上课----血红蛋白的提取和分离讲课教案.ppt

上课上课-血红蛋白的提取血红蛋白的提取和分离和分离蛋白质分离的原理：蛋白质分离的原理：根据蛋白质各种特性的差异，如分子的根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状形状和和大小大小、所带、所带电荷的性质和多少电荷的性质和多少、溶溶解度解度、吸附性质吸附性质和对其他分子的和对其他分子的亲和力亲和力等等等，可以用来分离等，可以用来分离不同种类不同种类的蛋白质。的蛋白质。一、基础知识一、基础知识凝胶色谱法凝胶色谱法（分配色谱法）（分配色谱法）1、概念：根据被分离物质（如蛋白质）、概念：根据被分离物质（如蛋白质）相对相对分子质量的大小分子质量的大小，利用具有，利用具有多孔网状结构多孔网状结构的的凝胶的分子筛作用，来进行分离。凝胶的分子筛作用，来进行分离。性质：微小的多孔球体性质：微小的多孔球体本质：多糖类化合物本质：多糖类化合物实例：葡聚糖、琼脂糖实例：葡聚糖、琼脂糖提取提取分离分离方法方法凝胶色谱法凝胶色谱法 凝胶电泳法凝胶电泳法 凝胶色谱法分离蛋白质凝胶色谱法分离蛋白质 （二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 能够抵制能够抵制外界的酸和碱外界的酸和碱对溶液对溶液PHPH值值的的影响，维持影响，维持PHPH基本基本不变。不变。1 1、作用、作用:2 2、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制:通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配制溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的而成。调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制就可以制得在得在不同不同PHPH范围内范围内使用的缓冲液。使用的缓冲液。（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液3 3、在本课题中使用的缓冲液是：在本课题中使用的缓冲液是：磷酸缓冲液磷酸缓冲液 成分：成分：NaH2PO4/Na2HPO4 （三）（三）电泳：电泳：1 1、概念：、概念：带电粒子在带电粒子在电场电场作用作用下发生迁移的过程。下发生迁移的过程。2 2、原理：、原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可可解离的基团解离的基团，在一定的，在一定的PHPH下，这些基团会下，这些基团会带带上正上正电电或或负负电。电。在在电场电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷荷相反相反的电极移动。的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的以及分子本身的大小，形状的不同大小，形状的不同，使带电分子产生，使带电分子产生不同的迁移速度不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离，从而实现样品中各种分子的分离。3 3、类型、类型:琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 在测定蛋白质分子量时常用在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS）聚聚丙烯酰胺凝胶电泳丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂联剂N,NN,N-亚甲基双丙烯酰胺在亚甲基双丙烯酰胺在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作用下聚的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。合交联成的具有三维网状结构的凝胶。N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂丙烯酰胺和交联剂 N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率迁移率取决于它所带取决于它所带净电荷的多少净电荷的多少以及分子以及分子的大小等因素。的大小等因素。SDSSDS能使蛋白质发生完全能使蛋白质发生完全变性变性。由几条肽链。由几条肽链组成的蛋白质复合体在组成的蛋白质复合体在SDSSDS的作用下会的作用下会解聚成单解聚成单条肽链条肽链，因此测定的结果只是，因此测定的结果只是单条肽链的分子量单条肽链的分子量。SDSSDS能与各种蛋白质形成能与各种蛋白质形成蛋白质蛋白质SDSSDS复合物复合物，SDSSDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有原有的电荷量的电荷量。因而掩盖了。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差不同种蛋白质间的电荷差别别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小使电泳迁移率完全取决于分子的大小。SDSSDS作用机理作用机理:实验操作步骤实验操作步骤1、样品处理样品处理2、粗分离、粗分离3、纯化、纯化4、纯度鉴定、纯度鉴定 水分水分 血浆血浆 固体物质固体物质血液血液 白细胞白细胞 血细胞血细胞 血小板血小板 红细胞红细胞 血红蛋白（血红蛋白（90）血液有哪些成分？血液有哪些成分？血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链两个两个两个两个一肽链一肽链一肽链一肽链四个亚铁四个亚铁四个亚铁四个亚铁血血红素基团红素基团红素基团红素基团每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此此基团可携带基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而呈而呈红色。红色。血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：1、红细胞的洗涤红细胞的洗涤2、血红蛋白的释放、血红蛋白的释放3、分离血红蛋白溶液、分离血红蛋白溶液4、透析、透析（一）样品处理（一）样品处理问题：问题：1、刚采集的血样要做、刚采集的血样要做怎样的处理？为什么？怎样的处理？为什么？加入抗凝血剂，加入抗凝血剂，防止血液凝固。防止血液凝固。2、怎样洗涤？、怎样洗涤？采样分离吸浆倒红加液搅拌重洗三次采样分离吸浆倒红加液搅拌重洗三次低速短时间离心低速短时间离心 生理盐水生理盐水1、红细胞的洗涤、红细胞的洗涤3、洗涤的目的是什么？、洗涤的目的是什么？去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。纯化。4、洗涤干净的标志是什么？、洗涤干净的标志是什么？直至上清液直至上清液不再呈现黄色不再呈现黄色，表明红细胞已洗，表明红细胞已洗涤干净。涤干净。1、红细胞的洗涤、红细胞的洗涤2、血红蛋白的释放、血红蛋白的释放问题：问题：加蒸馏水和甲苯的作用是什么？加蒸馏水和甲苯的作用是什么？使红细胞破裂，释放出血红蛋白。使红细胞破裂，释放出血红蛋白。有机溶剂有机溶剂（无色透明的甲苯层）（无色透明的甲苯层）脂类物质脂类物质（白色脂溶性物质沉淀层）（白色脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液血红蛋白溶液（红色透明液体）（红色透明液体）红细胞破碎物沉淀（红细胞破碎物沉淀（暗红色沉淀物）暗红色沉淀物）3、分离血红蛋白溶液、分离血红蛋白溶液高速离心滤纸过滤漏斗分液高速离心滤纸过滤漏斗分液血红蛋白血红蛋白(4)(4)透透 析：析：过程：过程：取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透），透析析1212小时。小时。透析目的：透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。除去样品中分子量较小的杂质。2.2.凝胶色谱操作凝胶色谱操作:（1 1 1 1）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填凝胶的选择凝胶的选择：A A、材料：交联葡聚糖凝胶（、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75G-75）。）。B B、代表意义：、代表意义：“G G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围及分离范围。7575表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水时吸水7.57.5克。克。凝胶的前处理凝胶的前处理：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液、装填：将凝胶悬浮液一次性一次性缓慢倒入色谱柱内，缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：注意：1、凝胶装填时、凝胶装填时尽量紧密尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空，以降低凝胶颗粒之间的空隙。隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填 洗涤平衡洗涤平衡：注意：注意：1 1、液面不要低于凝胶、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。生物大分子物质的分离效果。2 2、不能发生洗脱液流干，露、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象出凝胶颗粒的现象。50cm50cm高高高高（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱 调节缓冲液面：调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。滴加透析样品：滴加透析样品：吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。同时注意不要破坏凝胶面。注意：注意：正确的加样操作是：正确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口关闭下端出口洗脱：洗脱：小心加入小心加入pH=7.0 的的20mmol/l的磷酸的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。下端出口进行洗脱。收集：收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）的移动，说明色谱柱制作成功）（三）（三）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。1.1.目的：目的：1.1.样品的处理样品的处理通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液离心等操作收集到血红蛋白溶液2.2.样品的粗分离样品的粗分离经过透析去除分子量较小的杂质经过透析去除分子量较小的杂质3.3.样品的纯化样品的纯化通过凝胶色谱法通过凝胶色谱法将相对分子质量较将相对分子质量较大的杂质蛋白除去大的杂质蛋白除去4.4.经经聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳进行进行纯度鉴定纯度鉴定。小结：小结：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见教科书（见教科书图图5-185-18），），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三、结果分析与评价三、结果分析与评价 1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？处理后的样品发生了哪些变化吗？2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得否装填得均匀均匀。此外，还可以加入大分子的有色物。此外，还可以加入大分子的有色物质，质，例如蓝色葡聚糖例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色观察色带移动的情况。如果带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整色带均匀、狭窄、平整，说明，说明凝胶色谱柱的性能良好。凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。新装柱。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。3 3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？效果？结束结束