核酸的理化性质研究方法精选课件.ppt
关于核酸的理化性质研究方法第一页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v第十四章核酸的物理化学性质第十四章核酸的物理化学性质v一、核酸的水解一、核酸的水解v二、核酸的酸碱性质二、核酸的酸碱性质v三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收v四、核酸的变性、复性及杂交四、核酸的变性、复性及杂交v第十五章核酸的研究方法第十五章核酸的研究方法v一、核酸的分离、纯化和定量测定一、核酸的分离、纯化和定量测定v二、核酸的超速离心二、核酸的超速离心v三、核酸的凝胶电泳三、核酸的凝胶电泳v四、核酸的核苷酸序列测定四、核酸的核苷酸序列测定v五、五、DNA聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）第二页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论核酸的化学结构和作为高聚物决定其理化性质：v核酸的糖苷键和磷酸二酯键：可被水解；v磷酸基和碱基：酸碱性质；v碱基：紫外吸收特性；v双螺旋结构：变性和复性。第三页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论一、核酸的水解v（一）酸水解v糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解，产生嘌呤和嘧啶碱v（二）碱水解vRNA的磷酸酯键更易被碱水解（RNA的核糖上有2-OH，在碱作用下形成磷酸三酯，极不稳定易水解，产生核苷2，3-环磷酸酯，继续水解产生2-核苷酸和3-核苷酸）第四页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论（三）酶水解v专一水解核酸的磷酸二酯键的酶称为专一水解核酸的磷酸二酯键的酶称为核酸酶核酸酶(nuclease)(nuclease)。v能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为为限制性核酸内切酶（限制酶）限制性核酸内切酶（限制酶）。第五页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论1、核酸酶的分类v（1）按底物专一性分类：v核糖核酸酶（核糖核酸酶（ribonuclease,RNaseribonuclease,RNase）：作用于核糖核酸；）：作用于核糖核酸；v脱氧核糖核酸酶（脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease,DNasedeoxyribonuclease,DNase）：作用于脱氧核）：作用于脱氧核糖核酸；糖核酸；v（2）按底物作用的方式分类：v核酸外切酶（核酸外切酶（endonucleaseendonuclease）：）：从多核苷酸链的末端开始从多核苷酸链的末端开始,逐个逐个将核苷酸切下的酶将核苷酸切下的酶；v核酸内切酶核酸内切酶(exonuclease)(exonuclease)：从多核苷酸链的内部开始水解核酸的从多核苷酸链的内部开始水解核酸的酶。酶。第六页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v（3）按磷酸二酯键断裂的方式分类：v一种是在3-OH与磷酸基之间断裂，其产物是5-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（1）；v另一种是在5-OH与磷酸基之间断裂，其产物是3-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（2）。P P PN N N(1)(2)(1)(2)53第七页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v2、核糖核酸酶类v牛胰核糖核酸酶、核糖核酸酶T1、核糖核酸酶T2等；v3、脱氧核糖核酸酶类v牛胰脱氧核糖核酸酶、牛脾脱氧核糖核酸酶、限制性内切酶等。v4、N糖苷酶第八页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论核酸酶核酸酶底物底物切点切点产物产物胰核糖核酸酶胰核糖核酸酶RNA内切核酸酶嘧啶内切核酸酶嘧啶3端，端，留下留下3P3嘧啶单核苷酸或嘧啶单核苷酸或3-嘧嘧啶核苷酸结尾的寡聚核啶核苷酸结尾的寡聚核苷酸苷酸蛇毒磷酸二酯蛇毒磷酸二酯酶酶RNA，DNA外切核酸酶外切核酸酶3端，留端，留下下3OH5单核苷酸单核苷酸牛脾磷酸二酯牛脾磷酸二酯酶酶RNA，DNA外切核酸酶外切核酸酶5端，留端，留下下5OH3单核苷酸单核苷酸大肠杆菌核酸大肠杆菌核酸外切酶外切酶单链单链DNA外切核酸酶外切核酸酶5端，留端，留下下5OH3单核苷酸及一个末单核苷酸及一个末尾二核苷酸尾二核苷酸大肠杆菌核酸大肠杆菌核酸外切酶外切酶双链双链DNA外切核酸酶外切核酸酶3端，留端，留下下3OH5单核苷酸单核苷酸第九页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论第十页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论二、核酸的酸碱性质v1、碱基的解离C的的N3有一对未共用电子，可与质子结合；有一对未共用电子，可与质子结合；C的烯醇式羟基具有释放质子的能力；的烯醇式羟基具有释放质子的能力；U的的N3酸性解离的酸性解离的pK1=9.5;T的的N3酸性解离的酸性解离的pK1=9.9;A的的N1pK1=4.15G的的N7 pK1=3.2 N1pK2=9.6；N9 pK3=12.4第十一页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v2、核苷的解离戊糖的存在增强了碱基的酸性解离：戊糖的存在增强了碱基的酸性解离：A的的N1pK1由由4.15降为降为3.63；C的的pK1由由4.6降为降为4.15；第十二页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论3、核苷酸的解离HpK11.5第十三页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v核苷酸有磷酸与碱基，为两性电介质；vU的碱基碱性极弱，不能形成兼性离子；的碱基碱性极弱，不能形成兼性离子；vA,G,C中，pK1：第一磷酸基：第一磷酸基-PO3H2的解离；的解离；pK2：含氮环：含氮环N+H-的解离；的解离；pK3：第二磷酸基：第二磷酸基-PO3H-的解离；的解离；故其故其pI（pK1+pK2）2vDNA变性双链打开后，碱基即参与酸碱滴定。变性双链打开后，碱基即参与酸碱滴定。第十四页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论三、核酸的紫外吸收vPy和Pu有共轭双键，使 碱基、核苷、核苷酸和核酸能吸收紫外光，最大吸收峰为能吸收紫外光，最大吸收峰为260nm260nm。不同核苷酸不同核苷酸第十五页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论A260CL公式中，公式中，A A260为光密度为光密度，为，为260260nmnm处的碱苦摩尔消光系数处的碱苦摩尔消光系数C C，为每升溶液中碱基的摩尔数，为每升溶液中碱基的摩尔数L L，为比色杯内径的厚度，为比色杯内径的厚度如：已知鸟嘌呤溶液的如：已知鸟嘌呤溶液的A A2602600.3250.325，7.2X107.2X103 3，L L1 1cmcm，则：则：C C0.325/(7.2X100.325/(7.2X103 3X1)X1)4.5X104.5X10-5-5（mol/lmol/l）紫外光区最大吸收：紫外光区最大吸收：260nm，定性定量分析，定性定量分析第十六页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论第五节第五节 DNADNA的理化性质及其应用的理化性质及其应用一、核酸的一般理化性质一、核酸的一般理化性质 v核酸具有酸性；核酸具有酸性；v粘度大；粘度大；第十七页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论二、二、二、二、DNADNA的变性的变性v 在在理理化化因因素素作作用用下下，DNADNA双双螺螺旋旋的的两两条条互互补补链链松松散散而而分分开开成成为为单单链链，从从而而导导致致DNADNA的的理理化化性性质质及及生生物物学学性性 质质 发发 生生 改改 变变，这这 种种 现现 象象 称称 为为DNADNA的的 变变 性性(denaturation)。v变变性性时时维维持持双双螺螺旋旋稳稳定定性性的的氢氢键键断断裂裂，碱碱基基间间的的堆堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。第十八页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v增色效应：指增色效应：指DNA变性后对变性后对260nm紫外光紫外光的光吸收度增加的现象；的光吸收度增加的现象；v旋光性下降；旋光性下降；v粘度降低；粘度降低；v生物学功能丧失或改变。生物学功能丧失或改变。v引引起起DNADNA变变性性的的因因素素主主要要有有：高高温温，强酸、强碱，强酸、强碱，有机溶剂等。有机溶剂等。vDNADNA变性后的性质改变：变性后的性质改变：第十九页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v DNADNA的的变变性性温温度度：加加热热DNADNA溶溶液液，使使其其对对260nm260nm紫紫外外光光的的吸吸收收度度突突然然增增加加，达达到到其其最最大大值值一一半半时时的的温温度度，就就是是DNADNA的的变变性性温度（融解温度，温度（融解温度，TmTm）。第二十页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v TmTm的的 高高 低低 与与DNADNA分分子子中中G+CG+C的的含含量量 有有 关关，G+CG+C的的含含量量越越高高，则则TmTm越高越高。Tm69.3+0.41(GC)12nd第二十一页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论三、三、三、三、DNADNADNADNA的复性与分子杂交的复性与分子杂交的复性与分子杂交的复性与分子杂交v将将热热变变性性后后的的DNADNA溶溶液液缓缓慢慢冷冷却却，在在低低于于变变性性温温度度约约25253030的的条条件件下下保保温温一一段段时时间间（退退火火），则则变变性性的的两两条条单单链链DNADNA可可以以重重新新互互补补而而形形成成原原来来的的双双螺螺旋旋结结构构并并恢恢复复原原有的性质。有的性质。第二十二页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v将将变变性性DNADNA经经退退火火处处理理，使使其其重重新新形形成成双双螺螺旋旋结构的过程，称为结构的过程，称为DNADNA的复性的复性。第二十三页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v 两条来源不同的单链两条来源不同的单链核酸（核酸（DNA或或RNA），），只要它们有大致相同只要它们有大致相同的互补碱基顺序，经的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，退火处理即可复性，形成新的杂合双螺旋，形成新的杂合双螺旋，这一现象称为这一现象称为核酸的核酸的分子杂交分子杂交。第二十四页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v 核酸杂交可以是核酸杂交可以是DNA-DNA，也可以是，也可以是DNA-RNA杂交。杂交。v 不同来源的，具有大致相同不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称互补碱基顺序的核酸片段称为为同源顺序同源顺序。第二十五页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v 利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的具有同源顺序的DNA或或RNA片段。片段。v 常用的核酸分子杂交技术有：常用的核酸分子杂交技术有：Southern杂交杂交（鉴（鉴别别DNA）及）及Northern杂交杂交（鉴别（鉴别RNA）、原位杂、原位杂交、斑点杂交等。交、斑点杂交等。v在核酸杂交分析过程中，常将已知顺序的核酸片段用放在核酸杂交分析过程中，常将已知顺序的核酸片段用放射性同位素或生物素进行标记。这种带有一定标记的已射性同位素或生物素进行标记。这种带有一定标记的已知顺序的核酸片段称为知顺序的核酸片段称为探针探针。第二十六页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论问问 题：题：1 1、DNADNA热变性有何特点？热变性有何特点？T Tm m值表示什么？值表示什么？2 2、在、在pH7.0pH7.0，0.165mol/L NaCl0.165mol/L NaCl条件下，测得某一条件下，测得某一DNADNA样品的样品的TmTm为为89.3 89.3。求出四种碱基百分组成。求出四种碱基百分组成。3 3、DNADNA和和RNARNA的一级结构有何异同？的一级结构有何异同？4 4、简述、简述tRNAtRNA二级结构的组成特点及每一部分的功能。二级结构的组成特点及每一部分的功能。第二十七页，本课件共有28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论感感谢谢大大家家观观看看第二十八页，本课件共有28页
