蛋白质组学及其研究方法精选课件.ppt

关于蛋白质组学及其研究方法第一页，本课件共有47页一、蛋白质组学的相关概念 蛋白质组蛋白质组 澳大利亚学者澳大利亚学者Williams和和Wilkins于于19941994年首先提出年首先提出protein +genome =proteome 一个基因组所表达的全套蛋白质一个基因组所表达的全套蛋白质 一个细胞或一个机体的基因所表达的全部蛋白质一个细胞或一个机体的基因所表达的全部蛋白质第二页，本课件共有47页蛋白质组是：蛋白质组是：对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。于一个或几个蛋白质。同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同同 。在空间和时间上动态变化着的整体。在空间和时间上动态变化着的整体。第三页，本课件共有47页蛋白质组学蛋白质组学 旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式与功能模式旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式与功能模式 从整体的角度分析、鉴定细胞内动态变化的蛋白质的从整体的角度分析、鉴定细胞内动态变化的蛋白质的组成、结构、性质、表达水平与修饰状态组成、结构、性质、表达水平与修饰状态,了解蛋白了解蛋白质之间、蛋白质与大分子之间的相互作用与联系质之间、蛋白质与大分子之间的相互作用与联系,揭示蛋白质的功能与细胞生命活动的规律揭示蛋白质的功能与细胞生命活动的规律第四页，本课件共有47页二、蛋白组学的研究内容 蛋白质组学的研究内容主要有两个方面：蛋白质组学的研究内容主要有两个方面：结构蛋白质组学结构蛋白质组学和和功能蛋白质组学功能蛋白质组学 结构蛋白质组学结构蛋白质组学(Structural proteomics)主要是蛋白主要是蛋白质表达模式的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及质表达模式的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析、种类分析及数量确定；空间结构的解析、种类分析及数量确定；功能蛋白质组学功能蛋白质组学(functional proteomics)主要是蛋白质主要是蛋白质功能模式的研究，功能模式的研究，包括蛋白质的功能及蛋白质间包括蛋白质的功能及蛋白质间的相互作用。的相互作用。第五页，本课件共有47页蛋白质的各级结构第六页，本课件共有47页0.50nm0.54nm氢键-碳原子侧链反平行俯视侧视第七页，本课件共有47页 所以，蛋白质组学研究是对不同时间和空间所以，蛋白质组学研究是对不同时间和空间发挥功能发挥功能的特定蛋白质的特定蛋白质群体的研究群体的研究,从蛋白质水平上探索蛋白从蛋白质水平上探索蛋白质质作用模式、功能机理、调节控制作用模式、功能机理、调节控制以及以及蛋白质群体内蛋白质群体内相互作用相互作用,为临床诊断、病理研究、药物筛选、新药开为临床诊断、病理研究、药物筛选、新药开发、新陈代谢途径研究等提供理论依据和基础发、新陈代谢途径研究等提供理论依据和基础.第八页，本课件共有47页三、蛋白质组研究的理论基础从从mRNA mRNA 表达水平并不能预测蛋白表达水平。表达水平并不能预测蛋白表达水平。用基因用基因表达连续分析法表达连续分析法(SAGE)(SAGE)研究对数生长期啤酒酵母的研究对数生长期啤酒酵母的80 80 个基因，结果没有发现翻译和转录丰度有明显相关；个基因，结果没有发现翻译和转录丰度有明显相关；对某些基因，相同的对某些基因，相同的mRNA mRNA 丰度翻译成蛋白的量的差丰度翻译成蛋白的量的差异可达异可达50 50 倍；而相等的蛋白量可由丰度相差倍；而相等的蛋白量可由丰度相差40 40 倍的倍的mRNA mRNA 转录而来。这说明转录和翻译水平对蛋白的含转录而来。这说明转录和翻译水平对蛋白的含量有几乎相同的重要性。量有几乎相同的重要性。第九页，本课件共有47页蛋白质的动态修饰和加工并非必须来自基因序列。蛋白质的动态修饰和加工并非必须来自基因序列。蛋白质在翻译后可有多种调节方式，如糖基化、磷酸化、蛋白质在翻译后可有多种调节方式，如糖基化、磷酸化、异戊二烯化、酰化作用等。此外，许多蛋白质只有与其异戊二烯化、酰化作用等。此外，许多蛋白质只有与其它分子结合后才有功能，这种修饰是动态的、可逆的。它分子结合后才有功能，这种修饰是动态的、可逆的。第十页，本课件共有47页蛋白质组动态地反映生物系统所处的状态。蛋白质组动态地反映生物系统所处的状态。细胞周细胞周期的特定时期、分化的不同阶段、对应的生长和营养状期的特定时期、分化的不同阶段、对应的生长和营养状况、温度、应激和病理状态等其相应的蛋白质组之间存况、温度、应激和病理状态等其相应的蛋白质组之间存在差异。对其中蛋白质合成、降解、加工、修饰的调控在差异。对其中蛋白质合成、降解、加工、修饰的调控过程过程,只有通过蛋白质的直接分析才能提示。只有通过蛋白质的直接分析才能提示。第十一页，本课件共有47页蛋白质组研究的理论基础DNAmRNA蛋白质转录翻译基因蛋白质细胞特异性基因表达生理状态温度应激状态培养条件药物作用数量有限结构相对稳定复杂性多变性直接反应生命现象复杂的调控第十二页，本课件共有47页四、蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式蛋白质组表达模式（expression profile）：研究蛋白质组的组成成分研究蛋白质组的组成成分 支支撑撑技技术术主主要要有有：双双向向凝凝胶胶电电泳泳(2D electrophoresis)、以以质质谱谱(mass spectrograph)为为代代表表的的蛋蛋白白质质鉴鉴定定技术技术,以及以及生物信息学生物信息学(Bioinformatics)分析。分析。第十三页，本课件共有47页Protein sampleImage analysisProtein in gelProtein on membraneProtein in solution2-D PAGEExcisionBlottingElutionPartial degradationPeptide mixtureMass of proteinN-terminalsequenceMSEdman degradation Peptide mass fingerprintPeptide sequence MS/MS dataDatabase searchingNovel or previously studied proteinCharacterization of post-translocation modifications蛋蛋 白白 质质 组组 的的 分分 析析 流流 程程第十四页，本课件共有47页（一）蛋白质组研究中的样品制备 通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。质组分析。也可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋也可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。白质分成不同部分，分别进行研究。样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。和检测灵敏度。第十五页，本课件共有47页样品预分级的主要方法样品预分级的主要方法蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等第十六页，本课件共有47页三三种种常常用用的的植植物物蛋蛋白白提提取取方方法法第十七页，本课件共有47页（二）蛋白质组研究中的样品分离双向凝胶电泳双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)，是目前蛋白质组研究中最有效的分析鉴定，是目前蛋白质组研究中最有效的分析鉴定技术之一。技术之一。由两相组成：由两相组成：第一相：等电聚焦凝胶电泳第一相：等电聚焦凝胶电泳 根据蛋白质电荷差异根据蛋白质电荷差异 第二相：第二相：SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 根据蛋白质分子量差异根据蛋白质分子量差异第十八页，本课件共有47页二维双向电泳(2D electrophoresis)基本原理第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF),再在第一向再在第一向垂直方向上进行第二向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。IEF-focused proteinsSDS-charged proteins in IPG stripSDS-charged proteinsresolved according to sizes in SDS-PAGE gel第十九页，本课件共有47页2-DE原理示意图第二十页，本课件共有47页2-DE分析的基本步骤蛋白质溶解变性还原去除蛋白质杂志利用不同pK固定化电解质可配置不同pH范围的凝胶或利用商业化软件设计 第一相电泳：IPGIFE平衡 第二相电泳：SDSPAGE考马斯亮蓝染色、银染色、铜染色样品制备IPG胶制备双相电泳 染色第二十一页，本课件共有47页2-DE的操作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE SDS polyacrylamide gel electrophoresisSDSSDS带负电荷，破坏蛋白质的氢键、带负电荷，破坏蛋白质的氢键、疏水键，使之形成单个亚基。疏水键，使之形成单个亚基。SDS-SDS-蛋白质复合物为雪茄形的蛋白质复合物为雪茄形的长椭长椭圆棒圆棒，消除或掩盖了不同种类蛋消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异白质间原有电荷的差异。SDSSDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中的蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移迁移率只是蛋白质分子量的函数率只是蛋白质分子量的函数有关有关。第二十二页，本课件共有47页 制胶：制胶：试剂试剂 分离胶（分离胶（ml）浓缩胶（浓缩胶（ml）1.5M Tris-HCl （pH 8.9）2.50 30%单体单体 3.50 1.00 10%SDS 0.10 0.10 蒸馏水蒸馏水 3.84 6.340.5M Tris-HCl （pH 6.8）2.5010%过硫酸铵过硫酸铵AP 0.05 0.05四甲基乙二胺四甲基乙二胺TEMED 0.01 0.01第二十三页，本课件共有47页 样品处理：样品处理：Loading buffer40%甘油甘油溴酚兰溴酚兰SDS-巯基乙醇巯基乙醇0.5M Tris-HCl（pH 6.8）50ul样品样品50ul(2)Loading buffer Mix950C/5min 第二十四页，本课件共有47页电泳槽电泳槽上电极缓冲液上电极缓冲液下电极缓冲液下电极缓冲液样品槽样品槽上样器上样器阴极阴极阳极阳极电泳电泳方向方向聚丙烯酰胺凝胶板聚丙烯酰胺凝胶板第二十五页，本课件共有47页第二十六页，本课件共有47页蛋白质点的染色蛋白质点的染色凝胶上的蛋白质点染色常用方法有银染法、考马斯凝胶上的蛋白质点染色常用方法有银染法、考马斯亮蓝染色法亮蓝染色法,另外还采用以下染色试剂另外还采用以下染色试剂:丽春红丽春红S S、氨基黑、印度墨、氨基黑、印度墨、3535S S 硫脲银、胶态金、咪唑锌等硫脲银、胶态金、咪唑锌等.银染法广泛用于双向凝胶电泳分离后蛋白质点的染色银染法广泛用于双向凝胶电泳分离后蛋白质点的染色,该法灵敏度为该法灵敏度为4 ng,4 ng,但对质谱测定有干扰但对质谱测定有干扰,必须必须先脱银先脱银.考马斯亮蓝染色法可用于胶上或膜上蛋白质点染色考马斯亮蓝染色法可用于胶上或膜上蛋白质点染色,该法操作方便、重现性好该法操作方便、重现性好,同银染法一样同银染法一样,质谱测质谱测定时也必须先脱色定时也必须先脱色.第二十七页，本课件共有47页2-DE2-DE图像分析技术图像分析技术通过通过2-DE2-DE得到的蛋白质分离图谱，需要经过摄像或得到的蛋白质分离图谱，需要经过摄像或扫描转换为以像素为基础的、具有不同灰度强弱和扫描转换为以像素为基础的、具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点电脑信号。一定边界方向的斑点电脑信号。2-DE获得的蛋白质图谱第二十八页，本课件共有47页图像采集斑点检测背景消减获得蛋白质相关信息图像内及图像间的比较2-DE2-DE图像分析软件包操作过程：图像分析软件包操作过程：第二十九页，本课件共有47页2-DE2-DE技术的优缺点技术的优缺点 优点：可以同时直观显示数千个蛋白质点；优点：可以同时直观显示数千个蛋白质点；缺点：缺点：极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离；难于有效分离；胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化；胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化；丙烯酰胺有神经毒作用。丙烯酰胺有神经毒作用。第三十页，本课件共有47页新型非凝胶技术新型非凝胶技术液相色谱法液相色谱法(liquid chromatography，LC)毛细管电泳毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)液质联用技术（液质联用技术（LC-MS/MS）蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替2-DE的分的分离，然后进入离，然后进入MS系统获得肽段分子量，再通过串联系统获得肽段分子量，再通过串联MS技术，得技术，得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。多维色谱技术（多维色谱技术（LC/LC-MS/MS）多维蛋白质鉴定技术多维蛋白质鉴定技术第三十一页，本课件共有47页（三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定（三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定传统方法：蛋白质微量测序传统方法：蛋白质微量测序 氨基酸组成分析氨基酸组成分析 新型蛋白质鉴定技术新型蛋白质鉴定技术 质谱（质谱（MSMS）法）法 基本原理基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/zm/z）的差异来分离并确定样品的分子量。）的差异来分离并确定样品的分子量。第三十二页，本课件共有47页主要质谱类型主要质谱类型基质辅助激光解吸基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）电喷雾质谱（电喷雾质谱（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）质谱分析目前是经质谱分析目前是经2D-PAGE 分离的蛋白质鉴定的核分离的蛋白质鉴定的核心技术心技术第三十三页，本课件共有47页第三十四页，本课件共有47页第三十五页，本课件共有47页（四）蛋白质组学研究的生物信息学（四）蛋白质组学研究的生物信息学2D-PAGE分离的蛋白质经过识别与鉴定后，用图像分离的蛋白质经过识别与鉴定后，用图像扫描仪数字化扫描仪数字化2D-PAGE 胶上分离的蛋白质，在蛋白胶上分离的蛋白质，在蛋白图形工作站上，应用软件，对数字化的蛋白点的分布部图形工作站上，应用软件，对数字化的蛋白点的分布部位，斑点面积和灰阶、背景过滤、位，斑点面积和灰阶、背景过滤、2-DE 匹配与比较，匹配与比较，建立参考图谱；建立参考图谱；对蛋白质鉴定的数据库的搜索是蛋白质组信息学对蛋白质鉴定的数据库的搜索是蛋白质组信息学的一大特点；的一大特点；第三十六页，本课件共有47页当用当用2D-PAGE 分离一个蛋白质组后分离一个蛋白质组后,应用质谱技应用质谱技术测定能够刻划蛋白质属性的各种属性参数术测定能够刻划蛋白质属性的各种属性参数(attribute parameter),同时把已有数据库同时把已有数据库(如如OWL 或或dbEST)中的每一个序列转换成相应属性参数中的每一个序列转换成相应属性参数,形成形成属性化的数据库。然后以此属性参数属性化的数据库。然后以此属性参数,形成属性化的蛋形成属性化的蛋白质或核酸数据库。若搜索不到白质或核酸数据库。若搜索不到,那可能是新的蛋白质那可能是新的蛋白质,就须采用传统的生化鉴定。就须采用传统的生化鉴定。第三十七页，本课件共有47页蛋白质数据库蛋白质数据库（一）蛋白质序列数据库（一）蛋白质序列数据库（二）蛋白质结构数据库（二）蛋白质结构数据库（三）蛋白质直系同源簇数据库（三）蛋白质直系同源簇数据库（四）（四）DIPDIP数据库数据库瑞士的瑞士的SWISS-PROTSWISS-PROT拥有目前世界上最大、种类最多的拥有目前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据库蛋白质组数据库目前应用最普遍的数据库是目前应用最普遍的数据库是NRDB NRDB 和和dbESTdbEST数据库数据库蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础 第三十八页，本课件共有47页蛋白质数据库的应用蛋白质数据库的应用（一）序列比较（一）序列比较 序列两两对比序列两两对比 多序列对比多序列对比（二）临床诊断（二）临床诊断（三）肿瘤治疗药物的开发（三）肿瘤治疗药物的开发 第三十九页，本课件共有47页第四十页，本课件共有47页五、蛋白质组功能模式的研究方法（一）蛋白质翻译后修饰的研究（一）蛋白质翻译后修饰的研究（二）蛋白质相互作用研究技术（二）蛋白质相互作用研究技术蛋白质蛋白质蛋白质核酸间相互作用研究第四十一页，本课件共有47页蛋白质蛋白质-蛋白质相互作用的形式蛋白质相互作用的形式 1 1、蛋白质亚基的聚合、蛋白质亚基的聚合 2 2、交叉聚合、交叉聚合 3 3、分子识别、分子识别 4 4、分子的自我装配、分子的自我装配 5 5、多酶复合体、多酶复合体第四十二页，本课件共有47页蛋白质之间的相互作用力蛋白质之间的相互作用力 离子键 疏水键 二硫键 氢 键 范德华力 第四十三页，本课件共有47页蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用研究技术 蛋白质亲和层析 亲和印迹 免疫沉淀 交联 酵母双杂交 噬菌体展示 生物传感芯片质谱 蛋白质工程中的定点诱变技术 研究方法传统技术新技术第四十四页，本课件共有47页蛋白质蛋白质-核酸相互作用的研究技术核酸相互作用的研究技术（一）凝胶滞后试验（一）凝胶滞后试验（二）滤膜结合（二）滤膜结合（三）甲基化干扰（三）甲基化干扰（四）（四）DNaseDNase足纹足纹（五）核酸（五）核酸-蛋白质杂交蛋白质杂交第四十五页，本课件共有47页 谢谢大家！谢谢大家！第四十六页，本课件共有47页感感谢谢大大家家观观看看第四十七页，本课件共有47页