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遗传工程动物遗传工程动物PPTPPT课课件件第一节 概述第二节 转基因动物技术的发展概况第三节 遗传工程动物的制备方法第四节 遗传工程动物的建系和保种第五节 遗传工程动物的应用2第一节第一节 概概 述述 概念概念基因（基因（GeneGene）：）：位于染色体上具有遗传效应的位于染色体上具有遗传效应的DNADNA片断。片断。三类：三类：1.1.编码蛋白质：编码蛋白质：DNA mRNA Protein DNA mRNA Protein 2.2.编码编码RNARNA：DNA rRNA&tRNADNA rRNA&tRNA 3.3.调控序列调控序列基因组（基因组（GenomeGenome）：）：储存有生物体内全部遗传信息的全储存有生物体内全部遗传信息的全套染色体，称之为基因组。套染色体，称之为基因组。外源基因（外源基因（Foreign gene or TransgeneForeign gene or Transgene）：）：外来的、非外来的、非自身基因成分。自身基因成分。3基因型：基因型：生物所具有的基因成分，叫基因型（生物所具有的基因成分，叫基因型（Genotype)Genotype)表现型：表现型：生物所显示的遗传性状，叫表现型（生物所显示的遗传性状，叫表现型（Phenotype)Phenotype)纯合子：纯合子：一对等位基因彼此相同，叫纯合子（一对等位基因彼此相同，叫纯合子（Homozygote)Homozygote)杂合子：杂合子：一对等位基因彼此不同，叫杂合子（一对等位基因彼此不同，叫杂合子（Heterozygote)Heterozygote)半合子：半合子：一条染色体上增加了一个外源基因，叫半合子一条染色体上增加了一个外源基因，叫半合子（Semizygote)Semizygote)4外源基因构件（外源基因构件（constructconstruct）:将外源基因片段将外源基因片段通过分子生物学的方法组合起来，以达到设计通过分子生物学的方法组合起来，以达到设计的目的。这种重组的的目的。这种重组的DNADNA片段称为外源基因构片段称为外源基因构件。件。载体（载体（vectorvector）：）：带有宿主带有宿主DNADNA序列的外源基序列的外源基因构件称为载体。它起着将外源基因构件带到因构件称为载体。它起着将外源基因构件带到特定位置的作用。特定位置的作用。5遗传工程动物的定义遗传工程动物的定义 遗传工程动物（遗传工程动物（Genetically engineered Genetically engineered AnimalsAnimals）是指将外源基因或经改造的自身基因片）是指将外源基因或经改造的自身基因片段导入动物段导入动物受精卵或早期胚胎受精卵或早期胚胎，使之，使之稳定整合稳定整合于于宿主的染色体基因组内，并能遗传给后代的一类宿主的染色体基因组内，并能遗传给后代的一类动物。动物。遗传工程动物亦有称为遗传工程动物亦有称为基因修饰动物（基因修饰动物（Gene Gene modified animals)modified animals)。遗传工程动物包括所有用遗传工程技术制备遗传工程动物包括所有用遗传工程技术制备的动物，但有时人们常把的动物，但有时人们常把“转基因动物转基因动物”泛指为泛指为“遗传工程动物遗传工程动物”。狭义的转基因动物狭义的转基因动物一般仅指一般仅指用用显微注射法和逆转录病毒法显微注射法和逆转录病毒法制备的，即制备的，即“加入加入”一个外源基因的动物。一个外源基因的动物。6遗传工程动物的分类遗传工程动物的分类遗传工程动物的分类遗传工程动物的分类n转基因动物（转基因动物（Transgenic animals)Transgenic animals)：加入一个外源基因加入一个外源基因n基因敲除动物基因敲除动物(Gene knockout animals)(Gene knockout animals)：使一个基因功能失活使一个基因功能失活n基因敲入动物基因敲入动物(Gene knockin animals)(Gene knockin animals)：加入或替换一个基因加入或替换一个基因n染色体工程动物染色体工程动物(Chromosome engineered animals)(Chromosome engineered animals)：使染色体片断缺失、易位、倒置、使染色体片断缺失、易位、倒置、重复重复7转基因和基因敲除转基因和基因敲除疾病相关或功能未知基因疾病相关或功能未知基因疾病相关或功能未知基因疾病相关或功能未知基因功能获得功能获得功能获得功能获得“加法加法加法加法”“减法减法减法减法”功能缺失功能缺失功能缺失功能缺失?8n19801980年，年，GordonGordon等把等把HSV-tkHSV-tk的基因显微注射到小的基因显微注射到小鼠受精卵的原核中，获得了两只转基因小鼠，创鼠受精卵的原核中，获得了两只转基因小鼠，创建了显微注射转基因方法。建了显微注射转基因方法。n19821982年年PalmiterPalmiter等将大鼠的生长素基因和牛的生等将大鼠的生长素基因和牛的生长素基因分别注射到小白鼠的受精卵中，得到了长素基因分别注射到小白鼠的受精卵中，得到了体型巨大的体型巨大的“超级小鼠超级小鼠”。第二节第二节 遗传工程动物技术的发展概况遗传工程动物技术的发展概况919851985年年SmithiesSmithies等首先在等首先在球蛋白位点上进行基因打靶，球蛋白位点上进行基因打靶，获得基因敲除小鼠。获得基因敲除小鼠。19871987年英国年英国RoslinRoslin研究所研制成功研究所研制成功-抗胰蛋白酶转基因绵抗胰蛋白酶转基因绵羊，乳汁中分泌羊，乳汁中分泌-抗胰蛋白酶含量高达抗胰蛋白酶含量高达30mg/L30mg/L。19951995年年Ramirez-SolisRamirez-Solis等首先制作成功染色体重排小鼠。等首先制作成功染色体重排小鼠。20002000年年McCreathMcCreath等用体细胞基因打靶获得转基因绵羊，等用体细胞基因打靶获得转基因绵羊，乳乳汁中分泌汁中分泌-抗胰蛋白酶含量高达抗胰蛋白酶含量高达650ug ml650ug ml。19941994年年KimKim等发明锌指核酶（等发明锌指核酶（Zinc-finger nucleasesZinc-finger nucleases，ZFNZFN）技术，已经被成功用于好几个不同的系统，如小鼠细胞、）技术，已经被成功用于好几个不同的系统，如小鼠细胞、人类细胞、斑马鱼、植物、果蝇、大鼠等进行基因敲除。人类细胞、斑马鱼、植物、果蝇、大鼠等进行基因敲除。10一、用显微注射法制备转基因动物一、用显微注射法制备转基因动物（一）原理（一）原理 将带有完整序列的外源基因构件通过显微注将带有完整序列的外源基因构件通过显微注射注入到射注入到受精卵的雄性原核受精卵的雄性原核中，外源基因中，外源基因随机插随机插入并整合入并整合到染色体上的任意序列中。将显微注射到染色体上的任意序列中。将显微注射后的受精卵经体外培养，移植到后的受精卵经体外培养，移植到假孕动物假孕动物的输卵的输卵管内。子代出生后用分子生物学方法鉴定，确认管内。子代出生后用分子生物学方法鉴定，确认整合有外源基因的动物即为转基因动物。整合有外源基因的动物即为转基因动物。第三节第三节 遗传工程动物的制备方法遗传工程动物的制备方法11（二）步骤（二）步骤1.1.制备外源目的基因构件制备外源目的基因构件外源基因构件必须包括：启动子、外源基因编码区、外源基因构件必须包括：启动子、外源基因编码区、Poly APoly A（终止）信号（终止）信号启动子的组织特异性决定了外源基因表达的时空特异性启动子的组织特异性决定了外源基因表达的时空特异性：启动子启动子表达的组织表达的组织CMVCMV各种组织各种组织WAPWAP乳腺乳腺-Lactoglobulin-Lactoglobulin乳腺乳腺Albumin enhancerAlbumin enhancer肝脏肝脏 myosin heavy chain myosin heavy chain心脏心脏12用内切酶将基因片段切下来备用132.动物的准备动物的准备1）供受精卵雌鼠：）供受精卵雌鼠：提供受精卵用于显微注射提供受精卵用于显微注射2）正常雄鼠：）正常雄鼠：与供受精卵雌鼠交配产生受精卵与供受精卵雌鼠交配产生受精卵3）受体（假孕）雌鼠：）受体（假孕）雌鼠：显微注射后胚胎的移植显微注射后胚胎的移植受体。为了使子宫内膜变化与胚胎着床同步，受体。为了使子宫内膜变化与胚胎着床同步，需要与结扎雄鼠交配需要与结扎雄鼠交配4）结扎雄鼠：）结扎雄鼠：因输精管结扎，不会排精。与雌因输精管结扎，不会排精。与雌鼠交配，产生受体（假孕）雌鼠，不会受孕，鼠交配，产生受体（假孕）雌鼠，不会受孕，但可使雌鼠黄体活化，维持妊娠状态。但可使雌鼠黄体活化，维持妊娠状态。14鼠鼠 类类供受精卵鼠供受精卵鼠正正 常常 雄雄 鼠鼠受体雌鼠受体雌鼠结扎雄鼠结扎雄鼠鼠鼠 龄龄4 46 6周周8 8周周8 8周周8 8周周体体 重重1515克克2222克克2525克克2525克克作作 用用受精卵供体受精卵供体与供体雌鼠交配与供体雌鼠交配注射卵移植受体注射卵移植受体与受体雌鼠交配与受体雌鼠交配更换频率更换频率每每 次次一般一般6 68 8个月个月每每 次次一般一般6 68 8个月个月饲饲 养养每笼每笼3 35 5只只每笼每笼1 1只只1 13 3只与结扎雄鼠只与结扎雄鼠合笼合笼每笼每笼1 1只只备备 注注产过仔的较好产过仔的较好结扎后两周用结扎后两周用转基因实验需用的各类小鼠转基因实验需用的各类小鼠 153.显微注射法制备转基因动物步骤显微注射法制备转基因动物步骤 外源基因外源基因鉴定方法：鉴定方法：PCRPCRSouthernSouthern结扎公鼠扎公鼠成年雌鼠成年雌鼠假孕雌鼠假孕雌鼠DNA构件构件16超数排卵雌鼠超数排卵雌鼠 1010只只有阴栓雌鼠数有阴栓雌鼠数 6 68 8只只获得的受精卵数获得的受精卵数 200200300300个个可注射的雄性原核卵数可注射的雄性原核卵数 150150250250个个显微注射后存活的卵数显微注射后存活的卵数 100100200200个个每个受体移卵数每个受体移卵数 20204040个个受体数受体数 3 36 6只只超数排卵与转基因实验超数排卵与转基因实验超数排卵与转基因实验超数排卵与转基因实验 17显微注射法制备显微注射法制备显微注射法制备显微注射法制备转基因动物转基因动物转基因动物转基因动物18显微注射法的优缺点显微注射法的优缺点优点：优点：方法经典，简便、可靠方法经典，简便、可靠缺点：缺点：显微注射的整合率低，只有显微注射的整合率低，只有5%5%。只能加入基因，不能剔除或原位修饰。只能加入基因，不能剔除或原位修饰。整整合合是是随随机机的的，由由于于插插入入位位点点的的关关系系，转转基基因因表表达达有有不不确确定定性性，有有的高，有的低。的高，有的低。由由于于是是随随机机整整合合，可可能能破破坏坏重重要要的的内内源源性性DNADNA序序列列或或激激活活细细胞胞的的致致癌基因。癌基因。用用原原核核显显微微注注射射产产生生的的转转基基因因动动物物常常常常是是嵌嵌合合体体，即即并并不不是是所所有有细细胞都整合有外源基因。胞都整合有外源基因。不能在胚胎早期确定性别。不能在胚胎早期确定性别。19二、逆转录病毒法制备转基因动物二、逆转录病毒法制备转基因动物（一）原（一）原 理理 逆转录病毒是一类具有逆转录酶的逆转录病毒是一类具有逆转录酶的RNARNA病毒，能病毒，能将病毒将病毒RNARNA逆转录成双链逆转录成双链DNADNA，进而整合到细胞染色，进而整合到细胞染色体体DNADNA中。利用这个特点，可将逆转录病毒改造成中。利用这个特点，可将逆转录病毒改造成外源基因表达载体，用于外源基因表达载体，用于基因治疗基因治疗研究和研究和转基因动转基因动物的制备物的制备。逆转录病毒科有三个亚科：逆转录病毒科有三个亚科：RNARNA肿瘤病毒亚科肿瘤病毒亚科 慢病毒亚科慢病毒亚科 泡沫病毒亚科泡沫病毒亚科20逆逆转录病毒病毒结构构LTR:LTR:Long terminal repeatLong terminal repeat，在在5 5末端具有启动子末端具有启动子/调控序列作用，调控序列作用，在在3 3末端具有末端具有poly Apoly A信号作用。信号作用。+：病毒包装信号，具有指导病病毒包装信号，具有指导病毒毒RNARNA包装成病毒颗粒功能。包装成病毒颗粒功能。GagGag：编码核衣壳、衣壳和基质的编码核衣壳、衣壳和基质的功能。功能。polpol：编码整合酶和逆转录酶。编码整合酶和逆转录酶。envenv：编码包膜表面糖蛋白和转膜编码包膜表面糖蛋白和转膜蛋白。蛋白。dsDNAmRNAProtein生物的正常生物的正常遗传信息流信息流21（二）用逆转录病毒法制备转基因动物基本步骤（二）用逆转录病毒法制备转基因动物基本步骤（二）用逆转录病毒法制备转基因动物基本步骤（二）用逆转录病毒法制备转基因动物基本步骤构建病毒构建病毒载体体转染包装染包装细胞胞收集病毒收集病毒颗粒粒感染受精卵感染受精卵胚胎移植胚胎移植表达gag,pol,env 细胞22逆转录病毒法制备转基因动物的优缺点逆转录病毒法制备转基因动物的优缺点 优点优点转基因效率高转基因效率高单位点、单拷贝整合单位点、单拷贝整合 缺点缺点随机整合随机整合携带外源携带外源DNADNA片段大小受限，一般小于片段大小受限，一般小于10kb10kb易产生嵌合体（易产生嵌合体（mosaic)mosaic)23三、三、ESES细胞法介导基因敲除小鼠的制备细胞法介导基因敲除小鼠的制备（一）原理（一）原理 将将ESES细胞在体外培养、扩增后，用经过改造的细胞在体外培养、扩增后，用经过改造的外源基因外源基因打靶载体导入打靶载体导入ESES细胞内细胞内，在细胞水平，在细胞水平用正负筛选法用正负筛选法筛选外源筛选外源基因定点整合的基因定点整合的ESES细胞株。将外源基因定点整合的细胞株。将外源基因定点整合的ESES细胞注细胞注入到囊胚期胚胎的囊胚腔内，在体外短暂培养后，移植到假入到囊胚期胚胎的囊胚腔内，在体外短暂培养后，移植到假孕小鼠的子宫内。出生的小鼠为孕小鼠的子宫内。出生的小鼠为ESES细胞来源品系和囊胚供体细胞来源品系和囊胚供体品系之间的嵌合体。品系之间的嵌合体。外源基因能否传给下一代取决于外源基因能否传给下一代取决于ESES细胞在嵌合体动物中细胞在嵌合体动物中的嵌合程度，嵌合程度越高，的嵌合程度，嵌合程度越高，ESES细胞在嵌合体动物中分化成细胞在嵌合体动物中分化成生殖细胞的可能性就越大。生殖细胞的可能性就越大。241.1.基因打靶载体的构建基因打靶载体的构建基因打靶载体的构建基因打靶载体的构建1 1）载体的两端有同源臂；）载体的两端有同源臂；2 2）外源基因；）外源基因；3 3）要有正负筛选基因）要有正负筛选基因 正筛选：正筛选：NeoNeor r基因（用基因（用G418G418筛选，杀死未整合筛选，杀死未整合的细胞）的细胞）负筛选：负筛选：tktk基因（用基因（用GancGanc筛选，杀死随机整筛选，杀死随机整合的细胞）合的细胞）tktk5同源臂3同源臂Neor图11-2 打靶载体的构建示意图25同源臂同源臂外源基因Tk基因定点整合定点整合随机插入随机插入ES细胞胞正常细胞正常细胞G418+Ganc培养培养液液2.将打靶载体导入将打靶载体导入ES细胞内细胞内26正负筛选出来的正负筛选出来的ESES细胞是否是我们想要的定点整细胞是否是我们想要的定点整合细胞，需要用分子生物学试验进行鉴定。合细胞，需要用分子生物学试验进行鉴定。Southern blotSouthern blot试验试验PCRPCR273.3.3.3.用用用用ESESESES细胞介导法制作基因敲除小鼠细胞介导法制作基因敲除小鼠细胞介导法制作基因敲除小鼠细胞介导法制作基因敲除小鼠PCRSouthern结扎公鼠扎公鼠成年雌鼠成年雌鼠假孕雌鼠假孕雌鼠导入基因入基因的的ES细胞胞28将经筛选的外源基因定点整合将经筛选的外源基因定点整合的的ESES细胞注射到囊胚内细胞注射到囊胚内294.基因敲除小鼠的建系基因敲除小鼠的建系嵌合体嵌合体野生型野生型杂合子杂合子杂合子杂合子1/41/4纯合子纯合子30由于常规的由于常规的ESES细胞细胞注入到注入到2 2倍体囊胚获得倍体囊胚获得ESES细胞细胞遗传背景遗传背景的子代需要经过嵌合体阶段，使得研究成本昂贵，研发周的子代需要经过嵌合体阶段，使得研究成本昂贵，研发周期长。近年来发展的期长。近年来发展的四倍体补偿技术四倍体补偿技术可以绕过嵌合体小鼠可以绕过嵌合体小鼠阶段，直接获得阶段，直接获得ESES细胞细胞遗传背景的小鼠。遗传背景的小鼠。其方法是：将受体其方法是：将受体2 2细胞胚胎用电融合方法获得四倍体胚细胞胚胎用电融合方法获得四倍体胚胎。培养到囊胚阶段后，将胎。培养到囊胚阶段后，将ESES细胞细胞注射到囊胚内，经短暂注射到囊胚内，经短暂体外培养后将它移植于假孕第体外培养后将它移植于假孕第2 2天小鼠的子宫中。出生的天小鼠的子宫中。出生的子代全都是子代全都是ESES细胞细胞遗传背景。遗传背景。其基本原理是四倍体胚胎具其基本原理是四倍体胚胎具有明显的胚外组织限制性分布，基本不参与胎儿及胚外中有明显的胚外组织限制性分布，基本不参与胎儿及胚外中胚层组织的发育胚层组织的发育。四倍体补偿技术能显著缩短基因修饰小鼠的研发，直接得四倍体补偿技术能显著缩短基因修饰小鼠的研发，直接得到近交遗传背景动物，大大降低了研发成本，具有明显的到近交遗传背景动物，大大降低了研发成本，具有明显的技术优势。技术优势。31传统技术最新四倍体补偿技术2细胞胚胎四倍体胚胎发育到囊胚囊胚内注入突变ES细胞胚胎移植ES细胞遗传背景杂合子电融合确定交配3.5天取囊胚囊胚内注入突变ES细胞胚胎移植ES细胞和囊胚来源的嵌合体嵌合体野生型杂合子32ESES细胞介导的转基因优缺点细胞介导的转基因优缺点优点优点能在细胞水平进行筛选。能在细胞水平进行筛选。能能加加入入、剔剔除除或或替替换换某某个个基基因因，或或进进行行小小到到一一个个或或几个核苷酸修饰。几个核苷酸修饰。缺点缺点ESES细胞的培养条件苛刻、技术要求高，成本大。细胞的培养条件苛刻、技术要求高，成本大。不同不同ESES细胞株的生殖系传播能力差异很大。细胞株的生殖系传播能力差异很大。ESES介导的转基因需要经过嵌合体这一中间步骤。介导的转基因需要经过嵌合体这一中间步骤。33第四节第四节 遗传工程动物的建系和保种遗传工程动物的建系和保种一、遗传工程小鼠的建系过程中的交配方式遗传工程小鼠建系的目的是使外源基因能够稳定地遗传给后代。转基因小鼠导入的外源基因可以在半合子状态表达，但表达的程度因整合位点的不同有所差异。由于用显微注射法和逆转录病毒制备的转基因都是随机整合的，用同一基因构件获得的数个转基因G0代小鼠可能整合位点各不相同，且有可能多位点整合，因此G0代小鼠应该单独与该品系野生型进行交配，而不应在不同G0代小鼠之间交配。34基因敲除小鼠由于在ES细胞内用同源重组方法一般仅灭活一个位点，根据孟德尔的遗传法则，同源染色体的一对等位基因中一个位点发生灭活，其基因功能由等位基因的另一个位点代替，从而不表现任何突变的形状。只有当一对等位基因的两个位点都灭活，即纯合子，才表现出基因敲除的性状。纯合子小鼠即是我们所希望得到的基因敲除小鼠。目前用的ES细胞大多来自129品系，其嵌合体一般与野生型C57BL/6回交。经过6代回交后，其遗传背景将是C57BL/6了。此时任何遗传背景对基因表达的影响将可通过与正常C57BL/6小鼠的比较而得到控制。35二、遗传工程小鼠品系的维持二、遗传工程小鼠品系的维持遗传工程小鼠品系是以半（杂）合子状态还是以纯合子状态维持好呢？从理论上讲以纯合子状态饲养繁殖最理想，因为建立了纯合子品系就能稳定遗传，不必每一代都进行基因型检测。但由于转基因小鼠的外源基因有可能是多位点整合的，要建立纯合子品系就必须对多位点整合的G0代小鼠的每个整合位点进行分离，形成单位点稳定遗传纯合子品系。在下列情况下必须以杂合子状态维持：所研究的靶基因突变是致死的，纯合子可能在胚胎期或出生后早期死亡，或性成熟前死亡；纯合子小鼠不育。此时需要对每一代的所有子代进行检测来确定基因型，因而工作量较大。应用条件性基因打靶技术是避免致死性突变的最有效途径。36转转基基因因动动物物杂杂合合子子保保种种方方法法G0代代整合整合检测+：杂合子：杂合子外源基因外源基因检测野生型野生型+：杂合子：杂合子野生型野生型+：杂合子：杂合子野生型野生型未整合：弃去未整合：弃去+：杂合子：杂合子野生型野生型+：杂合子：杂合子野生型野生型用于实验外源基因外源基因检测外源基因外源基因检测外源基因外源基因检测外源基因外源基因检测37G0代代整合整合检测-：弃去：弃去+：杂合子合子野生型野生型G1代代-：弃去：弃去+：杂合子合子杂合子合子-：弃去：弃去+：纯合子合子G2代代基因型、基因型、表型表型检测纯合子繁殖纯合子繁殖遗遗传传工工程程动动物物建建系系和和纯纯合合子子保保种种方方法法3839第五节第五节 遗传工程动物的应用遗传工程动物的应用1.1.生物医学领域里的基础性研究生物医学领域里的基础性研究2.2.医学研究医学研究3.3.人类疾病的动物模型人类疾病的动物模型4.4.基因治疗模型基因治疗模型3.3.畜牧业上品种的改良畜牧业上品种的改良4.4.乳腺生物反应器乳腺生物反应器5.5.异种器官移植供体异种器官移植供体40遗传工程小鼠在生物医学研究中的遗传工程小鼠在生物医学研究中的应用例子介绍应用例子介绍41骨髓间充质干细胞（骨髓间充质干细胞（MSCsMSCs）具有多分化潜能，在不同调控因子作用下）具有多分化潜能，在不同调控因子作用下可以向成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、神经胶质细胞、可以向成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞等方向分化。血管内皮细胞等方向分化。Cbfa1Cbfa1可于转录水平使可于转录水平使MSCsMSCs定向分化为成定向分化为成骨细胞，也可使软骨细胞肥大化，进而促进软骨内化骨骨细胞，也可使软骨细胞肥大化，进而促进软骨内化骨.小鼠成骨细胞特异过表达小鼠成骨细胞特异过表达小鼠成骨细胞特异过表达小鼠成骨细胞特异过表达Cbfa1Cbfa1Cbfa1Cbfa1导致骨基质形成减少，出现骨质疏松，导致骨基质形成减少，出现骨质疏松，导致骨基质形成减少，出现骨质疏松，导致骨基质形成减少，出现骨质疏松，表明表明表明表明Cbfa1Cbfa1Cbfa1Cbfa1在骨发育后的骨形成过程中也起作用。在骨发育后的骨形成过程中也起作用。在骨发育后的骨形成过程中也起作用。在骨发育后的骨形成过程中也起作用。Cbfa1Cbfa1转基因小鼠转基因小鼠42Plag1Plag1PLAG1PLAG1TransgeneTransgene18S18SPLAG1PLAG1TransgeneTransgene18S18SHeartHeartLiverLiverSpleen Spleen LungLungKidneyKidneyBrain Brain S.IntetineS.IntetineS.MuscleS.MuscleSa.GlandSa.GlandTestesTestesEpididymisEpididymisSe.GlandSe.GlandM.GlandM.Gland人多形性腺瘤基因（人多形性腺瘤基因（人多形性腺瘤基因（人多形性腺瘤基因（PLAG1PLAG1PLAG1PLAG1）的转基因小鼠产生）的转基因小鼠产生）的转基因小鼠产生）的转基因小鼠产生自发多形性腺瘤自发多形性腺瘤自发多形性腺瘤自发多形性腺瘤International Journal of Cancer 2006;118(3):643-648.International Journal of Cancer 2006;118(3):643-648.PLAG1PLAG1编码一种发育相关的转录因子编码一种发育相关的转录因子,体外研究表明其异位表达往唾液腺多体外研究表明其异位表达往唾液腺多形性腺瘤的发生起重要作用。形性腺瘤的发生起重要作用。43OPGOPGOPGOPG（骨保护素骨保护素）基因剔除小鼠发生骨质疏松）基因剔除小鼠发生骨质疏松）基因剔除小鼠发生骨质疏松）基因剔除小鼠发生骨质疏松Progress in Biochemistry and Biophysics 2007,34(3):260-266.+/+/-/-+/+/-/-骨保护素（骨保护素（OPGOPG）是近年发现的一种抑制破骨细胞生成的蛋白质，）是近年发现的一种抑制破骨细胞生成的蛋白质，具有潜在的抗骨质疏松作用。骨保护素缺失小鼠出现严重的骨质疏松具有潜在的抗骨质疏松作用。骨保护素缺失小鼠出现严重的骨质疏松症，骨密度减低，破骨细胞数量明显增加，骨转换率加快，症，骨密度减低，破骨细胞数量明显增加，骨转换率加快，44Rig-IRig-IRig-IRig-I基因剔除导致小鼠抗细菌免疫功能障碍基因剔除导致小鼠抗细菌免疫功能障碍基因剔除导致小鼠抗细菌免疫功能障碍基因剔除导致小鼠抗细菌免疫功能障碍Genotypewt+/-/-Sextotaltotaltotaln494897395190395089Eye infection000000101525%00000025.63028.1Skin infection101011437%20101.91.110.367.8 RIG-RIG-基因与基因与B B细胞发育有关，细胞发育有关，RIG-RIG-基因缺失小鼠存在免疫缺陷，基因缺失小鼠存在免疫缺陷，表现为骨髓和脾脏中表现为骨髓和脾脏中B B细胞的发育存在成熟障碍，机体细胞的发育存在成熟障碍，机体IgG3IgG3抗体的产生或抗体的产生或与此有关的类别转换出现问题，导致了该类小鼠对细菌易感，从而证明与此有关的类别转换出现问题，导致了该类小鼠对细菌易感，从而证明RIG-RIG-基因在小鼠的免疫反应中具有不可或缺的重要作用。基因在小鼠的免疫反应中具有不可或缺的重要作用。45p=0.005p=0.01ABDC-/-Te -/-Epwt Te wt Epwt +/-/-wt +/-/-Newborn 8 wKif18aKif18a基因剔除小鼠发生雄性不育基因剔除小鼠发生雄性不育无精症小鼠模型无精症小鼠模型 Kif18aKif18a是是KinesinKinesin驱驱动蛋白超家族成员之动蛋白超家族成员之一，该基因随小鼠性一，该基因随小鼠性成熟在睾丸精原细胞成熟在睾丸精原细胞和精子细胞中特异性和精子细胞中特异性表达，参与精原细胞表达，参与精原细胞有丝分裂和减数分裂有丝分裂和减数分裂过程中的纺锤丝形成、过程中的纺锤丝形成、染色质的重排和分离，染色质的重排和分离，证明该基因产物在精证明该基因产物在精子发生过程中的关键子发生过程中的关键作用。该基因突变使作用。该基因突变使小鼠发生雄性不育、小鼠发生雄性不育、睾丸萎缩、精子发生睾丸萎缩、精子发生障碍。障碍。46复习题复习题思考题思考题1.1.什么叫遗传工程动物？试述遗传工程动物的分类。什么叫遗传工程动物？试述遗传工程动物的分类。2.2.试述显微注射法制备的转基因动物和基因敲除动物试述显微注射法制备的转基因动物和基因敲除动物在在DNADNA构件上的不同点构件上的不同点3.3.试述供受精卵雌鼠、正常雄鼠、受体（假孕试述供受精卵雌鼠、正常雄鼠、受体（假孕)雌鼠雌鼠和结扎雄鼠在遗传工程小鼠制作中的作用。和结扎雄鼠在遗传工程小鼠制作中的作用。4.4.以显微注射法为例，说明转基因小鼠的制作方法。以显微注射法为例，说明转基因小鼠的制作方法。5.5.试述逆转录病毒载体转基因的基本原理。试述逆转录病毒载体转基因的基本原理。6.6.试述基因敲除小鼠的制作方法。试述基因敲除小鼠的制作方法。47结束结束