一般可由植物的外观、色、嗅、味等作为初步检查判断的手段之一。如植物样品折断后，断面不油点或挤压后有油迹者，多含油脂或挥发油；有粉层的多含淀粉、糖类；嗅之有特殊气味者，大多含有挥发油、香豆精、内酯；有甜味者多含糖类；味苦者大多含生物碱、甙类、苦味质；味酸者含有有机酸；味涩者多含有鞣质等等。一、预试溶液的制备1、水提取液糖、多糖、有机酸、皂苷、酚类、鞣质、氨基酸、多肽、蛋白质2、乙醇提取液酚类、鞣质、有机酸、香豆素、强心苷、黄酮、蒽醌、甾体3、5%HCl-乙醇提取液生物碱4、石油醚提取液甾体、萜类、脂肪油灵芝预试验的注意事项1根据各种成分的不同性质，选用适宜的溶剂提取，以保证有效成分能被提取出来。2试验提取液的浓度应足以达到各该反应的灵敏度。3试验提取液的酸碱度（pH）值应不致影响鉴别反应中所需要的pH值。相差甚大时应事先调节。4提取液较深时，容易影响观察鉴别反应的效果，此时可适当稀释，或进一步提纯。5鉴别反应时应注意防止多类成分的相互干扰，以免出现假阳性，或颜色不正等情况。最好在化学鉴别的同时，做空白试验和对照试验（用已知含某类成分的中草药或纯品做阳性对照）。6在鉴别试验中，如果某一类成分的几个鉴别反应结果不一致时（即有的呈阳性反应，有的呈阴性）则应进行全面分析。首先应注意呈阳性反应的试验是否属于该类成分的专一反应，否则应检查其他类成分能否产生该反应，从多方面加以判断。但也应注意，某些反应只能对某一类成分中的某个化学基团呈性反应，如检查黄酮类的盐酸镁粉试验，它只对黄酮类中的羟基黄酮类（黄酮醇类）反应明显，其余类的黄酮类则不甚明显，但也不能轻易否定不是黄酮类，为了避免孤立和片面的下结论，一定要全面考虑综合分析。二、鉴别方法1、氨基酸、多肽、蛋白质（1）加热沉淀试验：加热煮沸混浊或沉淀（蛋白质）+5%H2SO4（不加热）混浊或沉淀（2）双缩脲反应：+40%NaOH，1%CuSO4紫色、红色或紫红色（多肽、蛋白质）（3）茚三酮反应：+0.2%茚三酮试液蓝或蓝紫色（氨基酸、多肽、蛋白质）（4）吲哚醌反应：+吲哚醌试液各种颜色（氨基酸）（5）Millon反应：+Hg，H2NO2红色（蛋白质分子中有酪氨酸组成）（6）Hopkins-Cole反应：+乙醛酸，浓硫酸各色（蛋白质分子中有色氨酸组成）（7）氨基酸的薄层层析检查：吸附剂硅胶展开剂n-BuOH，n-BuOH：HAc：H2O显色剂0.25%茚三酮试液紫红色斑点2、皂苷（1）泡末试验：振摇大量持续性泡末+0.1MHCl二管泡末高度相同（三萜皂苷）+0.1MNaOH碱管高于酸管（甾体皂苷）（2）溶血试验：+2%红血球悬浮液溶血（3）LiebermanBurchard反应：+醋酐-浓硫酸紫红色（三萜皂苷）黄-红-紫-污绿（甾体皂苷）31号黄柴胡（柴胡皂苷）猴七【主要成分】三七皂苷、三七皂苷乙人参皂苷-Rh2人3、糖和苷（1）斐林试剂：+硫酸铜、酒石酸钾钠砖红色沉淀（还原糖）（）+1%HCl+NaOH沉淀（苷元）30min上清液（+）（多糖）（2）Molish反应：+-萘酚-浓硫酸紫红色环（多糖或苷）（3）银镜反应：+0.1N硝酸银、5N氨水银褐色（还原糖）（4）薄层层析检查：吸附剂硅胶G或纤维素展开剂n-BuOH：Pd：H2O；15%HAc显色剂苯胺-邻苯二甲酸4、酚类和鞣质（1）FeCl3试剂：+1%FeCl3试液蓝、暗绿或蓝紫色（有机酸、或矿物酸有干扰）（2）三氯化铁-铁氰化钾试剂：喷洒蓝色斑点（3）香草醛-盐酸试剂：喷洒红色（间苯二酚、间苯三酚）（4）重氮盐试剂：+对硝基苯胺、亚硝酸钠红色（5）薄层层析检查：吸附剂硅胶G或纤维素展开剂n-BuOH：HAc：H2O；显色剂1%FeCl3试液1%三氯化铁-1%铁氰化钾试液蓝、绿或黑色鞣质与酚类的区别：+明胶沉淀上清液+1%FeCl3试液蓝、暗绿或蓝紫色5黄酮及其甙类（1）盐酸-镁粉反应：+HCl-Mg红色（2）三氯化铝反应：+AlCl3黄色（3）浓氨水反应：+NH3亮黄或橙色含罗汉果甙，另含果糖、氨基酸、黄酮等6、生物碱（1）沉淀反应碘化汞钾试剂白色或浅黄色沉淀碘化铋钾试剂橘红色沉淀碘碘化钾试剂浅棕或暗棕色沉淀硅钨酸试剂浅黄或黄棕色沉淀磷钨酸试剂浅黄色沉淀磷钼酸试剂白色或淡黄色沉淀苦味酸试剂黄色结晶或非结晶形沉淀鞣酸试剂棕黄色沉淀氯化金试剂黄色结晶氯化铂试剂白色结晶雷氏铵盐红色无定形沉淀（2）薄层层析检查：吸附剂碱性氧化铝（级，干法铺板）硅胶G（稀碱湿法铺板）展开剂氯仿：甲醇显色UV；碘化铋钾野决明野决明全草及种子含多种生物碱全草及种子含多种生物碱三尖杉：含三尖杉碱、三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱等生物碱，约0.39%7、有机酸（1）PH试纸检查（2）溴酚兰试液：喷洒蓝色背景黄（3）薄层层析检查：吸附剂硅胶G或酸性氧化铝展开剂C6H6：EtOH显色剂0.1%溴酚兰试液黄色五味子8、甾体（1）LiebermanBurchard反应：+醋酐-浓硫酸黄-红-紫-污绿（2）氯仿-浓硫酸反应：+氯仿-浓硫酸氯仿层红或青色硫酸层绿色荧光（3）五氯化锑或三氯化锑反应：+SbCl3或SbCl5红色（4）薄层层析检查：吸附剂中性氧化铝或硅胶G展开剂C6H6-MeOH；CHCl3-MeOH显色剂10%磷钼酸蓝-蓝紫色5%三氯化锑试液红、棕红或绿色重楼云南重楼化学成分含多种甾体皂甙小米辣：化学成分：辣椒定是A，B，C三种甾体的混合物，有抑菌作用9、香豆素、内酯（1）开闭环反应：+1%NaOH澄清+2%HCl混浊（2）异羟污酸铁反应：+7%盐酸羟胺、10%KOH+稀HCl、1%FeCl3红色（3）重氮盐试剂：+对硝基苯胺、亚硝酸钠红色（4）薄层层析检查：吸附剂酸性硅胶G或硅胶G或酸性氧化铝展开剂甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5：4：1）显色剂UV蓝色荧光异羟污酸铁试液红色10、强心苷（1）Kedde试剂：+3，5-二硝基苯甲酸试液紫红色（2）Baljet试剂：+碱性苦味酸试液橙或橙红色（3）Legal试剂：+亚硝酰铁氰化钠试液紫红色（4）K-K反应：+FeCl3/冰HAc、浓H2SO4上层绿蓝色（2-去氧糖）界面红棕色（5）薄层层析检查：吸附剂硅胶G或中性氧化铝展开剂n-BuOH：HAc：H2O（4：1：5）显色剂碱性3，5-二硝基苯甲酸试液紫红色碱性苦味酸试液橙红色11、挥发油、油脂（1）油斑检查：油斑挥发挥发油；油斑不消失油脂或类脂（2）磷钼酸反应：喷洒5%磷钼酸试液蓝色（油脂、三萜、甾醇）第四节植物化学成分的提取、分离、纯化和结构鉴定提取分离的过程：去其糟粕取其精华即去粗取精研究植物化学成分不外乎两种情况：a.对活性成分的性质一无所知b.提取已知的成分或已知的化学结构类型（黄柏中提取生物碱黄连素）a.对于活性成分一无所知的情况：b.在临床或药理试验配合下，经不同溶剂提取，确定有效部位，然后再逐步划分，追踪活性成分最集中的部位，最后分得单体。c.b.对于已知成分或已知化学结构的情况：d.查阅资料得到较好的提取方法各部位提取物活性筛选指标活性筛选和评价最好采用体内的方法前体药物活性部位色谱或其他方法进行分离各种组分活性测试量较少，采用体外方法等剂量不等强度原则各部分均有活性，但活性均不强失败有效单体化学结构理化性质波谱数据作业请简要叙述分析某药物中有效成分的研究程序？