生物技术基因工程篇精选课件.ppt

关于生物技术基因工程篇第一页，本课件共有62页基因工程基因工程(genetic engineering)n基因工程又称基因工程又称DNA重组技术，即在体外把重组技术，即在体外把两种或者两种以上不同来源的两种或者两种以上不同来源的DNA分子重分子重新组合成新的新组合成新的DNA分子，通过载体转入受分子，通过载体转入受体细胞内，将所需要的经过修饰的基因在体细胞内，将所需要的经过修饰的基因在受体细胞内表达，产生人类所需要的基因受体细胞内表达，产生人类所需要的基因或产物，或转基因生物。或产物，或转基因生物。第二页，本课件共有62页基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤n分分离离/制备目的基因制备目的基因n选选择载体择载体n使目标基因与载体使目标基因与载体DNA连连接接形成重组体形成重组体n以重组体以重组体转转化宿主细胞（细菌或其他细胞）化宿主细胞（细菌或其他细胞）n筛筛选出能够表达重组选出能够表达重组DNA的宿主细胞，使这些细胞扩的宿主细胞，使这些细胞扩增、繁殖增、繁殖 获得大量拷贝的目的基因获得大量拷贝的目的基因 使目的基因在宿主细胞表达出编码的多肽使目的基因在宿主细胞表达出编码的多肽第三页，本课件共有62页基基因因工工程程（原原核核表表达达系系统统）操操作作的的基基本本步步骤骤第四页，本课件共有62页一、目标基因的制备一、目标基因的制备n1、限制性内切酶法（鸟枪法或散弹法）、限制性内切酶法（鸟枪法或散弹法）n2、酶促合成法酶促合成法/反向转录法反向转录法n3、人工合成法、人工合成法n4、通过、通过PCR把目的基因扩增出来把目的基因扩增出来第五页，本课件共有62页1、限制性内切酶法（鸟枪法或散弹法）、限制性内切酶法（鸟枪法或散弹法）第六页，本课件共有62页n优点：原理简单，操作简便，具有一定的应用优点：原理简单，操作简便，具有一定的应用范围范围 基因组文库（基因组文库（genomic library）的制备：用限制性内切酶将基因组）的制备：用限制性内切酶将基因组 DNA切成片段，每一段与一个载体连接成重组切成片段，每一段与一个载体连接成重组DNA，并引入宿，并引入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，称基因文库。主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，称基因文库。n缺点：所获得的缺点：所获得的DNA含有内含子，不能在原核细含有内含子，不能在原核细胞中表达。胞中表达。第七页，本课件共有62页2、酶促合成法、酶促合成法/反向转录法反向转录法 mRNA逆转录逆转录 cDNA第八页，本课件共有62页3、人工合成法、人工合成法蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列 用于结构清楚、分子量较小的基因用于结构清楚、分子量较小的基因核苷酸序列核苷酸序列化学合成目的基因化学合成目的基因按密码子推算按密码子推算第九页，本课件共有62页n 利用化学合成法已成功合成人生长激素释放利用化学合成法已成功合成人生长激素释放因子、胸腺素、血管升压素、胰岛素、因子、胸腺素、血管升压素、胰岛素、干扰干扰素等基因，并进一步生产出相应的药物。素等基因，并进一步生产出相应的药物。第十页，本课件共有62页4、通过、通过PCR把目的基因扩增出来把目的基因扩增出来第十一页，本课件共有62页第十二页，本课件共有62页二、载体的选择二、载体的选择n 载体（载体（vector）：）：运载外源性运载外源性DNA有效地进入到有效地进入到受体细胞内的工具。受体细胞内的工具。n 载体应具备的条件载体应具备的条件分子相对较小（分子相对较小（310kb）,能进行复制，且具有高拷能进行复制，且具有高拷贝数贝数;具有几个单一的酶切位点，酶切位点应在复制子以外适当具有几个单一的酶切位点，酶切位点应在复制子以外适当的位置的位置;能接纳尽可能大的外源性能接纳尽可能大的外源性DNA。外源性。外源性DNA插入后，载插入后，载体在受体细胞中的复制不受影响。体在受体细胞中的复制不受影响。第十三页，本课件共有62页 必须有便于筛选的明显标志，如耐药性和必须有便于筛选的明显标志，如耐药性和空斑形成等空斑形成等,以便于阳性克隆细胞容易被选出；以便于阳性克隆细胞容易被选出；有促进外源性有促进外源性DNA表达的调控区；表达的调控区；对受体细胞无害。对受体细胞无害。天然载体有很多缺点，远远达不到理想载体天然载体有很多缺点，远远达不到理想载体的要求，通常使用的载体都是经过改造过的载体。的要求，通常使用的载体都是经过改造过的载体。第十四页，本课件共有62页质粒（质粒（plasmid）噬菌体（噬菌体（phage）病毒病毒(vector)n 载体的种类载体的种类按来源分按来源分 克隆载体克隆载体(cloning vector)按作用分按作用分表达载体表达载体(expression vector)第十五页，本课件共有62页1、质粒载体、质粒载体n质粒的存在与否一般对细菌的生存没有决定性的影质粒的存在与否一般对细菌的生存没有决定性的影响。响。n带有选择性遗传标志，如基因的产物可能是降解某些带有选择性遗传标志，如基因的产物可能是降解某些抗生素的酶。抗生素的酶。n在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核细胞或真核细胞均可复制的穿梭质粒在原核细胞或真核细胞均可复制的穿梭质粒（shuttle plasmid）。）。n在基因工程中应用广泛在基因工程中应用广泛。n 实际应用的都是人工构建的质粒，其中最常用实际应用的都是人工构建的质粒，其中最常用的是的是pBR322,pUC19等。等。第十六页，本课件共有62页质粒在宿主细胞中的复制有两种类型质粒在宿主细胞中的复制有两种类型n 严密型质粒严密型质粒：复制需要蛋白质合成和：复制需要蛋白质合成和DNA聚合酶聚合酶 的的存在，它的复制与宿主细胞的增殖密切相关，每个宿主存在，它的复制与宿主细胞的增殖密切相关，每个宿主细胞内只有细胞内只有15个严密型质粒。个严密型质粒。n 松弛型质粒松弛型质粒：复制需要：复制需要DNA聚合酶聚合酶，可以在没有蛋，可以在没有蛋白质合成的情况下继续复制，每个宿主细胞内可存有白质合成的情况下继续复制，每个宿主细胞内可存有10200个以上的松弛型质粒，在细胞蛋白质合成及染个以上的松弛型质粒，在细胞蛋白质合成及染色质复制停止的情况下，可继续大量扩增至上千份。色质复制停止的情况下，可继续大量扩增至上千份。利用此原理可在质粒扩增时，加入氯霉素抑制宿主菌蛋利用此原理可在质粒扩增时，加入氯霉素抑制宿主菌蛋白质合成，达到进一步扩增松弛型质粒的目的。白质合成，达到进一步扩增松弛型质粒的目的。第十七页，本课件共有62页PBR322抗氨苄青基因抗氨苄青基因抗四环素基因抗四环素基因第十八页，本课件共有62页质粒的构建质粒的构建第十九页，本课件共有62页质质粒粒携携带带外外源源基基因因第二十页，本课件共有62页第二十一页，本课件共有62页1.（1）噬菌噬菌体体2、噬菌体载体、噬菌体载体感染细菌的病毒感染细菌的病毒特点：特点：双链双链DNADNA分子（线性或环形）分子（线性或环形）两端具有两端具有1212个个ntnt单链互补粘性末端单链互补粘性末端 COSCOS位点位点具非必需区（中间区约具非必需区（中间区约1/31/3长度）长度）可在体外包装成病毒颗粒，可高效感染宿主细可在体外包装成病毒颗粒，可高效感染宿主细胞（大肠杆菌）胞（大肠杆菌）容量大，可以插入容量大，可以插入232325Kb25Kb左右的外源基因。左右的外源基因。第二十二页，本课件共有62页第二十三页，本课件共有62页根据生活周期分根据生活周期分 溶菌溶菌性：在细菌中连续增殖直到细菌裂解，释放噬菌体性：在细菌中连续增殖直到细菌裂解，释放噬菌体 溶溶源源性性：将将其其DNA整整合合入入细细菌菌基基因因组组DNA中中，与与宿宿主主DNA一一起起复复制制，然然后后传传给给子子代代，宿宿主主细细胞胞不不发发生裂解。生裂解。*只有双链只有双链DNA的噬菌体才具的噬菌体才具有有溶源溶源周期。周期。第二十四页，本课件共有62页噬菌体的溶源周期和溶菌周期噬菌体的溶源周期和溶菌周期第二十五页，本课件共有62页类型：类型：插入型载体：只有一个限制性内切酶位点可供插入外源插入型载体：只有一个限制性内切酶位点可供插入外源性性DNA片段。片段。替代型载体：含有某个限制性内切酶的两个切点，这两个替代型载体：含有某个限制性内切酶的两个切点，这两个切点间的片段可以被外源性切点间的片段可以被外源性DNA替代替代。第二十六页，本课件共有62页第二十七页，本课件共有62页蓝白筛选蓝白筛选 载体中含一个载体中含一个LacZ基因基因 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 X-gal(无色无色)X(蓝色蓝色)+gal(半乳糖半乳糖)其中其中X为显色底物：为显色底物：5-溴溴-4-氢氢-3-吲哚吲哚-D半乳糖苷半乳糖苷 在含在含X-gal和和Lac操纵子诱导物操纵子诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的培养（异丙基硫代半乳糖苷）的培养基中基中 非重组的噬菌体转化的宿主菌可以合成非重组的噬菌体转化的宿主菌可以合成-半乳糖苷酶，分解半乳糖苷酶，分解X-gal，菌落形成蓝色噬菌斑。菌落形成蓝色噬菌斑。重组重组的的噬菌体因的的噬菌体因LacZ基因被外源基因被外源DNA插入而破坏，故其转化的宿插入而破坏，故其转化的宿主菌不能产生主菌不能产生-半乳糖苷酶，因而菌落形成无色噬菌斑。半乳糖苷酶，因而菌落形成无色噬菌斑。编码编码第二十八页，本课件共有62页第二十九页，本课件共有62页第三十页，本课件共有62页1.（2）M13噬菌体（噬菌体（M13 phage）特点：特点：单链线性单链线性DNADNA分子分子大肠杆菌被感染后，并不死亡，只是生长缓慢，大肠杆菌被感染后，并不死亡，只是生长缓慢，而新的噬菌体被释放到菌体外。而新的噬菌体被释放到菌体外。感染大肠杆菌后，感染大肠杆菌后，单链线性单链线性DNA分子可分子可转变成双链转变成双链复制型复制型(RF)(RF)。从大肠杆菌中分离出。从大肠杆菌中分离出双链复制型的双链复制型的M13还可作为克隆双链还可作为克隆双链DNA的载体的载体具非必需区具非必需区(IS)(IS)第三十一页，本课件共有62页从宿主菌体中释放出来的从宿主菌体中释放出来的M13M13噬菌体粒子只含单噬菌体粒子只含单链链DNA,DNA,其中包含有被克隆的外源性其中包含有被克隆的外源性DNADNA片段中两条片段中两条中的一条，因此可用来制备单链中的一条，因此可用来制备单链DNADNA探针，也可以探针，也可以用作用作DNADNA测序的模板。测序的模板。筛选：蓝白筛选筛选：蓝白筛选第三十二页，本课件共有62页 是指含有入噬菌体粘性末端的杂种质粒。是指含有入噬菌体粘性末端的杂种质粒。由入噬菌体的由入噬菌体的cos区与质粒重组建造而成。区与质粒重组建造而成。在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。不表达噬菌体的任何功能。1.（3）粘尾质粒粘尾质粒(cosmid)/粘性质粒粘性质粒/粘粘粒粒/cos质粒质粒第三十三页，本课件共有62页cosmid的构造特点的构造特点:含有抗药标志和复制起始部位；含有抗药标志和复制起始部位；一个或多个单一酶的限制位点；一个或多个单一酶的限制位点；带有入噬菌体粘性末端；带有入噬菌体粘性末端；分子小，可容纳大的外源分子小，可容纳大的外源DNA片段。片段。第三十四页，本课件共有62页 将染色体端粒序列（将染色体端粒序列（TEL）、自主复制序列）、自主复制序列（ARS）、着丝粒（）、着丝粒（CEN）以及必要的选择标记）以及必要的选择标记（HISA4和和TRP）基因和多克隆位点（）基因和多克隆位点（MSC）的）的DNA片段克隆到片段克隆到pBR322中，转化酵母细胞中，转化酵母细胞 YAC。1.（1）酵母为宿主的载体）酵母为宿主的载体3、真核细胞为宿主的克隆载体、真核细胞为宿主的克隆载体人工构建的酵母质粒人工构建的酵母质粒 酵母人工微小染色体（酵母人工微小染色体（YAC）第三十五页，本课件共有62页第三十六页，本课件共有62页1.（2）以植物细胞为宿主的基因克隆载体）以植物细胞为宿主的基因克隆载体TiTi质粒质粒第三十七页，本课件共有62页1.（3）DNA病毒载体病毒载体1 1）SV40SV40载体（猴肾病毒）载体（猴肾病毒）完整的完整的SV40SV40载体载体 利用利用SV40元件组建的穿梭质粒载体，元件组建的穿梭质粒载体，如如pSVK3质粒：质粒：由由 噬菌体噬菌体 三种载体构建而成三种载体构建而成 质粒质粒 SV402 2）乳头瘤病毒载体）乳头瘤病毒载体 如如pBPV载体是在牛载体是在牛乳头瘤病毒基础上构建的穿梭乳头瘤病毒基础上构建的穿梭载体。载体。3 3）腺病毒载体）腺病毒载体 如如pBPV载体是在牛载体是在牛乳头瘤病毒基础上构建的穿梭乳头瘤病毒基础上构建的穿梭载体。载体。第三十八页，本课件共有62页n 克隆载体克隆载体(cloning vector)用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。n 表达载体表达载体(expression vector)在在受受体体细细胞胞中中表表达达（转转录录和和翻翻译译）外外源源基基因因的的载体。载体。第三十九页，本课件共有62页启启动动子子、核核糖糖体体结结合合位位点点、克克隆隆位位点点、转转录录终止信号终止信号大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体除克隆载体的特性外还含有：除克隆载体的特性外还含有：哺乳动物表达载体哺乳动物表达载体 除除含含有有原原核核序序列列（在在E-Coli中中的的复复制制起起始始点点、便便于于筛筛选选的的抗抗性性基基因因）还还包包括括：启启动动子子/增增强强子子、克克隆隆位位点、终止信号和加点、终止信号和加poly（A）信号。）信号。第四十页，本课件共有62页三、三、目标基因与载体目标基因与载体DNA连接形连接形成重组体成重组体 工具酶工具酶1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)1.能识别能识别DNA分子内部的特异的对称序列分子内部的特异的对称序列,水解磷水解磷酸酯键，切断分子。酸酯键，切断分子。1.识别序列的特点识别序列的特点2.专一；专一；常由常由46个碱基组成；个碱基组成；具有具有回文序回文序列列BamH 1 酶酶-GGATCC-CCTAGG-第四十一页，本课件共有62页1.限制性内切酶都限制性内切酶都是从原核生物中发现的。是从原核生物中发现的。到目前为止已发现上千到目前为止已发现上千种限制性内切酶，其中种限制性内切酶，其中数十种被经常使用。数十种被经常使用。1.水解磷酸二酯键，水解磷酸二酯键，产生产生DNA片段的片段的5端为端为P，3 端为端为OH第四十二页，本课件共有62页第四十三页，本课件共有62页限制酶的命名限制酶的命名 EcoR 细菌的属名细菌的属名从该细菌中分离出的第几个酶从该细菌中分离出的第几个酶细菌种名细菌种名细菌株系细菌株系第四十四页，本课件共有62页切口类型：切口类型：（1）形成粘末端）形成粘末端(cohesive end)：第四十五页，本课件共有62页目的基因目的基因第四十六页，本课件共有62页第四十七页，本课件共有62页连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的连接起来，使之成为一个完整的DNADNA分子。分子。第四十八页，本课件共有62页（2）形成平末端）形成平末端SmaCCCGGG GGGCCC第四十九页，本课件共有62页nDNA连接连接酶酶(DNA ligase)第五十页，本课件共有62页四、重组四、重组DNA导入受体细胞导入受体细胞n转化（转化（transformation）以质粒为载体，将携带外源基因进入受体细胞以质粒为载体，将携带外源基因进入受体细胞的过程。的过程。n转染（转染（transfection）由噬菌体或病毒介导外源由噬菌体或病毒介导外源DNA进入宿主细胞的进入宿主细胞的过程。过程。第五十一页，本课件共有62页n受体细胞受体细胞大肠杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌细胞酵母菌细胞、哺乳动物细胞哺乳动物细胞、昆昆虫细胞虫细胞受体细胞必须是限制性内切酶缺陷型，即受体细胞必须是限制性内切酶缺陷型，即R-菌株，使载菌株，使载体或重组体或重组DNA不被水解不被水解第五十二页，本课件共有62页n受体细胞受体细胞大肠杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌细胞酵母菌细胞、哺乳动物细胞哺乳动物细胞、昆虫昆虫细胞细胞细菌细胞作为表达系统细菌细胞作为表达系统 优点：优点：操作简单、增代时间短、价格低廉；操作简单、增代时间短、价格低廉；某些蛋白质的表达水平很高某些蛋白质的表达水平很高 缺点缺点:表达多肽分子常不能适当地折叠表达多肽分子常不能适当地折叠,蛋白质常蛋白质常 无生无生物活性；物活性；异体蛋白质，常对细菌有毒性作用；异体蛋白质，常对细菌有毒性作用；缺乏真核细胞进行转录后修饰的酶，例如使蛋白缺乏真核细胞进行转录后修饰的酶，例如使蛋白质磷酸化、糖基化质磷酸化、糖基化第五十三页，本课件共有62页转化的方法转化的方法（1）化学转化法）化学转化法 Cacl2致敏转化法致敏转化法n宿主：大肠杆菌宿主：大肠杆菌n感受态细胞（感受态细胞（Competent Cell）：）：E-coli经经Cacl2处理处理（0-5），使细胞膜通透性增加，从而具有摄取外），使细胞膜通透性增加，从而具有摄取外源源DNA的能力。的能力。第五十四页，本课件共有62页转化程序：转化程序：感感受受态态细细胞胞+质质粒粒DNA DNA 4242、90sec 90sec 不不含含抗抗生生素素的的培培养养基基热休克热休克37 37 涂布选择性平板涂布选择性平板 37 37 得到细胞的克隆得到细胞的克隆 30-60min 30-60min （合适抗生素）（合适抗生素）10hr 10hr （使质粒扩增）（使质粒扩增）第五十五页，本课件共有62页（2）物理转化法）物理转化法n高电压脉冲点击转化高电压脉冲点击转化n微量注射法微量注射法第五十六页，本课件共有62页（1）磷酸钙共沉淀法（）磷酸钙共沉淀法（Calcium phosphate co-pecipitation）外源外源DNA或重组质粒或重组质粒DNA与磷酸钙混合，与磷酸钙混合，形成微小颗粒，沉积在细胞表面，被宿主细形成微小颗粒，沉积在细胞表面，被宿主细胞摄取。胞摄取。转染的方法转染的方法第五十七页，本课件共有62页（2）电穿孔法（）电穿孔法（electroporation）外源外源DNA与宿主细胞混合于电穿孔杯中，在高频电流与宿主细胞混合于电穿孔杯中，在高频电流作用下，细胞膜出现许多小孔，外源作用下，细胞膜出现许多小孔，外源DNA进入宿主细进入宿主细胞。胞。第五十八页，本课件共有62页（3）脂质体介导法）脂质体介导法 脂质体是由磷脂双分子层组成的人工膜状结脂质体是由磷脂双分子层组成的人工膜状结构，可以将构，可以将DNA包在其内，并通过脂质体与包在其内，并通过脂质体与原生质体的融合或原生质体和吞噬过程，把原生质体的融合或原生质体和吞噬过程，把外源外源DNA转运到细胞内。转运到细胞内。（4）显微注射法）显微注射法 第五十九页，本课件共有62页五、筛选出能够表达重组五、筛选出能够表达重组DNA的的宿主细胞宿主细胞 （1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子选转化子（2）根据）根据lacZ基因互补显色筛选转化子基因互补显色筛选转化子（3）根据报告基因筛选转化子）根据报告基因筛选转化子（4）核酸杂交筛选法）核酸杂交筛选法第六十页，本课件共有62页第六十一页，本课件共有62页感谢大家观看第六十二页，本课件共有62页