蛋白质定量及脂蛋白电泳学生用.ppt

蛋白质定量及脂蛋白电泳学生用实验三 测定蛋白质的比色分析法实验目的实验目的1.掌握双缩脲法测定蛋白浓度的原理掌握双缩脲法测定蛋白浓度的原理;2.掌握掌握Lowry氏法测定蛋白浓度的原理氏法测定蛋白浓度的原理;3.学会使用分光光度计学会使用分光光度计;4.了解蛋白质定量的根本方法。了解蛋白质定量的根本方法。操作一操作一 Lowry氏法测定蛋白质含量氏法测定蛋白质含量u 实验原理实验原理u 操作步骤操作步骤u 计算方法计算方法u 试剂及器材试剂及器材Folin-酚试剂法酚试剂法Lowry法原理法原理u在在碱碱性性条条件件下下蛋蛋白白质质的的肽肽键键与与Cu2+螯螯合合，形形成成蛋蛋白白质质-铜复合物。双缩脲反响铜复合物。双缩脲反响u蛋蛋白白质质分分子子中中带带有有酚酚基基的的酪酪氨氨酸酸极极易易使使酚酚试试剂剂中中的的磷磷钼钼酸酸-磷磷钨钨酸酸复复原原，生生成成蓝蓝色色化化合合物物，蓝蓝色色深深浅浅与与蛋蛋白白质含量成正比。复原反响质含量成正比。复原反响u利利用用蓝蓝色色深深浅浅与与蛋蛋白白质质浓浓度度成成正正比比的的关关系系可可绘绘制制标标准准曲线，测定样品中蛋白质含量。曲线，测定样品中蛋白质含量。Folin-酚试剂法优缺点酚试剂法优缺点u优点优点:灵敏度高。灵敏度高。灵敏度比双缩脲法高灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范围为倍，定量范围为25250g蛋白蛋白质质u缺点缺点:干扰物质较多。干扰物质较多。u 1)对双缩脲反响发生干扰的离子对双缩脲反响发生干扰的离子;u 2)Folin 试剂显色反响由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸试剂显色反响由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸u 引起，因此样品中假设含有酚类、柠檬酸和巯基化合引起，因此样品中假设含有酚类、柠檬酸和巯基化合物物u 均有干扰作用。均有干扰作用。u 3)此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使u 显色强度稍有不同。显色强度稍有不同。Folin-酚试剂法测定蛋白质含量为什么比双缩脲法灵酚试剂法测定蛋白质含量为什么比双缩脲法灵敏敏?uFolin酚酚试剂试剂法最早是由法最早是由Lowry确定的确定的测测定蛋白定蛋白质浓质浓度的根本方法。度的根本方法。uFolin酚酚试剂试剂由甲由甲试剂试剂和乙和乙试剂组试剂组成。成。u 甲甲试剂试剂:碳酸碳酸钠钠，氢氢氧化氧化钠钠，硫酸，硫酸铜铜及酒石酸及酒石酸钾钠钾钠u 乙乙试剂试剂:磷磷钼钼酸、磷酸、磷钨钨酸、硫酸、溴酸、硫酸、溴u此法的此法的显显色原理与双色原理与双缩脲缩脲方法是一方法是一样样的，只是参加了第二种的，只是参加了第二种试剂试剂，即即Folin酚酚试剂试剂，以增加，以增加显显色量，从而提高了色量，从而提高了检测检测蛋白蛋白质质的灵敏度。的灵敏度。实 验 操 作试剂（ml）123456待测管标准蛋白液00.20.40.60.81.0待测蛋白液1.00.9%NaCl1.00.80.60.40.200碱性硫酸铜5.05.05.05.05.05.05.0取取7 7支试管，编号，按下表操作支试管，编号，按下表操作混匀，放置混匀，放置1010分钟。分钟。酚试剂0.50.50.50.50.50.50.5放置放置3030分钟后，以第分钟后，以第1 1管为空白管调节零点，然后测量管为空白管调节零点，然后测量各管各管750nm750nm波长的光密度。波长的光密度。标准曲线绘制标准曲线绘制u用坐标纸以用坐标纸以1-61-6管光密度值为纵坐标，各管加管光密度值为纵坐标，各管加0.9%0.9%NaClNaCl稀释后的蛋白质浓度为横坐标，绘成标准曲线。稀释后的蛋白质浓度为横坐标，绘成标准曲线。u根据待测溶液第根据待测溶液第7 7管的光密度值，从标准曲线管的光密度值，从标准曲线中查出其浓度。假设待测溶液已经稀释，可根据稀中查出其浓度。假设待测溶液已经稀释，可根据稀释倍数推算出其标准溶液的浓度。释倍数推算出其标准溶液的浓度。标准曲线法722分光光度计使用方法分光光度计使用方法该机的光谱范围在该机的光谱范围在360nm-800nm360nm-800nm。接通电源，翻开机器开关，使仪器通电，翻开箱盖，预热接通电源，翻开机器开关，使仪器通电，翻开箱盖，预热1010分钟。分钟。将空白液或对照液及测定液分别装入比色杯将空白液或对照液及测定液分别装入比色杯3/43/4体积并用软纸擦清外壁，体积并用软纸擦清外壁，放入样品室。放入样品室。调节电流计上零点调节器，使读数盘上指针的吸光度为调节电流计上零点调节器，使读数盘上指针的吸光度为A A或透光率为或透光率为0 0。调节测定所用波长。调节测定所用波长。盖上箱盖，光径开关自动翻开。转动光量调节器使空白或对照管的吸光盖上箱盖，光径开关自动翻开。转动光量调节器使空白或对照管的吸光 度为度为0 0，或透光率为，或透光率为100100，待读数指针稳定后，逐步拉出样品盒滑干，待读数指针稳定后，逐步拉出样品盒滑干，通过读数指针，读取测定管上的吸光度。有时需调节灵敏度开关，才能通过读数指针，读取测定管上的吸光度。有时需调节灵敏度开关，才能 正确读得吸光度。此时应重新转动零点调节器至吸光度为正确读得吸光度。此时应重新转动零点调节器至吸光度为A A。读数完毕，翻开仪器盖板，关闭开关，将比色杯冲洗干净。读数完毕，翻开仪器盖板，关闭开关，将比色杯冲洗干净。溶液定量测定时，应注意吸光度在溶液定量测定时，应注意吸光度在0.10.11.01.0范围，浓度太大时应适当稀范围，浓度太大时应适当稀 释。释。*本卷须知：本卷须知：1 1用手拿比色杯的磨砂面。用手拿比色杯的磨砂面。2 2液体的体积装满比色杯的液体的体积装满比色杯的3/43/4。3 3不要将比色杯放在分光光度计上。不要将比色杯放在分光光度计上。操作二操作二 双缩脲法测定血清总蛋白双缩脲法测定血清总蛋白u 双缩脲反响原理双缩脲反响原理u 实验步骤实验步骤u 计算方法计算方法u 所需试剂及器材所需试剂及器材原理原理实 验 操 作管别管别试剂试剂(ml)空白管空白管标准管标准管测定管测定管血血清清0.1蛋白标准液蛋白标准液1.00.9%0.9%氯化钠氯化钠2.01.01.9双缩脲试剂双缩脲试剂3.03.03.0摇匀后放入摇匀后放入37水浴中，水浴中，20分钟后分钟后540nm比色，以空白管调零点测得各管光密度。比色，以空白管调零点测得各管光密度。注意事项注意事项 1 1）须于显色后）须于显色后3030分钟内比色，分钟内比色，3030分钟后可有雾状沉淀。分钟后可有雾状沉淀。2 2）双缩脲反应并非蛋白质特有的颜色反应，凡有肽键的物质均干扰此反应。）双缩脲反应并非蛋白质特有的颜色反应，凡有肽键的物质均干扰此反应。3 3）避免硫酸铜过量、否则生成氢氧化铜，其蓝色将掩盖紫色影响测定结果。）避免硫酸铜过量、否则生成氢氧化铜，其蓝色将掩盖紫色影响测定结果。实验十二实验十二血清脂蛋白的琼脂糖凝胶电泳血清脂蛋白的琼脂糖凝胶电泳4 4、脂蛋白电泳的根本原理、脂蛋白电泳的根本原理 各各种种脂脂蛋蛋白白中中所所含含载载脂脂蛋蛋白白的的种种类类及及数数量量不不同同，各各种种脂脂蛋蛋白白颗颗粒粒大大小小、带带电电荷荷的的数数量量相相差差也也很很大大，因因此此以以琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶为为支支持持物物，在在电电场场中中可可使使各各种脂蛋白颗粒别离开来。种脂蛋白颗粒别离开来。实实 验验 操操 作作1、预染血清、预染血清 用微量移液器取血清用微量移液器取血清0.2ml，加苏丹，加苏丹黑染色液黑染色液0.02ml于小试管中，混合后置于小试管中，混合后置37水浴中染色水浴中染色30分钟，然后离心分钟，然后离心4000转分约转分约5分钟。分钟。2、制备琼脂糖凝胶板、制备琼脂糖凝胶板 将将0.5%琼脂糖凝胶于微波炉中加热琼脂糖凝胶于微波炉中加热融化。浇注到电泳槽内，静止待其凝固。融化。浇注到电泳槽内，静止待其凝固。实实 验验 操操 作作3、点加血清、点加血清 加样品时，用微量移液器枪吸取经预染过的血清加样品时，用微量移液器枪吸取经预染过的血清20微升微升(注意注意:不要吸取底部的染料颗粒不要吸取底部的染料颗粒)，注入凝胶板上的样品，注入凝胶板上的样品槽内。槽内。4、电泳、电泳 将加过血清的凝胶板平放于电泳槽中，样品放于阴极一将加过血清的凝胶板平放于电泳槽中，样品放于阴极一端。接通电源，稳流，电压端。接通电源，稳流，电压100V电流约电流约260-270MA，经电泳经电泳50分钟，即可见到别离的区带。分钟，即可见到别离的区带。5、观察并记录电泳结果、观察并记录电泳结果 CM 前前 血浆脂蛋白的电泳图谱正常参考值百分比：-脂蛋白 25.74.1%前-脂蛋白21.04.4%-脂蛋白 53.35.3%