现代分子生物学第二章.ppt

Chapter 2Structure and function of Nucleic AcidsContents2.1细胞的遗传物质细胞的遗传物质2.2核酸的化学组成与共价结构核酸的化学组成与共价结构2.3DNA的二级结构的二级结构2.4DNA的超螺旋结构的超螺旋结构2.5真核生物的染色体及其组装真核生物的染色体及其组装2.6RNA的结构和功能的结构和功能2.7核酸的性质核酸的性质2.8研究核酸的常用方法研究核酸的常用方法第一节第一节细胞的遗传物质细胞的遗传物质一、一、DNA是主要的遗传物质是主要的遗传物质1、In1869,Miescher：分离出核素：分离出核素2、In1930s,P.LeveneandW.JacobsRNA：核糖，碱基：核糖，碱基DNA：脱氧核糖，碱基：脱氧核糖，碱基3.In1928,FrederickGriffith：细菌的转化实验：细菌的转化实验光滑型（光滑型（S）肺炎双球菌可致小鼠死亡）肺炎双球菌可致小鼠死亡粗糙型（粗糙型（R）肺炎双球菌不会导致小鼠死亡）肺炎双球菌不会导致小鼠死亡加热杀死加热杀死S型，小鼠不会死亡型，小鼠不会死亡将将R型和加热杀死的型和加热杀死的S型混合后注射小型混合后注射小鼠，小鼠死亡。鼠，小鼠死亡。结果分析：结果分析：R型在转化过程中从杀死的型在转化过程中从杀死的S型获得了基型获得了基因（遗传物质）因（遗传物质）4、DNA是转化物质是转化物质In1944,OswaldAvery（1）将）将S型杀死后分别提取型杀死后分别提取多糖、脂类、多糖、脂类、RNA、蛋白质、蛋白质、DNA等分别加入等分别加入R菌中，菌中，仅加入仅加入DNA的发生了转化的发生了转化（2）向提取液加入胰蛋白酶或糜蛋白酶，转化）向提取液加入胰蛋白酶或糜蛋白酶，转化可发生可发生（3）向提取液加入）向提取液加入DNA酶，转化不能发生酶，转化不能发生（4）直接的理化分析）直接的理化分析超速离心（超速离心（Ultracentrifugation）转化的物质沉降的速度快转化的物质沉降的速度快电泳（电泳（Electrophoresis）转化物质移动的速度快转化物质移动的速度快紫外吸收紫外吸收转化物质在转化物质在260nm波长处有最大吸收峰波长处有最大吸收峰基本化学分析：基本化学分析：N/P比为比为1.67结论：结论：DNA是转化物质是转化物质n1950年，年，ChargaffDNA并不是四核苷酸的简单重复，并不是四核苷酸的简单重复，DNA碱基碱基组成在不同物种之间不同。组成在不同物种之间不同。nHotchkiss将转化物质纯化到只含将转化物质纯化到只含0.02%的蛋白的蛋白质，转化仍可发生。质，转化仍可发生。5、噬菌体侵染实验：、噬菌体侵染实验：1952年年,HersheyandChase二、二、RNA也是遗传物质也是遗传物质In1957,HeinzFraenkel-ConratandB.Singer：烟草花叶病毒重建实验烟草花叶病毒重建实验小结：小结：n基因由核酸组成，通常是基因由核酸组成，通常是DNA。n一些简单的遗传系统（如病毒）是一些简单的遗传系统（如病毒）是RNA。作为遗传物质的作为遗传物质的DNA具有以下特性：具有以下特性：贮存并表达遗传信息贮存并表达遗传信息能把遗传信息传递给子代能把遗传信息传递给子代物理和化学性质稳定物理和化学性质稳定有遗传变异的能力有遗传变异的能力第二节 核酸的化学组成与共价结构 一、核酸的化学组成核酸（Nuleic acid）核苷酸（Nucleotides）核苷（nucleosides）+磷酸(Phosphoric acid)戊糖(pentose)+碱基（Bases）（一）碱基（一）碱基（Bases）：嘧啶碱和嘌呤碱）：嘧啶碱和嘌呤碱（二）核苷（Nucleosides）糖与碱基之间以糖苷键相连 核糖核苷 脱氧核糖核苷（三）核苷酸（三）核苷酸（Nucleotides）二、核酸的共价结构（一）DNA的一级结构 DNA分子中的核苷酸序列3，5-磷酸二酯键5-末端:自由的磷酸基团3-末端:自由的羟基（二）RNA的一级结构无分支的多聚核糖核苷酸链4种核糖核苷酸：A、G、U、C核苷酸中的戊糖为核糖第三节 DNA的二级结构一、DNA双螺旋模型的诞生In 1951,Pauling:-螺旋Chargaff:A=T,G=CIn 1952,Franklin and Wilkins:清晰的X-射线衍射照片In 1953,Watson and Crick DNA double helix model二、双螺旋模型的特征1、主链：（1）DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链组成（2）两条主链围绕同一中心轴相互缠绕，形成双螺旋，螺旋方向为右手螺旋（3）糖-磷酸主链位于双螺旋的外侧，碱基位于双螺旋的内侧；（4）碱基对平面与螺旋轴垂直2、碱基配对3、螺旋参数：（1）每一圈螺旋含10个碱基对（2）双螺旋螺距为3.4nm，上下相邻碱基的垂直距离为0.34nm，交角为36（3）螺旋直径为2nm4、大沟和小沟大沟：宽1.2nm，深0.85nm，小沟：宽0.6nm，深0.75nm三、维持三、维持DNA双螺旋的作用力双螺旋的作用力1、氢键（Hydrogen bonding）2、碱基堆积力：堆积碱基间的疏水作用3、其他作用因素：（1）范德华力；（2）磷酸基的负电荷斥力四、四、DNA双螺旋的多种形式双螺旋的多种形式B-DNA:Watson-Crick模型模型A-DNA:在较低的湿度下形成；在较低的湿度下形成；RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有杂交分子具有A-DNA这种结构这种结构A-DNAB-DNATopviewTopviewZ-DNA:左手螺旋的双螺旋左手螺旋的双螺旋DNA，其糖，其糖-磷酸磷酸骨架呈骨架呈Z字形字形Z-DNAB-DNAB-formA-formZ-formhelicalsenseright-handright-handleft-handbp/turn101112大沟大沟宽，深宽，深窄，深窄，深平坦平坦小沟小沟窄，深窄，深宽，浅宽，浅窄，深窄，深sequence基因组基因组DNARNA-RNADNA-RNApoly(dG-dC)小结小结B-DNA是最常见的是最常见的DNA构象（构象（Watson-Crick双双螺旋螺旋DNA）；）；A-DNA构象对基因转录有重要意义；构象对基因转录有重要意义；Z-DNA可能与基因转录调控有关可能与基因转录调控有关（左手螺旋）（左手螺旋）五、十字形结构五、十字形结构由由反向重复（回文序列）反向重复（回文序列）DNA形成形成书书临临汉汉字字翰翰林林书书画画上上荷荷花花和和尚尚画画较长的回文结构较长的回文结构(单链），可形成单链），可形成茎环结构茎环结构(发夹结构发夹结构)较长的回文结构，可形成较长的回文结构，可形成十字形结构十字形结构六、三股螺旋六、三股螺旋DNA（TriplehelixDNA）1、类型：、类型：n分子内的分子内的DNA三螺旋结构（三螺旋结构（H-DNA）n分子间的三螺旋结构分子间的三螺旋结构n平行的三螺旋结构平行的三螺旋结构2、氢键、氢键n原来的双螺旋：原来的双螺旋：Watson-Crick氢键氢键n第三股链与双螺旋之一：第三股链与双螺旋之一：Hoogsteen氢键氢键Watson-Crick 配对 Hoogsteen 氢键ATGC3、意义：可能与基因表达调控有关、意义：可能与基因表达调控有关形成三股螺旋结构可阻止调控蛋白的结合，从形成三股螺旋结构可阻止调控蛋白的结合，从而关闭基因的表达而关闭基因的表达七、四链七、四链DNA端粒端粒DNA：G四链体结构四链体结构一、超螺旋一、超螺旋DNA（SuperhelixDNA）1、定义：DNA双螺旋自身盘绕而形成的空间结构双螺旋自身盘绕而形成的空间结构第四节第四节DNA的超螺旋结构的超螺旋结构2.功能：功能：（1）超螺旋）超螺旋DNA具有更为致密的结构，可以具有更为致密的结构，可以将很长的将很长的DNA分子压缩到染色体中分子压缩到染色体中（2）对）对DNA的稳定性具有十分重要的意义的稳定性具有十分重要的意义3.正超螺旋和负超螺旋正超螺旋和负超螺旋(1)负超螺旋（负超螺旋（negativesupercoil）盘绕方向与盘绕方向与DNA双螺旋方向相反双螺旋方向相反(2)正超正超螺旋（螺旋（positivesupercoil）:盘绕方向与盘绕方向与DNA双螺旋方同相同双螺旋方同相同负超螺旋负超螺旋正超螺旋正超螺旋4.超螺旋的定量描述超螺旋的定量描述White方程：方程：L=T+W（1）连结数（）连结数（linkingnumber,L）DNA闭环前两条链交叉的次数闭环前两条链交叉的次数（2）扭转数（）扭转数（twistingnumber,T）DNA分子中的分子中的Watson-Crick螺旋数目螺旋数目（3）超螺旋数（缠绕数）超螺旋数（缠绕数,writhingnumber,W）双螺旋双螺旋DNA自身盘绕的次数自身盘绕的次数负超螺旋负超螺旋正超螺旋正超螺旋双螺旋双螺旋DNA松开导致负超螺旋，而拧紧则导致正松开导致负超螺旋，而拧紧则导致正超螺旋超螺旋.天然天然DNA分子一般为分子一般为负超螺旋负超螺旋。Why?负超螺旋负超螺旋DNA更易于局部解链，易于更易于局部解链，易于参加参加DNA的复制、转录等的复制、转录等（4）比连接差（）比连接差（）：表示）：表示DNA的超螺旋程度的超螺旋程度=（L-L0）/L0大多数生物的超螺旋程度大约在大多数生物的超螺旋程度大约在-0.05左右左右二、二、拓扑异构体拓扑异构体（Topoisomers）具有不同连接数的相同具有不同连接数的相同DNA分子分子Bp:360;L:36;T:36;W:0Bp:360L:32;T:36;W:-4Topoisomerase三、三、拓扑异构酶拓扑异构酶（Topoisomerase）能够改变能够改变DNA连接数从而改变连接数从而改变DNA分子超螺分子超螺旋水平的酶旋水平的酶1、I型拓扑异构型拓扑异构酶酶:作用机制：切开作用机制：切开环环状一条状一条链链，连接数改变连接数改变1，不需不需ATP2、型拓扑异构型拓扑异构酶酶:作用机制：作用机制：切开切开环环状两条状两条链链，连接数改变，连接数改变2，需要，需要ATPTopoisomerase II3、细菌的、细菌的拓扑异构拓扑异构酶酶（1）旋转酶（）旋转酶（Gyrase-topoisomeraseII）：）：引入负超螺旋；引入负超螺旋；与复制有关与复制有关（2）拓扑异构拓扑异构酶酶I：松弛负超螺旋；松弛负超螺旋；与转录有关与转录有关第五节第五节真核生物的染色体及其组装真核生物的染色体及其组装一、染色体和染色质一、染色体和染色质1、染色质（、染色质（chromatin）指指间期间期细胞核内由细胞核内由DNA、组蛋白、非组蛋白组、组蛋白、非组蛋白组成的线性复合结构成的线性复合结构,是间期细胞遗传物质存在是间期细胞遗传物质存在的形式。的形式。2、染色体、染色体(chromosome):指细胞在有丝分裂或减数指细胞在有丝分裂或减数分裂过程分裂过程中中,由染色质由染色质聚缩而成的棒状结构。聚缩而成的棒状结构。3、二者关系、二者关系（1）染色质与染色体具有基本相同的化学组成，）染色质与染色体具有基本相同的化学组成，但包装程度不同，构象不同。但包装程度不同，构象不同。（2）染色质与染色体是在细胞周期不同的功能染色质与染色体是在细胞周期不同的功能阶段可以相互转变的的形态结构阶段可以相互转变的的形态结构4、形成染色体或染色质的意义、形成染色体或染色质的意义(1)压缩压缩DNA(2)提高稳定性提高稳定性(3)有助于细胞分裂有助于细胞分裂(4)有助于重组有助于重组二、真核生物的染色质二、真核生物的染色质1、Euchromatin（常染色质）（常染色质）间期细胞核中，螺旋化程度小、分散度大、浅染间期细胞核中，螺旋化程度小、分散度大、浅染的染色质的染色质特点：转录活跃特点：转录活跃2、Heterochromatin(异染色质）异染色质）间期高度压缩，螺旋化程度高、深染的染色质间期高度压缩，螺旋化程度高、深染的染色质特点：特点：A、高度浓缩、高度浓缩B、转录不活跃转录不活跃 C C、在细胞周期中表现为晚复制、在细胞周期中表现为晚复制(晚晚S S期期)、早凝缩、早凝缩（1）组成性异染色质（结构性异染色质）组成性异染色质（结构性异染色质）在整个细胞周期内都处于凝聚状态的染色质在整个细胞周期内都处于凝聚状态的染色质（主要为卫星（主要为卫星DNA，构成染色体特殊区域，构成染色体特殊区域，如着丝粒）如着丝粒）（2）功能性异染色质（兼性异染色质）功能性异染色质（兼性异染色质）指在某些特定的细胞中，或在一定的发育时期和生理指在某些特定的细胞中，或在一定的发育时期和生理条件下凝聚，由常染色质转变而来的异染色质条件下凝聚，由常染色质转变而来的异染色质如如X染色体，巴氏小体染色体，巴氏小体是真核生物基因表达调控的一种途径是真核生物基因表达调控的一种途径三、染色体的结构（三、染色体的结构（chromosomestructure）1、有丝分裂期的染色体、有丝分裂期的染色体2、Centromere（着丝粒）（着丝粒）指中期染色单体相互联系在一起的特殊部位指中期染色单体相互联系在一起的特殊部位,是纺锤体附着位点是纺锤体附着位点 （1 1）功能：保证有丝分裂和减数分裂中复制）功能：保证有丝分裂和减数分裂中复制 的染色体平均分配到两个子细胞的染色体平均分配到两个子细胞（2）着丝粒）着丝粒DNA：特点：含大量串联的重复序列特点：含大量串联的重复序列-卫星卫星DNA酵母着丝粒酵母着丝粒DNA：为单一序列：为单一序列(200bp)88bp富含富含AT序列序列+两侧保守区两侧保守区哺乳动物着丝粒哺乳动物着丝粒DNA：长序列长序列+大量的重复序列大量的重复序列3、Telomere（端粒）（端粒）是真核生物染色体末端的起保护作用的是真核生物染色体末端的起保护作用的一种一种特殊结构特殊结构（1）功能：保持染色体的稳定性）功能：保持染色体的稳定性（2）端粒）端粒DNA：特点：特点：A、短串联重复序列、短串联重复序列B、富含、富含GCC、形成特殊的二级结构、形成特殊的二级结构四、真核生物染色体和染色质的组成四、真核生物染色体和染色质的组成（一）（一）化学组成：化学组成：DNA/protein（蛋白质）（蛋白质）Non-histone非组蛋白非组蛋白Histone组蛋白组蛋白H2A/H2B/H3/H4/H1protein（二）组蛋白（二）组蛋白（Histones）核心组蛋白：核心组蛋白：H2A,H2B,H3和和H41、种类、种类非核心组蛋白：非核心组蛋白：H12、组蛋白的特点：、组蛋白的特点：（1）分子量小（核心组蛋白：）分子量小（核心组蛋白：10-20kDa；H1：约：约23kDa）（2）高度保守）高度保守（3）核心组蛋白都有一个保守的组蛋白折叠结构域）核心组蛋白都有一个保守的组蛋白折叠结构域（4）碱性蛋白）碱性蛋白（20-30%Lys/Arg），），带正电荷带正电荷（5）组蛋白肽链上氨基酸的分布具有不对称性）组蛋白肽链上氨基酸的分布具有不对称性 组蛋白组蛋白N端尾巴端尾巴（6）核心组蛋白的可进行组蛋白修饰）核心组蛋白的可进行组蛋白修饰n组蛋白乙酰化组蛋白乙酰化n组蛋白甲基化组蛋白甲基化n组蛋白磷酸化组蛋白磷酸化五、染色体的组装五、染色体的组装（一）核小体（一）核小体（Nucleosome）1、定义：、定义：由由200bp的的DNA和组蛋白组成的染色体和组蛋白组成的染色体的基本结构单位的基本结构单位2、核小体的组装、核小体的组装核小体核心核小体核心-Nucleosomecore组蛋白八聚体核心组蛋白八聚体核心-octamericcorehistone(H2A/H2B/H3/H42)146bpDNA(1.8turn,left-handed)TopviewSideviewNucleosomecore146bp,1.8turn染色体小体染色体小体Chromatosome166bp,2turnDNAHistoneoctamerHistoneH1H1+20bpDNA(stabilize)连接连接DNA-LinkerDNA(0100bp,55bp)LinkerDNA核小体核小体-Nucleosome核小体的形成核小体的形成DNA（146bp）+Histoneoctamer(组蛋白八聚体组蛋白八聚体)Nucleosomecore(核小体核心核小体核心)+H1+20bpDNAChromatosome(染色体小体染色体小体166bp)+linkerDNANucleosome(核小体核小体)(200bpofDNA)（二）（二）10nm纤丝纤丝“Beadsonastring”structure（三）（三）螺线管（螺线管（30nm纤丝）纤丝）螺线管（螺线管（Solenoid)v直径直径30nmvleft-handedv6个核小体个核小体/turn微带微带（miniband）是染色质高级结构的单位是染色质高级结构的单位（四）（四）微带微带（miniband）：螺线管结合到螺线管结合到核骨架核骨架/染色体骨架染色体骨架上形成上形成微带微带第六节第六节 RNA的结构和功能的结构和功能一、一级结构（一、一级结构（primarystructure）与与DNA区别：核糖区别：核糖；尿嘧啶；尿嘧啶；通常是单链通常是单链二、二级结构（二、二级结构（Secondarystructure）部分序列自身回折形成局部双螺旋部分序列自身回折形成局部双螺旋tRNArRNAG:U碱基配对碱基配对 hairpinbulgeloop假结（假结（Pseudoknots）四环（四环（Tetraloop）n端环能够形成稳定的、保守的发夹结构端环能够形成稳定的、保守的发夹结构n广泛分布于体内广泛分布于体内rRNA，催化，催化RNA和非编码和非编码RNA中中三、三级结构（三、三级结构（tertiarystructure）The crystal structure of a 23S rRNAtRNA三碱基对三碱基对四、四、RNA的功能的功能（1）储存遗传信息，如）储存遗传信息，如RNA病毒病毒（2）mRNA：进行遗传信息的传递，作为蛋白质合成的模板：进行遗传信息的传递，作为蛋白质合成的模板（3）rRNA：可装配成核糖体，参与蛋白质合成：可装配成核糖体，参与蛋白质合成（4）tRNA：携带氨基酸，参与蛋白质的合成：携带氨基酸，参与蛋白质的合成（5）核酶：内含子的自我剪接等）核酶：内含子的自我剪接等（6）MicroRNA：基因表达的调控，在发育过程中起作用：基因表达的调控，在发育过程中起作用（7）SiRNA：抑制病毒、转座子等外源基因的表达：抑制病毒、转座子等外源基因的表达（8）指导）指导RNA：参与：参与RNA的编辑的编辑（9）SnoRNA：可能与：可能与RNA的甲基化有关的甲基化有关（10）SnRNA：参与：参与RNA的加工（如剪接）的加工（如剪接）第七节第七节核酸的性质核酸的性质酸碱性质酸碱性质浮力密度浮力密度紫外吸收紫外吸收变性和复性变性和复性一、酸碱性质：一、酸碱性质：1、DNA等电点等电点44.5；2、RNA等电点等电点22.5；3、带负电荷带负电荷4、应用：、应用：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳电泳电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳由负极向正极移动由负极向正极移动 二、浮力密度二、浮力密度(buoyantdensity)应用应用：（1）密度梯度离心）密度梯度离心-DNA的纯化的纯化8MCsCl（RNADNAprotein)（2）确定）确定DNA平均平均GC含量含量=1.66+0.09%(G+C)蛋白质蛋白质染色体染色体/线形线形DNA超螺旋质粒超螺旋质粒RNACsCl+EB三、紫外吸收三、紫外吸收：DNA/RNA：max=260nmprotein：max=280nmA260：nucleotidesssDNA/RNAdsDNA应用：应用：(1)核酸的定量核酸的定量1mg/ml：A260=20（dsDNA）1mg/ml：A260=25（ssDNA/RNA）(2)DNA纯度的鉴定纯度的鉴定A260/A280=1.8，puredsDNAA260/A280=2.0，pureRNAA260/A2801.0，pureprotein（3）监控）监控DNA的变性和复性过程的变性和复性过程DNA的变性，紫外吸收增大（增色效应）的变性，紫外吸收增大（增色效应）DNA的复性，紫外吸收减小（减色效应）的复性，紫外吸收减小（减色效应）四、核酸的变性和复性四、核酸的变性和复性（一）（一）变性变性(Denaturation)：核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。不涉及共价键断裂。1、碱处理碱处理（alkali）DNA：酮：酮（keto）烯醇式烯醇式（enolate）变性变性2、化学试剂化学试剂尿素（尿素（Urea），），甲酰胺（甲酰胺（formamide）等）等高高PHketo formenolate formenolate formketo form应用应用:（1）Southern印迹中印迹中,在转膜前通常将凝胶中在转膜前通常将凝胶中的的DNA进行碱变性。进行碱变性。（2）测序胶：变性）测序胶：变性PAGE凝胶凝胶（+尿素）尿素）（3）Northern印迹中，上样前通常用甲醛印迹中，上样前通常用甲醛使使RNA变性变性3、热变性（、热变性（Thermaldenaturation）（1）熔解温度（熔解温度（Tm）：）：DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。的双螺旋结构失去一半时对应的温度。（2）影响）影响DNA的的Tm值的因素值的因素DNA均一性均一性均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性的均一性测定测定Tm，可推知，可推知G-C含量含量G-C%=（Tm-69.3)2.44Tm与（与（G+C）含量的关系）含量的关系G-C含量与含量与Tm值成正相关值成正相关介质中离子强度介质中离子强度离子强度高，离子强度高，Tm高高（二）复性（二）复性（Renaturation）变性变性DNA在适当（一般在适当（一般低于低于Tm20-25）条件下，）条件下，两条链重新缔合成双螺旋两条链重新缔合成双螺旋结构。结构。退火（退火（Annealing）1、影响复性的因素、影响复性的因素（1）温度温度。热变性。热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。快速冷却不能复性。（2）DNA片段长度片段长度。DNA片段越大，复性越慢；片段越大，复性越慢；（3）DNA浓度浓度。DNA浓度越大，复性越快。浓度越大，复性越快。2、应用、应用:PCR:引物与模板引物与模板DNA的结合的结合Southern和和Northern杂交、杂交、DNA芯片芯片第八节第八节研究核酸的常用方法研究核酸的常用方法一、核酸的分离纯化一、核酸的分离纯化1、DNA分离纯化分离纯化真真核核DNA以以核核蛋蛋白白（DNP）形形式式存存在在，DNP溶溶于于水水或或高高盐盐溶溶液液（1mol/LNaCl），但但不不溶溶于于低低盐盐溶溶液液（0.14mol/LNaCl），据据此此，采采用用高高盐盐提提取取，低低盐盐沉沉淀淀，可可将将DNP与与RNA核核蛋蛋白白分分开开，提取出提取出DNP。DNP可可用用苯苯酚酚抽抽提提，还还可可用用氯氯仿仿/异异戊戊醇醇去去除除蛋蛋白质。白质。水相中的水相中的DNA可被可被0.3MNaAC-乙醇沉淀乙醇沉淀2、RNA的制备的制备（1）RNase的灭活：的灭活：玻璃器皿：高温焙烤玻璃器皿：高温焙烤塑料器皿：塑料器皿：0.1%DEPC，37，过夜，过夜提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍反应体系中加特异的反应体系中加特异的RNase抑制剂抑制剂（2）常用方法：）常用方法：异硫氰酸胍异硫氰酸胍/苯酚苯酚/氯仿法氯仿法异硫氰酸胍异硫氰酸胍/氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法蛋白质：蛋白质：1.33g/ml；DNA：1.71g/ml左右；左右；RNA：1.89g/mlmRNA的制备：的制备：oligo(dT)纤维素亲合层析法纤维素亲合层析法3、质粒、质粒DNA的提取的提取碱裂解法（碱裂解法（alkalinelysis）原理：原理：根据环状质粒根据环状质粒DNA与染色体与染色体DNA的拓扑学差异的拓扑学差异pH值值=12.012.5：染色体：染色体DNA变性双链解开，变性双链解开，质粒质粒DNA的双链仍紧密结合的双链仍紧密结合pH值值=中中性性（加加入入pH4.8的的乙乙酸酸钾钾）：质质粒粒DNA准准确确复复性性，染染色色体体DNA缠缠绕绕成成网网状状结结构构，通通过过离离心心与与RNA、变变性性蛋蛋白白质质一一起起沉沉淀淀，被被除除去。去。菌细胞菌细胞1.悬浮细胞悬浮细胞2.溶菌酶处理溶菌酶处理3.SDS/NaOH4.醋酸钾中和醋酸钾中和培养液离心培养液离心质粒、质粒、RNA、蛋白质、蛋白质(部分部分)蛋白质、细菌染色体蛋白质、细菌染色体DNA、膜、膜接种、过夜培养接种、过夜培养（3-5mL）水相（质粒、水相（质粒、RNA）变性蛋白质变性蛋白质苯酚苯酚-氯仿氯仿水相水相RnaseA二倍体积乙醇二倍体积乙醇质粒质粒DNATE溶解溶解蛋白质蛋白质染色体染色体/线形线形DNA超螺旋质粒超螺旋质粒CsCl+EB二、核酸的超速离心二、核酸的超速离心1、测定核酸的浮力密度、测定核酸的浮力密度2、测定、测定DNA中中GC的含量的含量G-C含量与含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系的浮力密度之间呈正比关系3、溶液中核酸构象的研究、溶液中核酸构象的研究4、用于核酸的制备、用于核酸的制备三、核酸的凝胶电泳三、核酸的凝胶电泳1、琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳（1 1）原理：电荷效应和分子筛效应）原理：电荷效应和分子筛效应（2 2）DNA移动方向：负极移动方向：负极到正极到正极（3）影响迁移率的因素：）影响迁移率的因素：核酸分子的大小核酸分子的大小凝胶浓度凝胶浓度DNA的构象的构象:超螺旋超螺旋线形线形带缺刻的带缺刻的环形环形电压，不大于电压，不大于5V/cm（4）染色：溴化乙锭）染色：溴化乙锭-EB（0.5ug/ml）EB与与DNA结合后，经紫外光的照射，可发出结合后，经紫外光的照射，可发出橙红色的荧光橙红色的荧光（5）操作过程：）操作过程：a、制备琼脂糖凝胶（、制备琼脂糖凝胶（1TAE缓冲液）缓冲液）b、胶板的制备、胶板的制备c、加样、加样上样缓冲液上样缓冲液（含溴酚蓝）（含溴酚蓝）d、电泳、电泳5V/cme、染色、染色(溴化乙锭溴化乙锭)f、观察、观察(紫外灯紫外灯)2、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于分析和制备小于可用于分析和制备小于1 1Kb长度的长度的DNADNA片段片段多用垂直平板电泳多用垂直平板电泳分辨率高，可将仅相差分辨率高，可将仅相差1bp的的DNA分开分开制备和操作比琼脂糖凝胶困难制备和操作比琼脂糖凝胶困难四、核酸的分子杂交四、核酸的分子杂交（一）原理：（一）原理：复性复性探针：探针：一小段用同位素、生物素或荧光染料标记其末一小段用同位素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核酸结合，判断是否有同源的核酸膜上的核酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在分子存在（二）方法（二）方法1、Southern印迹（印迹（SouthernBlotting）（1 1）用途：用途：检测检测DNA（2）基本步骤：）基本步骤：DNA样样品品酶酶切切电电泳泳碱碱变变性性转转膜膜固定固定杂交杂交洗涤洗涤放射自显影放射自显影Southern印迹印迹实验实验放射自显影照片放射自显影照片（2）Northern印迹印迹（Northernblotting）基本过程：基本过程：1、RNA的提取；的提取；2、RNA变性电泳；变性电泳；3、RNA转膜和固定；转膜和固定；4、杂交；、杂交；5、检测、检测。Western-blot法法1）总蛋白质的提取）总蛋白质的提取2）SDS-PAGE分离蛋白质分子分离蛋白质分子3）转膜）转膜4）杂交（一抗、酶标二抗）杂交（一抗、酶标二抗）5）显色）显色Key points:二级结构多样性超螺旋结构真核生物的染色体及其组装核酸的性质研究核酸的常用方法Question 一、作业题：一、作业题：名词解释：名词解释：染色体、染色质、常染色质、异染色质、组成染色体、染色质、常染色质、异染色质、组成性异染色质、功能性异染色质、超螺旋、正超性异染色质、功能性异染色质、超螺旋、正超螺旋、负超螺旋、拓扑异构酶、拓扑异构体、螺旋、负超螺旋、拓扑异构酶、拓扑异构体、核小体、端粒、核小体、端粒、Z-DNA、核酸的变性、复性、核酸的变性、复性二、思考题：二、思考题：1、区分概念：、区分概念：常染色体与常染色质；核酸的变性与降解常染色体与常染色质；核酸的变性与降解;蛋白质变性与核酸变性蛋白质变性与核酸变性2、利用核酸的电负性、浮力密度、紫外吸收、利用核酸的电负性、浮力密度、紫外吸收、变性和复性的性质，可以做哪些分子生物学实变性和复性的性质，可以做哪些分子生物学实验？验？3、试从、试从DNA和和RNA结构的不同解释为什么结构的不同解释为什么DNA被广泛作为遗传信息的承载者？被广泛作为遗传信息的承载者？RNA在细胞内在细胞内行使哪些功能？行使哪些功能？