04第三章 细胞生物学研究方法.ppt

第三章第三章细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第一节第一节细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法显微镜及其分辨力显微镜及其分辨力分辨力：一架显微镜或人眼在分辨力：一架显微镜或人眼在cm的明视距离处，能分辨被的明视距离处，能分辨被检物体细微结构最小间隔的能力。检物体细微结构最小间隔的能力。显微镜的分辨力：显微镜的分辨力：R=0.61/N.A.(其中，其中，N.A.=nsin)R为分辨力，为分辨力，N.A.为镜口率（为镜口率（n为介质的折射为介质的折射率，率，sin为透镜视锥半顶角的正弦），为透镜视锥半顶角的正弦），为波长。为波长。人眼分辨力为人眼分辨力为100m；光学显微镜最大分辨力约为光学显微镜最大分辨力约为.2m。显微结构（线粒体、中心。显微结构（线粒体、中心体、核仁等）和亚显微结构（内质网、核糖体微管等）；体、核仁等）和亚显微结构（内质网、核糖体微管等）；电子显微镜：采用电子波代替光波，分辨力可达电子显微镜：采用电子波代替光波，分辨力可达。1、普通复式光学显微镜技术、普通复式光学显微镜技术样品经固定剂处理，包埋切片，样品经固定剂处理，包埋切片，5um厚度，一般经厚度，一般经过染色，不同燃料对某种细胞亲和性或特异的吸附而形成过染色，不同燃料对某种细胞亲和性或特异的吸附而形成反差。反差。2.荧光显微镜技术荧光显微镜技术对对特特异异性性蛋蛋白白质质等等生生物物大大分分子子定定性性定定位位的的最最有有力力的的工工具。具。分为免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。分为免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。将可产生荧光的绿色荧光蛋白（将可产生荧光的绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）基因和某种蛋白质基因融合，在表达这）基因和某种蛋白质基因融合，在表达这种融合蛋白质的细胞中，便可直接观察到该蛋白的动态变种融合蛋白质的细胞中，便可直接观察到该蛋白的动态变化。化。一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术3、激光共焦点扫描显微镜技术、激光共焦点扫描显微镜技术激激光光共共焦焦点点扫扫描描显显微微镜镜（laser scanning confocalmicroscopy）的分辨率比普通荧光显微镜提高了）的分辨率比普通荧光显微镜提高了1.4-1.7倍。倍。所所谓谓共共聚聚焦焦，指指物物镜镜和和聚聚光光镜镜同同时时聚聚焦焦到到同同一一小小点点。可可以以观观察察到到比比较较厚厚的的样样品品的的内内部部结结构构。可可以以重重构构建建样样品品的的三维结构。三维结构。在研究亚细胞结构与组分等方面的应用越来越广在研究亚细胞结构与组分等方面的应用越来越广显微镜光学显微镜，最小分辨率1um。电子显微镜的最小分辨率0.1nm。透射电子显微镜和扫描电子显微镜不同显微镜下细胞激光共聚焦显微镜用激光共聚焦显微镜看到的各种细胞4、相差和微分干涉显微镜、相差和微分干涉显微镜在相差显微镜（在相差显微镜（phase-contrastmicroscopy）中，将这种光程差或相位差转变为振幅差。可以中，将这种光程差或相位差转变为振幅差。可以有不同程度的吸光作用，可以有不同程度的吸光作用，可以“夸大夸大”相位差，相位差，最后这两光束又会聚，形成干涉现象，从而表现最后这两光束又会聚，形成干涉现象，从而表现出肉眼可见的明暗区别。出肉眼可见的明暗区别。由于反差是以样品中的密度差为基础，故样由于反差是以样品中的密度差为基础，故样品不需染色。品不需染色。可以观察活细胞、细胞核、线粒体等细胞器的可以观察活细胞、细胞核、线粒体等细胞器的动态。动态。二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术由于波长的限制，其分辨率只能达到一定的限度。研究细胞内部的精细结构，就必须借助于分辨率更高的电子显微镜(electronmicroscope)。(一一)电子显微镜的一般知识电子显微镜的一般知识1.电子显微镜与光学显微镜的基本区别电子显微镜与光学显微镜的基本区别高高分分辨辨率率。用用电电磁磁透透镜镜聚聚焦焦，电电镜镜镜镜筒筒中中要要求求高高真空，图象需要荧光屏来显示或感光胶片作记录。真空，图象需要荧光屏来显示或感光胶片作记录。2.分辨本领与有效放大倍数分辨本领与有效放大倍数人眼分辨率人眼分辨率0.2mm，光镜分辨率，光镜分辨率0.2um，有效放，有效放大倍数大倍数0.2mm/0.2um，即，即1000倍，电镜分辨率伪倍，电镜分辨率伪0.2nm，放大，放大106倍。但电镜的实际分辨率受到生物样品本身倍。但电镜的实际分辨率受到生物样品本身的限制，分辨率约为的限制，分辨率约为5nm。3.电镜的基本构造电镜的基本构造电子束照明系统：电子枪、聚光镜电子束照明系统：电子枪、聚光镜成像系统：物镜、中间镜和投影镜成像系统：物镜、中间镜和投影镜真真空空系系统统：保保持持电电子子枪枪、镜镜筒筒、记记录录系系统统的的高真空高真空记录系统：成像通过荧光屏或感光胶片记录记录系统：成像通过荧光屏或感光胶片记录电镜可分为两大类电镜可分为两大类:透射电子显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜。扫描电子显微镜。光镜与电子显微镜(透射电镜)的结构（二）主要电镜样品制作技术（二）主要电镜样品制作技术样品要求：样品要求：样品很薄样品很薄100-200kv电压，电子透射能力电压，电子透射能力只有只有1um，只有使用超薄切片技术方可达到几十，只有使用超薄切片技术方可达到几十nm；一个直径为；一个直径为20um的细胞可切成几百片。的细胞可切成几百片。要求更好地保持样品的精细结构，样品的要求更好地保持样品的精细结构，样品的制备过程复杂：固定、脱水、包埋、切片和染色。制备过程复杂：固定、脱水、包埋、切片和染色。1.超薄切片技术超薄切片技术要要求求样样品品既既要要有有一一定定的的刚刚性性又又要要有有一一定定的的柔柔性性。生生物物样样品品并并不不具具备备这这样样的的特特性性。要要求求包包埋埋材材料。料。（1）固固定定保保持持样样品品的的真真实实性性，常常用用锇锇酸酸和和戊二醛。戊二醛。（2）包包埋埋使使样样品品中中各各种种细细微微结结构构在在切切片片过过程程中中得得到到均均匀匀良良好好的的支支撑撑，因因此此包包埋埋前前进进行行一一系系列的脱水。列的脱水。（3）切切片片切切片片厚厚度度通通常常为为40-50nm，再再用用载载网支撑。网支撑。（4）染色）染色锇酸易染脂肪，铅盐易染蛋白质，锇酸易染脂肪，铅盐易染蛋白质，醋酸铀易染核酸。只能染出黑白图象。醋酸铀易染核酸。只能染出黑白图象。电子显微镜样品的制备过程2.负染色技术负染色技术线粒体基粒、核糖体、蛋白质及其组成的纤维和病毒等可通过负染色（negativestaining）技术，其分辨率可达1.5nm左右。使用磷钨酸或醋酸双氧铀。负染色(negativestainning)一些生物大分子组成的结构，如病毒、线粒体基粒、核糖体和蛋白质组成的纤维等可以通过负染色电镜技术观察其精细结构，还可以从不同角度观察三维结构。烟草rattle病毒的负染色3.冷冻断裂或冷冻蚀刻技术冷冻断裂或冷冻蚀刻技术快速低温冷冻，在低温下进行断裂。在疏水键处断裂，使使膜脂中的蛋白颗粒露出。冷冻蚀刻（freeingetching）是专门观察样品外表面的投影复型术(图3-4)。冰冻断裂与冰冻蚀刻技术间接成像技术间接成像技术光学显微镜和电子显微镜是利用质子和电子使样品直接成像的技术，还有一些显微方法是间接成像。所谓间接成像，举一个例子，假定你拿起一个物体，非常靠近你的眼睛进行观察，你或许觉得该物体有六个平面、十二条边和八个角，然后将你感觉到的画出来，可能是一个盒子，这就是间接成像。下面讨论的是几种间接成像的方法，这些方法都具有原子级分辨力，它们的分辨率比最好的电子显微镜还高10倍。4.电子三维重构技术电子三维重构技术电子显微术、电子衍射与计算机图象处理结合的新技术。对生物样品的不同倾角进行一系列的拍照得到一系列的电镜图片，经变换处理后，展现出生物大分子及其复合三维结构的电子密度图。AB根据低温电镜图象和三维重构技术所显示的我国兔出血病毒的三维密度图A：为沿三次轴观察的密度图B：为病毒颗粒垂直于三次轴的中心切片，显示三维重构的密度分布5.扫扫 描描 电电 镜镜 技技 术术（scanningelectronmicroscope,SEM）其电子束会聚成探针，在样品表面进行扫描。可激发样品表面释放出二次电子（其多少与电子表面的形貌有关），具有强烈的立体感。扫描电子显微镜使用与透射电子显微镜完全不同的方式成像，即用电视的方式成像。扫描电子显微镜主要由电子光学系统和显示单元组成。扫描电子显微镜AB四膜虫的扫描电镜图象A：全虫；B：部分放大透射电子显微镜透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope，TEM)透射电子显微镜主要是让电子束穿透样片而成像。三三、扫扫描描隧隧道道显显微微镜镜（scanning tunnelingmicroscope,STM）直接观察DNA、RNA和蛋白质、生物膜、病毒的结构。DNA双螺旋结构的建立是根据X射线衍射结果推导出来的，至今还没有直接观察DNA结构的方法，所以对其中的微细结构还不够了解。用STM观察了DNA的双螺旋结构，见到DNA分子上的大沟(majorgroove)和小沟(minorgroove)，并且了解DNA的结构随染色体长度而异。扫描隧道显微镜观察的DNA双螺旋结构四、四、X-射线衍射技术射线衍射技术X-射线衍射(X-raydiffraction)第二节第二节细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法一、用超速离心技术分离细胞器和生物大分子及其复合物用低渗匀浆、超声破碎等破坏细胞壁，后用差速离心（differentialcentrifugation）和密度梯度离心法分离。分离技术是一大类技术的总称，包括细胞组分的分离和生物大分子的分离。（一）（一）离心分离技术离心分离技术离心分离细胞组分和生物分子是最常用的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度(图3-26)，可在不同离心力的作用下沉降分离。常用的两类离心分离方法是速度离心(velocitycentrifugation)和等密度离心(isodensitycentrifugation)。图3-26不同的细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数1.速度离心分离细胞器和大分子速度离心分离细胞器和大分子在速度离心分离中有两种不同的方法在速度离心分离中有两种不同的方法:(1)差速离心差速离心(differentialcentrifugation)(图图3-27)。(2)移动区带离心移动区带离心(moving-zonecentrifugation)(图图3-28)图3-27差速离心的原理常用的是蔗糖密度梯度离心(sucrosedensitygradientcentrifugation)。移动区带离心移动区带离心图3-28移动区带离心分离2.等密度离心等密度离心(isodensitycentrifugation)(图3-29)图3-29密度梯度离心分离溶酶体、线粒体和微体离心分离密度大于1.3g/cm3的样品，如DNA、RNA，需要使用密度比蔗糖和甘油大的介质。重金属盐氯化铯(CsCl)是目前使用的最好的离心介质，它在离心场中可自行调节形成浓度梯度，并能保持稳定(图3-30)。图3-30CsCl密度梯度离心分离DNA(二)层析分离技术(chromatography)层析是广泛使用的分离蛋白质的方法，它是根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等是目前最常用的层析方法。根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。各种不同的层析方法都涉及共同的基本特点:有一个固定相和流动相，当蛋白质混合溶液(流动相)通过装有珠状或基质材料的管或柱(固定相)时，由于混合物中各组份在物理化学性质(如吸引力、溶解度、分子的形状与大小、分子的电荷性与亲和力)等方面的差异使各组分在两相间进行反复多次的分配而得以分开。1.凝胶过滤层析(gelfiltrationchromatography)凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化(图3-31)。图3-31凝胶层析法2.亲和层析(affinitychromatography)在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法(图3-32)。图3-32亲和层析3.离子交换层析(ion-exchangechromatography)离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法(图3-33)。图3-33离子交换层析二二、细细胞胞内内核核酸酸、蛋蛋白白质质、酶酶、糖糖类类与与脂脂质质等的显示方法等的显示方法显色剂与特殊基团相结合，通过显色剂在细胞中的定位和颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。福尔根（Feulgen）反应可特异显示DNA的分布;酸水解后仅保留DNA，并脱嘌呤，暴露脱氧核糖的醛基，与Schiff试剂结合呈紫红色。PAS反应则检测多糖的存在。四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈黑色。蛋白质Millon反应中氮汞试剂与酪氨酸反应，形成红色沉淀等。检测酶时，采用冷冻技术或冷丙酮、甲醛进行短期固定，然后将样品与适宜的底物共温育，如Gomori方法。形成有色沉淀。苏丹III（深红）使脂滴着色，苏丹黑也溶于磷脂和胆固醇中。三、特异蛋白抗原的定位与定性三、特异蛋白抗原的定位与定性体 内：免 疫 荧 光(immunofluorescencetechnique)与免疫电镜技术体外：免疫印迹（westernblotting）和免疫放射沉淀（radioimmuno-precipitation）1.免疫荧光技术免疫荧光技术(immunofluorescencetechnique)将免疫学方法与荧光标记技术相结合用来研究特异抗原蛋白在细胞内的分布的方法。主要包括：荧光抗体的制备、标本的处理、免疫染色和观察记录等过程。特点：快速、灵敏、有特异性，但分辨率有限。2.免疫电镜技术免疫电镜技术免疫铁蛋白技术、免疫酶技术、免疫胶体金技术。四、细胞内特异核酸序列的定位与定性四、细胞内特异核酸序列的定位与定性采用原位杂交技术（采用原位杂交技术（insituhybridization）放射性标记技术、荧光素标记、胶体金标放射性标记技术、荧光素标记、胶体金标记、生物素标记等。记、生物素标记等。在显微与亚显微结构上的基因定位、特异在显微与亚显微结构上的基因定位、特异mRNA表达等研究中有用。表达等研究中有用。五五、利利用用放放射射性性标标记记技技术术研研究究生生物物大大分分子子在细胞内的合成动态在细胞内的合成动态放射性自显影技术是利用放射性同位素的放射性自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含电离辐射对乳胶（含AgBr或或AgCl）的感光作用，）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。对细胞内生物大分研究的一种细胞化学技术。对细胞内生物大分子进行动态研究和追踪（子进行动态研究和追踪（pulse-chase）是这一技）是这一技术的独具特性。术的独具特性。包括两个主要步骤：同位素标记的生物大包括两个主要步骤：同位素标记的生物大分子的掺入和细胞内同位素所在位置的显示。分子的掺入和细胞内同位素所在位置的显示。研究DNA合成时常用氚（3H）标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（3H-TdR）；研究RNA合成时常用氚标记的尿嘧啶核苷（3H-U）；研究含硫氨基酸代谢时，可用35S标记的蛋氨酸和半光氨酸，也可用3H和14C标记的蛋氨酸、亮氨酸等。同位素标记的前体物掺入细胞即标记。六、定量细胞化学分析技术六、定量细胞化学分析技术蛋蛋白白质质和和核核酸酸在在某某个个细细胞胞或或细细胞胞群群中中的的含含量分析对该物质的生物学功能十分重要。量分析对该物质的生物学功能十分重要。下面介绍两种细胞化学的定量分析方法。下面介绍两种细胞化学的定量分析方法。1.显微分光光度测定技术显微分光光度测定技术细细胞胞显显微微分分光光光光度度术术(microspectrophotometry）是是利利用用细细胞胞内内某某些些物物质质对对特特异异光光谱谱吸吸收收的的原原理理，用用来来测测定定这这些些物物质质(如如蛋蛋白白质质与与核核酸酸等等)在在每每一一个个细细胞胞内内的的含含量量的的一一种种实实验验技技术术，如如DNA对对紫紫外外线线的的最最高高吸吸收收波波长长位位260nm，也也可可通通过过特特异异的的染染色色反反应应，如如DNA通通过过特特异异Feulgen反反应后就可吸收波长为应后就可吸收波长为546nm的可见光波段。的可见光波段。分为紫外光显微分光光度测定法和可见光分为紫外光显微分光光度测定法和可见光显微分光光度法。显微分光光度法。显微分光光度测定技术显微分光光度测定技术:将显微镜技术与分将显微镜技术与分光光度计结合起来的技术。它光光度计结合起来的技术。它以物质分子的光以物质分子的光吸收、荧光发射和光反射特性吸收、荧光发射和光反射特性作为测定基础，作为测定基础，可用来分析生物样品细微结构中的化学成分，可用来分析生物样品细微结构中的化学成分，同时进行定位、定性和定量。同时进行定位、定性和定量。显微荧光光度术显微荧光光度术(microfluorometry)利用显微分光光度计利用显微分光光度计对细胞内原有能发光的对细胞内原有能发光的物质或对细胞内各种化学成分用不同的荧光经荧物质或对细胞内各种化学成分用不同的荧光经荧光探针标记后进行定位、定性和定量地测定光探针标记后进行定位、定性和定量地测定，称，称为显微荧光光度术，为显微荧光光度术，也称细胞荧光光度术也称细胞荧光光度术(cytofluorometry)。它是一种微观而灵敏的方法，对于研究细胞的它是一种微观而灵敏的方法，对于研究细胞的结构、功能及其变化具有重要意义。结构、功能及其变化具有重要意义。核磁共振技术核磁共振技术(nuclearmagneticresonance，NMR)核磁共振技术可以直接研究溶液和活细胞中核磁共振技术可以直接研究溶液和活细胞中小分子量小分子量(20，000道尔顿以下道尔顿以下)蛋白质、核酸以蛋白质、核酸以及其它分子的结构，及其它分子的结构，而不损伤细胞。而不损伤细胞。核磁共振的基本原理是核磁共振的基本原理是:原子核有自旋运动，原子核有自旋运动，在恒定的磁场中，在恒定的磁场中，自旋的原子核将绕外加磁场自旋的原子核将绕外加磁场作回旋转动，作回旋转动，叫叫进动进动(precession)。进动有一定。进动有一定的频率，的频率，它与所加磁场的强度成正比。如在此它与所加磁场的强度成正比。如在此基础上再加一个固定频率的电磁波，基础上再加一个固定频率的电磁波，并调节外并调节外加磁场的强度，加磁场的强度，使进动频率与电磁波频率相同。使进动频率与电磁波频率相同。这时原子核进动与电磁波产生共振，这时原子核进动与电磁波产生共振，叫叫核磁共核磁共振振。核磁共振时，核磁共振时，原子核吸收电磁波的能量，原子核吸收电磁波的能量，记录下的吸收曲线就是记录下的吸收曲线就是核磁共振谱核磁共振谱(NMR-spectrum)。由于不同分子中原子核的化学环。由于不同分子中原子核的化学环境不同，境不同，将会有不同的共振频率，将会有不同的共振频率，产生不同产生不同的的共振谱共振谱。记录这种波谱即可。记录这种波谱即可判断该原子在分判断该原子在分子中所处的位置及相对数目子中所处的位置及相对数目，用以进行定量用以进行定量分析及分子量的测定，分析及分子量的测定，并对有机化合物进行并对有机化合物进行结构分析结构分析。2.流式细胞仪流式细胞仪流式细胞仪（流式细胞仪（flowcytometry）可定量地测）可定量地测定某一细胞中定某一细胞中DNA、RNA或某一特异蛋白的含量，或某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞数量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞数量，特别是它还可将某一特异染色的细胞从数以万计特别是它还可将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，以及的细胞群体中分离出来，以及DNA含量不同的中含量不同的中期染色体分离出来，因此近年来应用越来越广。期染色体分离出来，因此近年来应用越来越广。细细胞胞群群体体一一般般需需要要分分散散后后多多待待测测的的某某种种成成分分进进行行特特定定的的染染色色，然然后后将将悬悬液液中中的的细细胞胞以以1个个/ms的的速速度度（1000万万个个/h）以以个个个个地地通通过过流流式式细细胞胞仪仪，此此时时检检测测器器便便可可以以测测出出并并记记录录每每个个细细胞胞中中待待测测物物质质的的含含量量，并并根根据据要要求求将将该该成成分分含含量量不不同同的的细细胞胞分分离离出出来来。如如果果染染色色过过程程不不影影响响细细胞胞活活性性，分分离离出来的细胞还可以继续培养。出来的细胞还可以继续培养。细胞分选技术细胞分选技术(cellsorting)细胞分选技术是细胞生物学研究中一个全细胞分选技术是细胞生物学研究中一个全新的技术领域，主要用流式细胞计新的技术领域，主要用流式细胞计(flowcytometer，FCM)对细胞对细胞(图图3-14)进行分选，进行分选，并进行定量分析。并进行定量分析。流式细胞计流式细胞计流式细胞计主要由以下几部分组成激光光源激光光源：可发出合适波长的光。流室流室(flowchamber):生物颗粒在此与鞘液(sheathfluid)相混。鞘液包裹着细胞的液滴经喷嘴(tip)流出，当液滴下流至适当位置，受激光照射可发射出不同的光讯号。讯号接受器讯号接受器(detector)由光学透镜装置和光电倍增管组成，接收放大各种光讯号，并把它们转变成电脉冲讯号。讯号分析部件讯号分析部件为微型电子计算机装置，对讯号作出分析。细胞分选细胞分选(cellsorting)图3-14流式细胞计分选细胞示意图流式细胞仪