现代遗传学14遗传工程学.ppt
第十四章第十四章 遗传工程遗传工程 利用转基因手段对生物进行人为改造的技术什么是遗传工程？什么是遗传工程？体外DNA重组技术：利用工具酶将外源片段和载体连接，导入生物体并使其稳定复制和传代的技术目的目的l研究工作研究工作l生物产品生物产品(生物反应器生物反应器)l改良物种改良物种(提高品质提高品质)l基因治疗基因治疗工具酶工具酶A.剪切酶类有目的有选择的把目的片段切开B.连接酶类将目的片段和载体相连C.其他工具酶修饰,加工等作用限制性内切酶限制性内切酶IIII及其产生的及其产生的3 3种不同末端种不同末端5突出的粘性末端3突出的粘性末端平末端EcoRIEcoRVPstIPPPPPP同切酶和同粘酶同切酶和同粘酶同切酶:识别相同的位点,但生成不同的末端.同粘酶:识别不同的位点,但产生相同的粘性末端SmaI5.CCCGGG.33.GGGCCC.5XmaI5.CCCGGG.33.GGGCCC.5同切酶BamHI5.GGATCC.33.CCTAGG.5BglII5.AGATCT.33.TCTAGA.5同粘酶Sau3A5.GATC.33.CTAG.5连接酶及其对底物的要求:T4 Ligase,Ecoli Ligase底物:自由5末端和自由3末端,5末端带磷末端带磷酸基团酸基团反应条件：反应条件：Mg+，ATP存在存在聚合酶(polymerase):DNA聚合酶I,klenow片段,Taq,Pfu,末端转移酶外切核酸酶(exonuclease):exoIII,S1核酸酶,DNaseI脱磷酸酶(dephosphatase):碱性磷酸酯酶CIP磷酸化酶,激酶(kinase)逆转录酶(reversetranscriptase)RNaseH,RNaseA甲基化酶(methylase)其它工具酶载体及其构成基本要素载体及其构成基本要素l能独立复制并稳定传代能独立复制并稳定传代:复制起始点复制起始点ori或自主复制序列或自主复制序列ARS和着丝和着丝粒粒,端粒端粒l方便插入外源片段方便插入外源片段:单酶切位点单酶切位点l选择标记选择标记:药物抗性药物抗性l报告基因报告基因:插入筛选标记插入筛选标记l易分离提取易分离提取l高产率（多拷贝）高产率（多拷贝）l强启动子强启动子l多宿主多宿主常用载体常用载体质粒质粒(plasmid)，粘粒，粘粒(cosmid)，噬菌体，噬粒，噬菌体，噬粒(phagemid),病毒，病毒，PAC，YAC，BAC特殊用途的载体表达型载体，表达型载体，表达型载体，表达型载体，分泌型载体，穿梭载体分泌型载体，穿梭载体分泌型载体，穿梭载体分泌型载体，穿梭载体宿主繁殖快繁殖快,易于培养易于培养,能够快速得到产物能够快速得到产物对所携带基因的表达产物具有较高耐受性对所携带基因的表达产物具有较高耐受性,具有具有克隆最多种基因的可能克隆最多种基因的可能 突变率低突变率低,能够稳定忠实的保存被克隆基因能够稳定忠实的保存被克隆基因常用宿主大肠杆菌大肠杆菌:繁殖快繁殖快,易培养易培养,易分离产物易分离产物噬菌体噬菌体:转化效率高转化效率高,易于保存易于保存酵母酵母:繁殖最快的真核生物繁殖最快的真核生物,适于有蛋白质加工的基因适于有蛋白质加工的基因表达表达lacZ如何提高克隆效率如何提高克隆效率?提高插入片段和载体的比例尽可能采用粘端连接*载体脱磷以降低载体自连插入片段磷酸化改进转化条件问题:有一外源片段用某种酶切有一外源片段用某种酶切,生成了生成了5 突出粘性突出粘性末端末端 5-GATC,但是载体上的单酶切位点但是载体上的单酶切位点只能生成下面这几种粘性末端只能生成下面这几种粘性末端:5-CTAG 5-TCGA5-TTAA应当采用怎样的策略来提高连接效率应当采用怎样的策略来提高连接效率?不依赖于内切酶和连接酶的体外重组-位点专一性重组位点专一性重组（依赖于短片段同源序列的重组）cosN,LoxPLoxPLoxPcreLoxPLoxPTransform+report gene substrates新鲜组织研磨或匀浆新鲜组织研磨或匀浆RNA提取液总总RNA过oligo(dU)柱洗脱mRNAAAAAAAAATTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAArRNAtRNAmRNA筛选DNA文库用标记的核酸作为探针用标记的核酸作为探针用诱饵质粒筛选表达用诱饵质粒筛选表达cDNA文库文库探针标记标记物：标记物：同位素标记：同位素标记：32P非放射性标记：荧光标记，生物素，非放射性标记：荧光标记，生物素，dig(地高辛）等地高辛）等变性变性模板模板DNA随机随机6核苷酸引物，核苷酸引物，dNTP,某种标记某种标记dNTPDNA Pol I5随机引物随机引物标记的标记的DNA片段片段REMOVEREMOVEInsertedDNAcodingProteinfordetectionGAL4-ADlacZbaitDNAInsertedDNAcodingProteinfordetectionGAL4-ADlacZbaitDNABait DNABait DNAPCR技术及其应用应用范围：应用范围：l检测和诊断（高灵敏度）l基因克隆（eg:通过部分已知序列扩增未知目标片段其他常用分子生物学技术丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE）脉冲电泳双向电泳Southern杂交northern杂交western杂交转基因动植物和基因治疗转基因动植物和基因治疗转基因动物：医学研究，生物制药转基因动物：医学研究，生物制药转基因植物：改良品质，提高抗逆能力转基因植物：改良品质，提高抗逆能力基因治疗：治疗药物无法根治的遗传性疾病基因治疗：治疗药物无法根治的遗传性疾病5CAUG3mRNA3GUAC5AntisenseRNA
