色谱法的基本原理精选课件.ppt

关于色谱法的基本原理关于色谱法的基本原理第一页，本课件共有90页2.1 色谱法概述 2.1.1 2.1.1 色谱法的起源和发展色谱法的起源和发展 胡萝卜素(黄色)石油醚+植物色素石油醚CaCO3固定相叶绿素(绿色)叶黄素(黄色)第二页，本课件共有90页液液分配色谱液液分配色谱硅胶硅胶水水乙醇氯仿乙醇氯仿(流动流动相相)各种氨基酸各种氨基酸硅胶为载体硅胶为载体水为固定相水为固定相第三页，本课件共有90页年代年代发明者发明者发明的色谱方法或重要应用发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。1931Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。1938Izmailov,Shraiber最先使用薄层色谱法。1938Taylor,Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941Martin,Synge提出色谱塔板理论；发明液提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。为流动相（即气相色谱）。1944Consden等发明了纸色谱。1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。1952Martin,James从理论和实践方面完善了气从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。液分配色谱法。1956Van Deemter等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1959Porath,Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。1964Moore发明凝胶渗透色谱。1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981Jorgenson等创立了毛细管电泳法。第四页，本课件共有90页一、色谱法的定义一、色谱法的定义2.1.2 2.1.2 色谱法定义和分类色谱法定义和分类定义：定义：利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。平衡，使各溶质达到相互分离。特点：特点：高超的分离能力，高超的分离能力，是一种物理化学分析方法是一种物理化学分析方法第五页，本课件共有90页具体优点：具体优点：（1 1）分离效率高。）分离效率高。（2 2）应用范围广。）应用范围广。（3 3）分析速度快。）分析速度快。（4 4）样品用量少。）样品用量少。（5 5）灵敏度高。）灵敏度高。（6 6）分离和测定一次完成分离和测定一次完成。（7 7）易于自动化，可在工业流程中使用。）易于自动化，可在工业流程中使用。定性能力较差。定性能力较差。色谱法的缺点色谱法的缺点第六页，本课件共有90页二、色谱法的重要概念二、色谱法的重要概念固定相流动相色谱柱 第七页，本课件共有90页1 1、按流动相所处的状态分类、按流动相所处的状态分类 气相色谱气相色谱 -用气体作流动相用气体作流动相 液相色谱液相色谱 -用液体作流动相用液体作流动相气气固色谱固色谱气气液色谱液色谱液液固色谱固色谱液液液色谱液色谱三、色谱法的分类三、色谱法的分类超临界流体色谱超临界流体色谱第八页，本课件共有90页2 2、按固定相使用的形状分类、按固定相使用的形状分类柱色谱：固定相装在柱管内。柱色谱：固定相装在柱管内。纸色谱纸色谱薄层色谱薄层色谱(纸色谱和薄层色谱又统称作平板色谱纸色谱和薄层色谱又统称作平板色谱)第九页，本课件共有90页第十页，本课件共有90页第十一页，本课件共有90页3 3、按分离过程的物理化学原理分类、按分离过程的物理化学原理分类 吸附色谱吸附色谱 (L(LS S，G GS)S)分配色谱分配色谱 (L(LL L，G GL)L)离子交换色谱离子交换色谱 (L(LS)S)空间排阻色谱空间排阻色谱 (L(LS)S)第十二页，本课件共有90页吸附色谱吸附色谱 (L(LS S，G GS)S)第十三页，本课件共有90页分配色谱分配色谱 (L(LL L，G GL)L)ConditionedsorbentGoodtransportbetweensampleandsorbent硅胶硅胶水水第十四页，本课件共有90页离子交换色谱离子交换色谱 (L(LS)S)OHElectrostaticattractionSilicabaseCO2HCO2-OCON(CH3)2+NNH3+SO3-第十五页，本课件共有90页空间排阻色谱(LS)第十六页，本课件共有90页2.2 2.2 色谱分离原色谱分离原理理1.分配系数（分配系数（K）Cs：被测组分在固定相中的浓度被测组分在固定相中的浓度Cm：被测组分在被测组分在流动相中的浓度流动相中的浓度2.2.1 2.2.1 分配系数和分配比分配系数和分配比 第十七页，本课件共有90页分配系数意义：分配系数意义：K是热力学常数，是热力学常数，K值除了与温度、压力有关外，值除了与温度、压力有关外，还与被测物、固定相和流动相的性质有关。还与被测物、固定相和流动相的性质有关。K值大值大Cs大大tR长长移动速度慢。移动速度慢。若两组分的若两组分的K值相等值相等两个组分分离开。两个组分分离开。第十八页，本课件共有90页2.分配比（分配比（k）：相比相比第十九页，本课件共有90页分配比的意义：分配比的意义：k随随K和和的变化而变化；的变化而变化；k值越大值越大ms越多越多柱的容量大柱的容量大 k又称作又称作容量因子容量因子。k是表征色谱柱对被测组分保留能力的主要参是表征色谱柱对被测组分保留能力的主要参数。数。第二十页，本课件共有90页2.2.2 2.2.2 色谱法分离原理色谱法分离原理第二十一页，本课件共有90页色谱分离过程的特点：不同组分在通过色谱柱时移动速度不等。色谱分离过程的特点：不同组分在通过色谱柱时移动速度不等。流动相 BBA空气B A+B A检测和记录A+B+空气进样固定相流动相第二十二页，本课件共有90页10020030040050.0310.00160.0780.00470.1180.00880.1380.01490.1380.021100.1250.03110.1050.04120.0830.045130.0630.05第二十三页，本课件共有90页2.3 色谱流出曲线 五种磺胺的色谱图第二十四页，本课件共有90页气相色谱分离多环芳烃色谱图第二十五页，本课件共有90页一、色谱流出曲线或色谱图一、色谱流出曲线或色谱图 以检测器对组分的响应信号为纵坐标，流出时间以检测器对组分的响应信号为纵坐标，流出时间(或流出体积或流出体积)为横为横坐标作图所得的曲线。坐标作图所得的曲线。Rf(t,V)二、色谱流出曲线构成：二、色谱流出曲线构成：由基线和色谱峰组成。由基线和色谱峰组成。基线：基线：指仅有流动相通过而没有待测物，检测器响应信号指仅有流动相通过而没有待测物，检测器响应信号随流出随流出时间时间的变化。的变化。色谱峰：色谱峰：在基线上突起的部分，它是由引入流动相中被测物引起的。在基线上突起的部分，它是由引入流动相中被测物引起的。第二十六页，本课件共有90页色谱图或色谱流出曲线色谱图或色谱流出曲线第二十七页，本课件共有90页描述色谱峰三种参数描述色谱峰三种参数峰高峰高(或峰面积或峰面积)峰的大小峰的大小区域宽度区域宽度 峰的形状峰的形状保留值保留值(时间时间t t、体积、体积v)v)峰的位置峰的位置2.3.1 2.3.1 色谱峰色谱峰高斯分布曲线高斯分布曲线第二十八页，本课件共有90页1峰高峰高h2标准偏差标准偏差，0.607h处，拐点处，峰宽正好为处，拐点处，峰宽正好为23峰面积峰面积A A1.065hY1/24半峰宽半峰宽Y1/2 Y1/2=2.3545峰底宽峰底宽Y=4，拐点作切线与基线相交，相交两点间距离为，拐点作切线与基线相交，相交两点间距离为峰底宽峰底宽Y。Y1/2、Y统称为区域宽度统称为区域宽度第二十九页，本课件共有90页 通常用将各组分带出色谱柱所需的载气体积通常用将各组分带出色谱柱所需的载气体积或时间表示。或时间表示。2.3.2 2.3.2 保留值保留值定义：定义：在一定的在一定的固定相固定相和和操作条件操作条件下，任何一种物质都有一下，任何一种物质都有一个固定的保留值，故组分的保留值可用于该组分的定个固定的保留值，故组分的保留值可用于该组分的定性鉴定性鉴定。特点：特点：第三十页，本课件共有90页1 1死时间死时间t tM M说明：说明：实际上就是流动相通过色谱柱所需要的时实际上就是流动相通过色谱柱所需要的时间。或是组分在流动相中所消耗的时间。间。或是组分在流动相中所消耗的时间。t tM M由色谱柱中流动相体积由色谱柱中流动相体积V Vm m与流动相流速决与流动相流速决定，与被测组分和固定相无关。定，与被测组分和固定相无关。第三十一页，本课件共有90页2.2.保留时间保留时间t tR R 定义：定义：从进样开始到柱后从进样开始到柱后,组分出现响应信号极大值组分出现响应信号极大值 时所需时间。时所需时间。说明：说明：组分的保留时间就是组分通过色谱柱所需的时组分的保留时间就是组分通过色谱柱所需的时间。即组分在色谱柱内运行的时间。间。即组分在色谱柱内运行的时间。影响因素：影响因素：流流 动动 相相性质、在色谱柱中的体积性质、在色谱柱中的体积Vm和流速和流速固固 定定 相相性质、在色谱柱中的体积性质、在色谱柱中的体积Vs；被测组分被测组分性质性质 第三十二页，本课件共有90页3.3.调整保留时间调整保留时间（）定义：定义：扣除死时间后的保留时间。扣除死时间后的保留时间。说明：说明：组分在固定相中停留的时间组分在固定相中停留的时间。=注意：第三十三页，本课件共有90页4.4.流动相的流速流动相的流速 定义：定义：单位时间流动相所通过的距离单位时间流动相所通过的距离-线流速，线流速，u单位时间通过流动相的体积单位时间通过流动相的体积-体积流速，体积流速，F单位时间通过流动相的量单位时间通过流动相的量-质量流速，质量流速，Fm和摩尔流速，和摩尔流速，Fn)F、Fm和和Fn常称作流量。常称作流量。第三十四页，本课件共有90页线流速线流速 l/t(m/min)体积流速体积流速v/t(ml/min)质量流速质量流速m/t(g/min)F说明：说明：在流路的任何一点，在流路的任何一点，质量流速或摩尔流速相等。质量流速或摩尔流速相等。Fm=Fn 对于气相色谱，线流速和体积流速可能各处不同；对于气相色谱，线流速和体积流速可能各处不同；对于液相色谱，线流速可能不一样，但体积流速可视为各处相同。对于液相色谱，线流速可能不一样，但体积流速可视为各处相同。气体状态方程气体状态方程不同位置处，线流速不同不同位置处，线流速不同第三十五页，本课件共有90页气相色谱中柱内平均体积流速的确定气相色谱中柱内平均体积流速的确定c c点处的平均体积流速点处的平均体积流速 为柱内气体的平均摩尔流速为柱内气体的平均摩尔流速 为流量计内为流量计内r r处气体的摩尔流速处气体的摩尔流速 F Fc c很难测，且为柱内平均值，很难测，且为柱内平均值，F Fr r易测，求易测，求F Fr r与与F Fc c的关系即可。的关系即可。第三十六页，本课件共有90页第三十七页，本课件共有90页第三十八页，本课件共有90页柱内平均压力柱内平均压力 Pcr点处载气的压力点处载气的压力PrPr=PoPw 第三十九页，本课件共有90页压力校正项湿度校正项温度校正项第四十页，本课件共有90页5.5.死体积死体积V VM M定义：不被固定相保留的组分，通过色谱柱时所需流定义：不被固定相保留的组分，通过色谱柱时所需流动相的体积。动相的体积。计算：计算：VM=tM 第四十一页，本课件共有90页6.6.保留体积保留体积V VR R 定义：从进样开始到柱后出现待测组分响应信号极大值定义：从进样开始到柱后出现待测组分响应信号极大值时所通过的载气体积。时所通过的载气体积。计算：VR=tR注意：各种保留时间受流动相流速的影响，各种保留注意：各种保留时间受流动相流速的影响，各种保留体积与流动相流速无关。体积与流动相流速无关。第四十二页，本课件共有90页7.7.调整保留体积调整保留体积定义：定义：保留体积扣除死体积后的体积保留体积扣除死体积后的体积计算公式：=VR VM 计算公式：计算公式：第四十三页，本课件共有90页8.8.相对保留值相对保留值 r2,1 （选择性因子（选择性因子 ）定义：相对保留值 r2,1是指组分2的调整保留值调整保留值与组分1的调整保留值调整保留值之比公式：越大越大两组分容易分离；两组分容易分离；=1时时两组分不能分开。两组分不能分开。说明：说明：只与只与柱温和固定相性质柱温和固定相性质有关有关 第四十四页，本课件共有90页9.9.保留值与分配比的关系保留值与分配比的关系被测物在色谱柱内的平均线流速被测物在色谱柱内的平均线流速 x x为为 流动相在色谱柱内的平均线流速流动相在色谱柱内的平均线流速 为为 L L为色谱柱长为色谱柱长被测物出现在流动相中的几率为被测物出现在流动相中的几率为 x x 与与 的关系为的关系为 第四十五页，本课件共有90页色谱柱长是一定的，所以 第四十六页，本课件共有90页色谱过程方程：色谱过程方程：表达了保留时间保留时间与分配系数或容量因子分配系数或容量因子两个重要参数的关系。容量因子越大，溶质的保留时间也越长。对于混合物，分配系数不等是分离的前提。第四十七页，本课件共有90页例例2.1 2.1 已知已知V Vs s=2.0 mL=2.0 mL，F Fc c=50 mLmin=50 mLmin-1-1，t tR R=5 min5 min，t tM M=1=1 min min。求求V VM M，V VR R，k k，K K。第四十八页，本课件共有90页第四十九页，本课件共有90页 色谱流出曲线可以解决的问色谱流出曲线可以解决的问题题1样品所含最少组分个数 2可以进行定性分析3可以进行定量分析4可对色谱柱效能进行评价5.色谱过程的热力学问题6.色谱过程的动力学问题总结总结第五十页，本课件共有90页色谱理论色谱理论 色谱理论需要解决的问题：影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系 色谱分离过程的热力学和动力学问题。第五十一页，本课件共有90页2.4 2.4 塔板理论塔板理论 第五十二页，本课件共有90页2.4.1 2.4.1 塔板理论的假设塔板理论的假设1.柱分成n段，n为理论塔板数，每段高为H，H为塔板高度，柱长为L，则n=L/H2.所有组分开始都加在第零号塔板上。3.在每块塔板上被测物在两相间平衡是瞬间建立的。4.流动相是以脉冲式(塞子式)进入色谱柱进行冲洗的，每次恰好为一个塔板体积V。5.在所有塔板上，同一组分的分配系数为常数，即和组分的量无关。6.沿色谱柱方向不存在塔板与塔板间被测物的纵向扩散。第五十三页，本课件共有90页第五十四页，本课件共有90页假定：K=1 Vs/Vm=1 k=1 n=5 进样量 m=1mg板体积数板体积数（VV）0 01 12 23 34 40 00.50.50.50.51V1V0.250.250.250.250.250.250.250.252V2V0.1250.1250.250.250.1250.1250.1250.1250.250.250.1250.1253V3V0.06250.06250.1880.1880.1880.1880.06250.06250.06250.06250.1880.1880.1880.1880.06250.06254V4V0.03120.03120.1250.1250.1880.1880.1250.1250.03120.03120.03120.03120.1250.1250.1880.1880.1250.1250.03120.0312检测器检测器第五十五页，本课件共有90页这一理论得到结果这一理论得到结果1分布有一最大，两边逐渐减小2色谱流出曲线的形状类似于数学上的正态分布曲线正态分布方程为：第五十六页，本课件共有90页C：不同流出体积时的组分浓度m：进样量 VR：保留体积n：塔板数 V ：流出体积将正态分布方程用于色谱流出曲线方程的数学表达式，也称塔板理论方程塔板理论方程：第五十七页，本课件共有90页令：为标准偏差 令：令：m=1 当当VVR时，时，当则则：则：第五十八页，本课件共有90页将代入第五十九页，本课件共有90页由Y1/2=2.354 和 Y=4 可证明Y1/2=0.5885Y第六十页，本课件共有90页为了准确评价色谱柱效能，宜采用有效塔板数为了准确评价色谱柱效能，宜采用有效塔板数n neffeff和有效塔板高度和有效塔板高度H Heffeff第六十一页，本课件共有90页理论塔板数和有效塔板数关系理论塔板数和有效塔板数关系说明：说明：对于n和neff以及H和Heff，用同一色谱柱时对不同物质是不一样的；同一物质，对不同柱子也不一样。第六十二页，本课件共有90页塔板理论的成功与不足塔板理论的成功与不足成功：成功：1、导出了色谱流出曲线的数学表达式；2、说明了色谱峰的形状呈正态分布；3、解释了浓度极大点；4、提出了评价柱效的参数(n)及其计算式 不足：不足：1、仅考虑了热力学因素，没有考虑动力学因素；2、不能说明影响柱效的因素及谱带扩张的原因；3、不能说明流动相流速对柱效的影响，而实验事实是流速不同时测得的n(或H)不同 第六十三页，本课件共有90页2.5 2.5 速率理论速率理论2.5.1 气相色谱法色谱过程的动力学理论色谱过程的动力学理论塔板高度塔板高度H H 与载气线速度的关系与载气线速度的关系第六十四页，本课件共有90页A A 为涡流扩散项，为涡流扩散项，B B 为分子扩散项系数，为分子扩散项系数，C C 为传质阻力项系数，为传质阻力项系数，为载气的平均线流速为载气的平均线流速范弟姆特方程范弟姆特方程第六十五页，本课件共有90页1 1涡流扩散项涡流扩散项AA=2dP：填充不规则因子：填充不规则因子dP：填充物颗粒的平均直径：填充物颗粒的平均直径第六十六页，本课件共有90页第六十七页，本课件共有90页影响：影响：填充物颗粒的大小、分布以及填充均匀的程度；不受影响：不受影响：载气性质、线速度和组分无关。减小涡流扩散提高柱效的有效途径：减小涡流扩散提高柱效的有效途径：使用适当小的颗粒，且颗粒均匀的填充物，并尽量填充均匀。对于空心毛细管柱，A=0。A=2dP第六十八页，本课件共有90页12与颗粒的均匀程度有关及填充的均匀程度有关第六十九页，本课件共有90页2 2分子扩散项分子扩散项分子扩散项的系数B：B=2 Dg：弯曲因子Dg：组分在气相中的扩散系数(cm2s-1)第七十页，本课件共有90页第七十一页，本课件共有90页与填充物有关：与填充物有关：对于填充柱，=0.50.7；对于毛细管柱，=1.0。Dg与组分的性质、载气的性质、柱温和柱压等因素有关：与组分的性质、载气的性质、柱温和柱压等因素有关：分子量大的组分分子量大的组分Dg小；小；Dg反比于载气分子量的平方根反比于载气分子量的平方根,故采用分子量较大的载气可使故采用分子量较大的载气可使B项降低；项降低；Dg随柱温升高而增大，而随柱压增大而减小随柱温升高而增大，而随柱压增大而减小。B=2 Dg第七十二页，本课件共有90页3 3传质阻力项传质阻力项 C传质：传质：物质因浓度不均匀而发生的迁移过程称为传质 传质阻力：传质阻力：影响此迁移过程速度的阻力称为传质阻力 传质阻力种类：传质阻力种类：包括气相和液相传质阻力，而传质阻力系数也包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数ClC=Cg+Cl 第七十三页，本课件共有90页气相传质过程气相传质过程气相传质过程是待测组分从气液界面移动到气相内部而后气相传质过程是待测组分从气液界面移动到气相内部而后又移动到液相表面的过程。又移动到液相表面的过程。第七十四页，本课件共有90页影影 响：响：Cg与填充物粒度dp的平方成正比，与组分在载气流中的扩散系数Dg成反比。解决方法：解决方法：因此采用粒度小的填充物和分子量小的气体作载气可使Cg减小,从而提高柱效。对于填充柱：对于填充柱：气相传质阻力系数气相传质阻力系数第七十五页，本课件共有90页液相传质过程液相传质过程液相传质过程是指待测组分从气液界面移动到液相内部，发生质量交换以达到分配平衡，然后又返回气液界面的传质过程。第七十六页，本课件共有90页影影 响：响：固定相液膜厚度（df）和组分在液相中的扩散系数（Dl）。解决方法：解决方法：减小液膜厚度df，增大组分在液相中的扩散系数Dl，均可提高柱效。液相传质阻力系数液相传质阻力系数第七十七页，本课件共有90页速率理论方程速率理论方程填料性质：填料性质：填料颗粒均匀程度、填料颗粒大小填料颗粒均匀程度、填料颗粒大小填充情况填充情况：填料在色谱柱中填充均匀程度填料在色谱柱中填充均匀程度流动相流动相：流动相种类和流速流动相种类和流速固定相固定相：固定液厚度固定液厚度公式说明影响公式说明影响n或或H的因素的因素结论：范弟姆特方程对色谱分离条件的选择具有指导意义结论：范弟姆特方程对色谱分离条件的选择具有指导意义第七十八页，本课件共有90页2.6 2.6 分离度分离度(Rs)2.6.1 2.6.1 定义定义Rs是相邻两组分色谱峰保留值 和 之差与两个组分色谱峰峰底宽Y1和Y2总和的一半的比值 衡量色谱图中相邻两峰分离程度意义意义第七十九页，本课件共有90页热力学因素（两峰离开距离）热力学因素（两峰离开距离）动力学因素（两峰宽窄）动力学因素（两峰宽窄）第八十页，本课件共有90页不同分离度下色谱峰示意图不同分离度下色谱峰示意图通常用通常用Rs=1.5 作为相邻两色谱峰完全分开的指标作为相邻两色谱峰完全分开的指标 R=0.8：两峰的分离程度可达：两峰的分离程度可达89%；R=1：分离程度：分离程度98%；R=1.5：达：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。（相邻两峰完全分离的标准）。R=0.75 R=1 R=1.5第八十一页，本课件共有90页2.5.2 2.5.2 色谱分离基本方程式色谱分离基本方程式假定，则又第八十二页，本课件共有90页将 代入上式，得第八十三页，本课件共有90页柱选择性项柱效项柱容量项假定 ，的情况下，分离度方程简单地表示为：分离度方程或色谱分离基本方程式分离度方程或色谱分离基本方程式意义指出了可以通过改变n、a和k等参数来控制分离度第八十四页，本课件共有90页根据这一公式可得 进而导出 第八十五页，本课件共有90页2.5.3 2.5.3 影响分离度的因素影响分离度的因素1、增加柱长，可以改进分离度2、增加 n 的另一个方法是减小H1 1柱效的影响柱效的影响Rs 与 成正比第八十六页，本课件共有90页2.5.3 2.5.3 影响分离度的因素影响分离度的因素柱容量项随 k 的增大而增加，也随之增加；当 时，其对 的改进已不明显；k 值太大时，会大大延长分析时间，峰展宽；k 的最佳范围一般控制在110之间。2 2分配比（容量因子）的影响分配比（容量因子）的影响柱容量项第八十七页，本课件共有90页越大，Rs也随之增加；值从1.01增加至1.10，可使Rs增加9倍。值是提高分离度最有效的方法。增加2.5.3 2.5.3 影响分离度的因素影响分离度的因素3 3选择性的影响选择性的影响第八十八页，本课件共有90页 影响分离度的因素 在n，k和a系数中，增大a对提高Rs最有效。当a1.5时，a的改变对Rs影响较小。第八十九页，本课件共有90页2022/12/9感感谢谢大大家家观观看看第九十页，本课件共有90页